Name: Un modelo de ratón con deficiencia de estrógeno In Vivo para la detección de tratamientos de estrógeno exógeno sorgénicos de la disfunción cardiovascular después de la menopausia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprende a realizar ovariectomía bilateral en ratones apoE -/- para estudiar disfunción cardiovascular postmenopáusica. Este modelo permite evaluar tratamientos de estrógeno exógeno con técnicas quirúrgicas refinadas que minimizan complicaciones.

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Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (81202526 a J.X.), la National Natural Science Foundation of China (81302769 a B.S.), la Beijing Municipal Natural Science Foundation (47144226 a B.S.), la China Postdoctoral Science Foundation (20110490325 a J.X.), y la Fundación de Programas de Doctorado del Ministerio de Educación de China (20121106120031 a B.S.).

Todos los protocolos experimentales y de cuidado de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Academia China de Ciencias Médicas y el Colegio Médico de la Unión de Pekín (No permiso: SYXK (Pekín) 2013-0023). El origen de los ratones apoE-/- es C57BL/6J9,10.
1. Ovariectomía bilateral a través de una doble incisión dorsal-lateral en apoE-/- Ratones
<ol><li>Al destete (edad 28 días), anestetizar hembra apoE-/- C57BL/6J ratones con avertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente). NOTA: 32 ratones apoE-/- se dividieron aleatoriamente en 4 grupos: SHAM, OVX, OVX/E2 y oVX/PPD (n.o 8 por grupo).</li>
	<li>Coloque el animal en posición propensa sobre una almohadilla de calentamiento. Aplique lubricante para los ojos para la protección ocular durante la anestesia.</li>
	<li>Mantener la temperatura corporal dentro de 36 o0,5 oC. Administrar 5 mg/kg de peso corporal del carprofeno analgésico por vía subcutánea al aspecto lateral del cuello del ratón.</li>
	<li>Afeitar un cefálico de 3 x 5 cm2 de área del ratón de la cresta ilíaca. Antes de cubrir el animal con una lámina quirúrgica de 3 x 5 cm2 de apertura, limpie bien el área agotada con yodo y luego un 70% de etanol. Utilice instrumentos estériles y guantes durante el experimento.</li>
	<li>Utilice tijeras y fórceps para hacer una incisión 1 cm lateral a la línea media y 1 cm lateral a las costillas costales.</li>
	<li>Disecciona el tejido subcutáneo con fórceps.</li>
	<li>Use gafas dissección (ver Tabla de materiales)para identificar el tejido adiposo blanco en la cavidad abdominal.</li>
	<li>Utilice microtijeras y microcóceps para hacer una incisión de 0,5-1 cm a través de la fascia hasta que se alcance la cavidad abdominal. NOTA: Para el grupo atravesado, cierre las heridas directamente. Sutura la capa muscular y la piel por separado usando una sutura monofilamento.</li>
	<li>Cuando se pueda ver el tejido adiposo blanco en la cavidad abdominal, agarre el tejido adiposo con microfólceps y tire suavemente de él. Se puede ver un ovario rosado en forma de morera envuelto por tejido adiposo en la cavidad abdominal.</li>
	<li>Ligar el vaso proximal de 0,5-1 cm y el cuerno uterino utilizando una sutura monofilamento. Retire el ovario con microtijeras y vuelva a colocar el tejido restante en la cavidad abdominal. NOTA: Los principales síntomas adversos para la operación de OVX son la ligadura ureteral que conduce a una alta mortalidad en ratones operados por OVX. Esto se puede evitar mediante la identificación de los tejidos utilizando una sesión de gafas de diseción.</li>
	<li>Cierra las heridas. Sutura la capa muscular y la piel por separado usando una sutura monofilamento.</li>
	<li>Utilice tijeras y fórceps para hacer otra incisión 1 cm lateral a la línea media y 1 cm lateral a las costillas costales en el otro lado. Repita el procedimiento anterior (1.5 a 1.11).</li>
	<li>Deje que el animal despierte de la anestesia. Mantenga el ratón por separado el primer día después de la cirugía.</li>
	<li>Limpie o reemplace la jaula con frecuencia durante la fase de recuperación.</li>
	<li>Aproximadamente 24 h después de la cirugía, administrar otros 5 mg/kg de peso corporal del carprofeno analgésico por vía subcutánea.</li>
</ol>2. Administración peroral de 17o-estradiol o PPD a través de la propagación de avellanas
