Name: Métodos para probar la interrupción endocrina en Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprende métodos para evaluar la interrupción endocrina en Drosophila melanogaster, analizando fecundidad, fertilidad, tiempo de desarrollo y longevidad. Este protocolo permite estudiar efectos tóxicos in vivo de manera rápida y económica.

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Los autores agradecen a Orsolina Petillo por su apoyo técnico. Los autores agradecen a la Dra. Mariarosaria Aletta (CNR) su apoyo bibliográfico. Los autores agradecen al Dr. Gustavo Damiano Mita por presentarlos al mundo de la EDC. Los autores agradecen a Leica Microsystems y Pasquale Romano por su ayuda. Esta investigación fue apoyada por el Proyecto PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Compromiso: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Proyecto PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

Los autores no tienen nada que revelar.

La mosca de la fruta D. melanogaster ha sido ampliamente empleada como un sistema modelo in vivo para investigar los efectos potenciales de los EDC ambientales como DBP28,BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33y EE234. Varias razones han llevado a su uso como modelo en este campo de investigación. Aparte de sus ventajas indiscut...

Las actividades humanas han estado liberando al medio ambiente una enorme cantidad de productos químicos, que representan un grave problema para los organismos y para los ecosistemas naturales1. De estos contaminantes, se estima que unos 1.000 productos químicos diferentes pueden alterar el equilibrio normal de los sistemas endocrinos; según esta propiedad, se clasifican como sustancias químicas disruptoras endocrinas (EDC). Específicamente, sobre la base de una definición reciente de la Sociedad Endocrina, las EDC son "un químico exógeno, o mezcla de productos químicos, que puede interferir con cualquier aspecto de la acción hormonal"2. En las últimas tres décadas, ha habido cada vez más evidencia científica de que las EDC pueden afectar a la reproducción y desarrollo de animales y plantas3,4,5,6,7, 8. Además, la exposición a la EDC se ha relacionado con la creciente prevalencia de algunas enfermedades humanas, incluyendo cáncer, obesidad, diabetes, enfermedades tiroideas, y trastornos del comportamiento9,10,11.
Mecanismos generales de la EDC
Debido a sus propiedades moleculares, los EDC se comportan como hormonas o precursores hormonales3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. En este sentido, pueden unirse al receptor de una hormona y interrumpir los sistemas endocrinos ya sea imitando la actividad hormonal o bloqueando la unión de hormonas endógenas. En el primer caso, después de la unión al receptor, pueden activarlo como su hormona natural haría. En el otro caso, la unión de la EDC al receptor impide la unión de su hormona natural, por lo que el receptor está bloqueado y ya no se puede activar, incluso en presencia de su hormona natural3. Como consecuencia, los EDC pueden afectar a varios procesos, como la síntesis, secreción, transporte, metabolismo o acción periférica de hormonas endógenas que son responsables del mantenimiento de la homeostasis, reproducción, desarrollo y/o comportamiento de el organismo. La unión del receptor no es la única forma de acción descrita hasta ahora para las EDC. Ahora está claro que también pueden actuar reclutando coactivadores o corepresores en vías enzimáticas o modificando marcadores epigenéticos que desreguladoran la expresión génica10,11,12,13 ,14, con consecuencias no sólo para la generación actual, sino también para la salud de las generaciones venideros8.
Hormonas drosofílicas
Los efectos potenciales de las EDC seleccionadas se han estudiado ampliamente, tanto en especies de vida silvestre como en varios sistemas de modelos en los que los mecanismos endocrinos son razonablemente bien conocidos. En el caso de los invertebrados, los sistemas endocrinos que influyen en el crecimiento, el desarrollo y la reproducción se han caracterizado ampliamente en insectos por varias razones, lo que implica su uso extensivo en el campo de la investigación biológica, su importancia económica y finalmente el desarrollo de insecticidas capaces de interferir específicamente con el sistema hormonal de los insectos de plagas.
En particular, entre los insectos, la mosca de la fruta D. melanogaster ha demostrado ser un sistema modelo muy potente para evaluar los posibles efectos endocrinos de las EDC. En D. melanogaster, así como en los vertebrados, las hormonas juegan un papel importante a lo largo de todo el ciclo de vida. En este organismo, hay tres sistemas hormonales principales, que involucran la hormona esteroide 20-hidroxiediseano (20E)15,16, la hormona juvenil sesquiterpenoides (JH)17, y los neuropéptidos y péptidos /proteínas hormonas18. Este tercer grupo consta de varios péptidos descubiertos más recientemente pero claramente involucrados en una gran variedad de procesos fisiológicos y conductuales, tales como longevidad, homeostasis, metabolismo, reproducción, memoria, y control locomotor. 20E es homólogo a las hormonas esteroides derivadas del colesterol como el estradiol, mientras que la JH comparte algunas similitudes con el ácido retinoico; ambos son las hormonas más conocidas en Drosophila19,20. Su equilibrio es vital en la coordinación de la muda y la metamorfosis, así como en el control de varios procesos de postdesarrollo, como la reproducción, la vida útil y el comportamiento21,ofreciendo así diferentes posibilidades para probar endocrinos disrupción en Drosophila. Además, las hormonas ecdysteroid y los JH son los principales objetivos de los llamados insecticidas de tercera generación, desarrollados para interferir con los procesos mediados endocrinos en el desarrollo y la reproducción en los insectos. El modo agonista o antagonista de acción de estos productos químicos es bien conocido, y por lo tanto pueden servir como normas de referencia para evaluar los efectos de los posibles EDC en el crecimiento, reproducción y desarrollo de insectos22. Por ejemplo, el metopreno, que ha sido ampliamente utilizado en el control de mosquitos y otros insectos acuáticos23,24, funciona como un agonista JH y reprime la transcripción genética inducida por 20E y la metamorfosis.
Además de las hormonas, la superfamilia del receptor nuclear (NR) en Drosophila también es bien conocida; consiste en 18 factores de transcripción evolutivamente conservados involucrados en el control de las vías de desarrollo dependientes de las hormonas, así como la reproducción y fisiología25. Estas hormonas NR pertenecen a los seis subtipos de superfamilia NR, incluidos los involucrados en la neurotransmisión26,dos para los NR de ácido retinoico, y los de los NR esteroides que, en los vertebrados, representan uno de los objetivos principales de los EDC27.
Drosophila como sistema modelo para el estudio de las EDC
Actualmente, sobre la base de propiedades moleculares, varias agencias ambientales de todo el mundo están atribuyendo el potencial de interferir con los sistemas endocrinos a diferentes productos químicos artificiales. Dado que las EDC son un problema global y omnipresente para el medio ambiente y para los organismos, el objetivo general de la investigación en este campo es reducir su carga de morbilidad, así como proteger a los organismos vivos de sus efectos adversos. Con el fin de profundizar la comprensión sobre los posibles efectos endocrinos de un producto químico, es necesario probarlo in vivo. Con este fin, D. melanogaster representa un sistema de modelos válido. Hasta la fecha, la mosca de la fruta se ha utilizado ampliamente como modelo in vivo para evaluar los efectos de varias EDC ambientales; se ha informado de que la exposición a varios EDC, como el dibutilo ftalato (DBP)28,el bisfenol A (BPA), el 4-nonilfenol (4-NP), el 4-tert-octilfenol (4-tert-OP)29, el metilparabeno (MP)30, el etilparabeno (EP)31, 32, bis-(2-etilhexilo) ftalato (DEHP)33y 17-o-etinilestradiol (EE2)34, influye en el metabolismo y las funciones endocrinas como en los modelos de vertebrados. Varias razones han llevado a su uso como modelo en este campo de investigación. Más allá de un excelente conocimiento de sus sistemas endocrinos, otras ventajas incluyen su corto ciclo de vida, bajo costo, genoma fácilmente manipulable, una larga historia de investigación, y varias posibilidades técnicas (ver el sitio web de FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster también proporciona un modelo potente para estudiar fácilmente los efectos transgeneracionales y las respuestas de la población a los factores ambientales8 y evita cuestiones éticas relevantes para los estudios in vivo en animales superiores. Además, la mosca de la fruta comparte un alto grado de conservación de genes con los seres humanos que podría hacer posible que los ensayos de Drosophila EDC ayuden a predecir o sugerir los efectos potenciales de estos productos químicos para la salud humana. Además de ampliar la comprensión sobre los efectos en la salud humana, Drosophila puede ayudar a evaluar los riesgos de exposición de la EDC al medio ambiente, como la pérdida de biodiversidad y la degradación del medio ambiente. Por último, la mosca de la fruta ofrece la ventaja adicional de ser utilizada en laboratorios, donde los factores que pueden afectar a su desarrollo, reproducción y vida útil pueden mantenerse bajo control con el fin de atribuir cualquier variación a la sustancia a probar.