<ol><li>Disolver a fondo 17o-estradiol o PPD en aceite de sésamo, y luego mezclar el aceite de sésamo con la extensión de avellana (ver Tabla de Materiales). Una porción diaria por cada ratón de 30 g contiene 3 g de 17o-estradiol o 15 g de PPD, 4 l de aceite de sésamo y 60 mg de dispersión de avellana. Preparar un placebo para cada ratón de 30 g contiene 4 ml de aceite de sésamo y 60 mg de avellana. NOTA: La porción de administración diaria de 17o-estradiolo PPD se basó en estudios previos 6,11 y experimentos preliminares.</li>
	<li>Una semana después del OVX, alimenta a los ratones con una dieta alta en colesterol (1,25% colesterol, 0% de colación) durante 12 semanas. Un esquema de tratamiento experimental típico, tal como se utiliza en este estudio, se ilustra en la Figura1.</li>
	<li>5 días antes de la administración peroral de avellana diseminada en la semana 4, entrenar a los ratones para comer el placebo que contiene aproximadamente 30 mg de avellana esparcida para 2-5 ratones durante 5 días. Entrenar a los ratones en grupos en sus jaulas domésticas durante los primeros 3 días. Coloque los ratones en jaulas separadas en el cuarto y quinto día de entrenamiento y sirva la porción diaria para que se asemeje a la situación experimental.</li>
	<li>Durante las últimas 9 semanas, coloque los ratones en jaulas separadas y luego sirva una porción diaria de la porción de avellana esparcida para cada ocasión de alimentación. NOTA: Servir una porción diaria que contenga 17o-estradiol (0,1 mg-kg-1) o PPD (0,5 mg-kg-1) a través de la propagación de avellanas en el grupo OVX/E2 y OVX/PPD respectivamente; servir una porción diaria que contiene avellanas sin hormonas disecidas en el grupo SHAM y OVX.</li>
</ol>3. Determinación del espesor de los medios de intima y la disfunción cardíaca mediante un sistema de microultrasonido
<ol><li>
Biomicroscopía ultrasonográfica
	<ol>
<li>Un día antes de la terminación, examine el grosor de los medios de comunicación intima y la disfunción cardíaca utilizando un sistema de microultrasonido (ver Tabla de Materiales)como se describió anteriormente21.</li>
		<li>Antes del examen, le dé a cada ratón una inyección intraperitoneal de 200 mg/kg de avertina (tribromoetanol) como anestesia (n.o 8 ratones por grupo).</li>
		<li>Aficiones el pelo del cuello de cada ratón con cuidado. Aplique el gel de transmisión de ultrasonido caliente liberalmente para garantizar una calidad de imagen óptima.</li>
		<li>Obtenga imágenes ultrasonográficas basales de la raíz aórtica y la aorta ascendente con el cabezal de escaneo de 30 MHz con un enfoque de 12,7 mm y una resolución de 40 m.</li>
		<li>Utilice la electrocardiografía con una configuración de plomo II para el monitoreo.</li>
		<li>Capturar imágenes parasternales derechas de eje largo de la aorta ascendente, arco aórtico y rama de la arteria braquiocéfala en un plano en sístole (Figura3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mediciones de medios intima y espesor máximo de placa
	<ol>
<li>Ajuste la distancia entre el transductor y el sitio arterial fácilmente para obtener imágenes claras.</li>
		<li>Almacene un bucle cine de 10 s digitalmente para su examen fuera de línea en un sistema de análisis de imágenes.</li>
		<li>Elija manualmente una imagen ultrasonográfica de fotograma congelado óptima para realizar más mediciones. Compruebe las imágenes en la curvatura menor de la aorta ascendente. Si se puede ver la placa en la aorta ascendente, mida el espesor máximo de la placa. Si no se puede ver la placa en la aorta ascendente, mida la IMT máxima.</li>
		<li>Mida las IMT (distancia entre la interfaz luminal-intimal vascular y la interfaz medial-adventitial). Mida el espesor máximo de la placa (la distancia más gruesa entre el borde del lumen vascular y la capa adventitial).</li>
		<li>Datos medios de tres sitios de lesiones (Figura3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinación de la disfunción cardíaca mediante ecocardiografía NOTA: Examine la función cardíaca a través de ecocardiografía utilizando un sistema de microultrasonido, como se describió anteriormente22.<ol>
<li>Dirija un haz de ultrasonido hacia el corazón, cerca de los músculos papilares.</li>
		<li>Consiga una visualización de kilohercios basados en electrocardiogramas bidimensionales.</li>
		<li>Realice una ecocardiografía transtorácica in vivo del ventrículo izquierdo utilizando un cabezal de exploración de 30 MHz.</li>
		<li>Mida los parámetros asociados con la función cardíaca digitalmente a partir de trazados en modo M.</li>