Con esto en mente, hemos optimizado ensayos de fitness simples y robustos para determinar los efectos de la EDC en algunos rasgos hormonales de Drosophila, como la fecundidad/fertilidad, el tiempo de desarrollo y la vida útil de los adultos. Estos ensayos han sido ampliamente utilizados para algunos EDCs23,24,25,26,27. En particular, hemos utilizado los siguientes protocolos para evaluar los efectos de la exposición al estrógeno sintético EE234 y al BPA y al bisfenol AF (BPA F) (datos no publicados). Estos protocolos pueden modificarse fácilmente para investigar los efectos de una EDC dada a la vez, así como los efectos combinados de múltiples EDC en D. melanogaster.

<table><tbody><tr><td>17&alpha;-Etinilestradiol</td><td>Sigma</td><td>E4876-1G</td><td></td></tr><tr><td>Agar para medio Drosophila</td><td>BIOSIGMA</td><td>789148</td><td></td></tr><tr><td>Bisfenol A</td><td>Sigma</td><td>239658-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bisfenol AF</td><td>Sigma</td><td>90477-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Harina de maíz</td><td>CA' BIANCA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Viales</td><td>BIOSIGMA 789008</td><td></td><td>25 mm x 95 mm</td></tr><tr><td>Drosophila Viales</td><td>BIOSIGMA</td><td></td><td>789009 29 mm x 95 mm</td></tr><tr><td>Drosophila Vials Kaltek</td><td></td><td>187</td><td>22 mm x 63 mm</td></tr><tr><td>Jaula de recolección de embriones</td><td>Artesanía</td><td></td><td>Cilindro de plexiglás (12,5 mm x7 cm) con un extremo abierto y el otro extremo cerrado por una base rectangular en la que una ranura permite la inserción de Bandejas especiales para la colocación</td></tr><tr><td>de etanol</td><td>FLUKA</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Etherizer</td><td>Crafts</td><td></td><td>Recipiente de vidrio cilíndrico con tapón de algodón</td></tr><tr><td>Botella</td><td></td><td></td> de vidrio <td>Botellas de 250 mL</td></tr><tr><td>Viales de vidrio</td><td>Microtech</td><td>ST 10024</td><td>Tubo de fondo plano 100 x 24</td></tr><tr><td>Batidora de mano Pimmy</td><td>Ariete</td><td></td><td>Robot de cocina</td></tr><tr><td>Instant Levadura de éxito</td><td>ESKA</td><td></td><td>Levadura en polvo</td></tr><tr><td>Bandeja de colocación</td><td>Bandejas</td><td></td><td>de plexiglás artesanales (11 cm x 2,6 cm) en las que verter medio para la colocación</td></tr><tr><td>Hidroxibenzoato de metilo</td><td>SIGMA</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Falcon</td><td></td><td>351016 60x5</td></tr><tr><td>Tinte rojo n.º 40</td><td>SIGMA</td><td>16035</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico con luces LED</td><td>Leica</td><td></td><td>S4E</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>HIMEDIA</td><td>MB025</td><td></td></tr><tr><td>Salsa de tomate</td><td>Cirio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para probar la interrupción endocrina en drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

En los últimos años ha habido creciente evidencia de que todos los organismos y el medio ambiente están expuestos a productos químicos similares a las hormonas, conocidos como productos químicos disruptores endocrinos (EDC). Estos productos químicos pueden alterar el equilibrio normal de los sistemas endocrinos y conducir a efectos adversos, así como un número creciente de trastornos hormonales en la población humana o crecimiento perturbado y reproducción reducida en las especies de vida silvestre. Para algunas EDCs, hay efectos documentados para la salud y restricciones en su uso. Sin embargo, para la mayoría de ellos, todavía no hay evidencia científica en este sentido. Con el fin de verificar los posibles efectos endocrinos de un producto químico en todo el organismo, necesitamos probarlo en sistemas modelo adecuados, así como en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Aquí informamos protocolos in vivo detallados para estudiar la interrupción endocrina en Drosophila, abordando los efectos de la EDC en la fecundidad/fertilidad, tiempo de desarrollo y vida útil de la mosca. En los últimos años, utilizamos estos rasgos de vida Drosophila para investigar los efectos de la exposición a 17-o-etinilestradiol (EE2), bisfenol A (BPA), y bisfenol AF (BPA F). En conjunto, estos ensayos cubrieron todas las etapas de la vida de Drosophila y hicieron posible evaluar la interrupción endocrina en todos los procesos mediados por hormonas. Los ensayos de fecundidad/fertilidad y tiempo de desarrollo fueron útiles para medir el impacto de la EDC en el rendimiento reproductivo de la mosca y en las etapas del desarrollo, respectivamente. Por último, el ensayo de vida útil implicó exposiciones crónicas de la EDC a adultos y midió su supervivencia. Sin embargo, estos rasgos de vida también pueden ser influenciados por varios factores experimentales que tuvieron que ser cuidadosamente controlados. Por lo tanto, en este trabajo, sugerimos una serie de procedimientos que hemos optimizado para el resultado correcto de estos ensayos. Estos métodos permiten a los científicos establecer la interrupción endocrina para cualquier EDC o para una mezcla de diferentes EDC en Drosophila, aunque para identificar el mecanismo endocrino responsable del efecto, podrían ser necesarios ensayos adicionales.

En esta sección, los pasos clave de los protocolos anteriores se notifican en forma de esquemas simplificados. Dado que las moscas tienden a evitar compuestos desagradables, lo primero que hay que hacer es probar el sabor de la EDC seleccionada. Esto se puede hacer mezclando un colorante alimentario (por ejemplo, tinte de alimentos rojos no 40)35 con el alimento complementado con la EDC seleccionada en varias dosis o solo con el disolvente. Las moscas alimentadas en estos medios se examinan bajo u...

Los productos químicos disruptores endocrinos (EDC) representan un problema grave para los organismos y para los entornos naturales. Drosophila melanogaster representa un modelo ideal para estudiar los efectos de la EDC in vivo. Aquí, presentamos métodos para investigar la interrupción endocrina en Drosophila, abordando los efectos de la EDC sobre la fecundidad, fertilidad, tiempo de desarrollo, y la vida útil de la mosca.

Métodos para probar la interrupción endocrina en Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster es un potente modelo para evaluar in vivo los posibles efectos tóxicos y endocrinos de los productos químicos, como los disruptores endocrinos, que representan un grave problema para la salud humana y los entornos naturales. Abordar el efecto de los EDC en los rasgos hormonales de la vida de la mosca, como la fecundidad, la fertilidad, el tiempo de desarrollo y la vida útil. Es una manera fácil, barata y rápida de investigar la interrupción endocrina in vivo.La fertilidad, el desarrollo y la vida útil de Drosophila pueden verse afectados por varios factores que deben controlarse cuidadosamente para garantizar el resultado exitoso de este protocolo. Por lo tanto, se requiere la máxima atención en la cría y manipulación de moscas. Para ensayar el sabor de la EDC seleccionada, después de la anestesia, transfiera 15 moscas jóvenes del lecho de mosca a cuatro viales paralelos que contengan un medio de harina de maíz mezclado con un colorante alimentario.El vial de control contiene el disolvente solo, y los otros tres viales se complementan con diferentes dosis de los EDC seleccionados. Conservar los viales en una incubadora humidificada durante un día con una luz natural de 12 horas. Después de anestesiar las moscas de nuevo, transfiera las moscas inmovilizadas a un papel blanco, y colóquelo bajo un microscopio estéreo para observar.Compare la coloración abdominal de cada grupo de tratamiento con respecto al grupo de control. Para ensayar el rendimiento reproductivo de las moscas, prepare tres viales de moscas para cada EDC como viales parentales, con ocho hembras y cuatro machos en 10 mililitros de medio de harina de maíz complementados con EE2. Para el control, preparar seis viales de moscas, cada uno con ocho hembras y cuatro machos en 10 mililitros de alimentos medianos de harina de maíz complementados con disolvente EE2.Vuela en una incubadora a 25 grados centígrados. Durante su desarrollo, evite el hacinamiento de las larvas. Después de cuatro días, invierta cada vial sobre un etherizer para retirar a los padres y devolver los viales a la incubadora durante cinco días más.A última hora de la tarde del día nueve, invierta cada vial sobre un etherizer para eliminar todas las moscas recién emergidas de los viales y coloque los viales en otra incubadora a 18 grados centígrados durante la noche. En la mañana del día 10, en una estación de trabajo de dióxido de carbono Drosophila, invierta cuidadosamente el vial de cultivo para evitar que las moscas anestesiadas caigan en el medio e inserte un tubo de goma con una aguja en el vial entre el tapón de algodón y la pared del vial. Abra la válvula para suministrar dióxido de carbono.En cuestión de segundos, transfiera las moscas a un lecho de mosca bajo un microscopio. Recoger hembras vírgenes y machos jóvenes por separado en dos grupos en la cama de la mosca. Subdividir aleatoriamente cada grupo de moscas en pequeños subgrupos, con 10 hembras o 20 machos por vial llenos de medio de harina de maíz fresco correspondiente.Continuar la incubación y recoger 30 hembras vírgenes y 30 machos por cada EDC, y 90 hembras vírgenes y 90 machos para el control. Alberga a estos grupos de moscas a 25 grados centígrados hasta que tengan cuatro días de edad después de la eclosión. A continuación, transfiéralos a viales nuevos que contengan el medio fresco correspondiente cada dos días.Compruebe que no hay larvas en los viales de las hembras. A continuación, etiquete los viales con una serie diferente de números secuenciales para el siguiente tratamiento. Después de la anestesia, transfiera una hembra tratada con disolvente EE2 a un pequeño vial que contenga un medio de tomate de harina de maíz fresco sin EE2 y agregue un macho tratado con disolvente EE2 para el control.Emparejar a un macho tratado con EE2 con una hembra tratada con disolvente EE2 o una hembra tratada con EE2 con un macho tratado con disolvente EE2 para cada tratamiento. Casa 20 cruces individuales a 25 grados centígrados. Transfiera cada par de apareamiento a viales medianos de tomate de harina de maíz fresco sin EDC todos los días durante los siguientes 10 días.Inspeccione visualmente cada vial todos los días en busca de los óvulos e informe su número en la hoja de cálculo de fertilidad. En cada vial, compruebe atentamente si hay moscas recién emergidas y registre el número diario de progenies adultas durante el período de 10 días. Después de 10 días desde el apareamiento inicial, retire a los padres de la última serie de viales.En los protocolos de ensayo de eclosión, en primer lugar, para cada grupo de tratamiento, se establecen 10 viales de moscas jóvenes y sanas de menos de dos días de edad, cada una con seis hembras y tres machos en 10 mililitros de alimentos de harina de maíz sin EDC. Trasera las moscas en la comida durante 24 horas y deja que se aparees. A continuación, prepare otros 10 viales paralelos por grupo de tratamiento con 10 mililitros cada uno de alimentos frescos de harina de maíz complementados con diferentes concentraciones de EDC o el disolvente EE2 solo para el control.Transfiera las moscas apareadas a estos nuevos viales. Haga una hoja de cálculo de desarrollo para grabar las diferentes series. Deje que las moscas pongan huevos durante 16 horas.Luego, retire a los padres de los viales. Incubar los viales a 25 grados centígrados durante tres a cuatro días, o hasta que las larvas errantes sean visibles. Cada día, cuente el número de pupas nuevas en cada vial escribiendo un número en secuencia por cada pupa en el exterior del vial para evitar contar la misma pupa dos veces.Informar del número de pupas recién surgidas durante tres a cuatro días, o hasta que no se forme más pupas. A partir del día nueve, cuente el número de adultos emergentes diariamente, hasta que no surjan más adultos. Informar sobre la hoja de cálculo del desarrollo y realizar el resto del ensayo de eclosión de acuerdo con el manuscrito.En el protocolo de vida útil, primero se instalaron 20 viales con ocho hembras y cuatro machos, cada uno lleno de 10 mililitros de alimentos de harina de maíz y los albergan a 25 grados centígrados. Después de cuatro días, deseche las moscas y vuelva a colocar los viales en la incubadora. A última hora de la tarde del día nueve, retire todas las moscas recién emergidas de los viales y devuelva los viales a la incubadora.Después de 16 a 24 horas, divida 250 moscas adultas de un día de edad de ambos sexos en cuatro grupos bajo anestesia de dióxido de carbono ligero y transfieralas a botellas de 250 mililitros que contengan alimentos medianos para adultos, tres complementados con diferentes concentraciones de EDC y uno con el disolvente EE2 solo. Mantenga las moscas a 25 grados centígrados durante dos o tres días para permitir que se aparecen. Luego, ordene cada cohorte de moscas por sexo en dos grupos.Dentro de cada condición de tratamiento, para ambos sexos, subdividir aleatoriamente cada grupo en cinco viales paralelos a una densidad de 20 individuos por vial. Prepare una hoja de cálculo de vida útil en la que el número de moscas muertas se resta del número de moscas supervivientes de la transferencia anterior, de modo que el número de supervivientes en cada transferencia se obtenga automáticamente. Después de tres días, transfiera las moscas sin anestesia a nuevos viales que contengan los alimentos correspondientes al mismo tiempo y compruebe la muerte.Registre la edad de las moscas y el número de moscas muertas. Repita la transferencia cada tres días hasta que todas las moscas mueran. En este experimento, las curvas de vida útil se trazaron como la supervivencia acumulativa frente a los días transcurridos para cada concentración de la EDC y el control.Para el control, después de un largo período inicial en el que la curva de supervivencia se mantuvo relativamente alta, disminuyó exponencialmente después de unos 60 días. Después de la exposición de la EDC, la curva de supervivencia de las moscas tratadas se vio afectada significativamente y mostró una disminución dramática después de 36 días. Se aconseja acerca de que los viales paralelos en análisis deben ser muy similares, de lo contrario será difícil entender cuál desechar.Por lo tanto, sugerimos tener mucho cuidado, adoptando una buena práctica experimental, utilizando un gran tamaño de muestra. Siguiendo estos protocolos, también es posible evaluar el impacto transgeneracional de un disruptor endocrino seleccionado, así como probar los posibles efectos aditivos de una combinación de diferentes disruptores endocrinos.

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