		<li>Promedio de los datos de tres a cinco ciclos cardíacos (Tabla1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Variabilidad intra-e interobservadora
	<ol>
<li>Para la validación de la variabilidad intraobservador, analice los datos por un operador en dos ocasiones diferentes.</li>
		<li>Para la evaluación de la variabilidad interobservador, analice los datos por un operador diferente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Medición semanal del peso corporal y medición del colesterol total plasmático (TC) y triglicéridos (TG) Determinación
<ol><li>Medición semanal del peso corporal
	<ol>
<li>Mida el peso corporal una vez a la semana desde la semana -1 hasta la semana 12. NOTA: n a 8 ratones por grupo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del plasma
	<ol>
<li>Antes de recoger muestras de sangre a través de una punción intracardiaca, prepare jeringas y tubos. Utilice EDTA como anticoagulante. Añadir 10 ml de EDTA de 0,5 M a cada jeringa de 2 ml y añadir 8 ml de EDTA de 0,5 M a cada tubo de 1,5 ml.</li>
		<li>En la semana 12, después de un ayuno nocturno, anestesiar a los ratones con avertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente). NOTA: n 3 ratones por grupo.</li>
		<li>Prepare la zona del pecho ventral con 70% de etanol.</li>
		<li>Usa tijeras y fórceps para abrir la cavidad torácica y cortar las costillas hasta que el corazón latiendo esté expuesto.</li>
		<li>Inserte la aguja de 25 G en el ventrículo derecho. Aspirar lentamente hasta que la sangre comience a fluir hacia la jeringa. NOTA: Utilizamos jeringas desechables en estado estéril con agujas de 25 G (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Continúe aspirando con presión constante y uniforme. Si no se ve sangre, vuelva a colocar la aguja y repita la aspiración.</li>
		<li>Mantenga a los ratones profundamente anestesiados antes de recoger el volumen sanguíneo requerido. Normalmente, se pueden recolectar hasta 1 ml de sangre. Eutanasia a los ratones por luxación cervical bajo esta condición anestésica profunda.</li>
		<li>Pipetear muestras de sangre en tubos de 1,5 ml e invertir la sangre a fondo para asegurar la mezcla de EDTA en la sangre. A continuación, coloque muestras de sangre en hielo inmediatamente.</li>
		<li>Muestras de centrífuga durante 20 min a 400 x g a 4oC dentro de los 30 min de recogida.</li>
		<li>Recoge el sobrenadante con cuidado. Aliquot y almacenar muestras de plasma a -80 oC.</li>
	</ol></li>
	<li>Construir curvas estándar para la medición de contenido TC o TG
	<ol>
<li>Para la curva estándar TC, prepare varias concentraciones de normas de colesterol: 0 mmol/L, 0,52 mmol/L, 1,03 mmol/L, 2,07 mmol/L, 4,14 mmol/L, 6,20 mmol/L, 8,27 mmol/L y 10,34 mmol/L. Medir O.D. para el colesterol cada norma. Establezca el D.O. promedio para cada estándar de colesterol. Como valor del eje vertical (Y), establezca la concentración como el valor del eje horizontal (X). Cree una curva estándar utilizando un software estadístico.</li>
		<li>Para la curva estándar TG, prepare varias concentraciones de estándares TG: 0 mmol/L, 0,45 mmol/L, 0,90 mmol/L, 1,81 mmol/L, 3,62 mmol/L, 5,42 mmol/L, 7,23 mmol/L y 9,04 mmol/L. Medida O.D. para cada norma TG. Establezca el D.O. promedio para cada estándar TG como el valor del eje vertical (Y); establecer la concentración como el valor del eje horizontal (X). Cree una curva estándar utilizando un software estadístico. NOTA: En el presente estudio se utilizó un accesorio de curva logística de cuatro parámetros (4-pl) para la construcción de curvas estándar. Compruebe la curva estándar antes de medir las muestras de plasma y asegúrese de que r2 sea mayor que 0,995.</li>
	</ol></li>
	<li>Medición del contenido de TC
	<ol>
<li>Etiquete la botella de reactivo de color (25 ml) del kit de ensayo TC como "Solución de trabajo TC".</li>
		<li>Vortex los especímenes refrigerados brevemente. Preparar diluciones: 20 ml de plasma en 80 ml de agua destilada. Diluciones breves de vórtices.</li>
		<li>Añadir 2,5 l de normas de colesterol (5,17 mmol/L) o 2,5 l de plasma diluido o 2,5 l de agua destilada (en blanco) a los pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos. Se recomienda triplicación.</li>
		<li>A todos los pozos, agregue 250 s de reactivo de color.</li>
		<li>Incubar a 37oC durante 10 min.</li>
		<li>Encienda el lector de microplacas y deje un calentamiento de 10 minutos.</li>
		<li>Retire la(s) placa(s) de la incubadora(s) y lea el lector de microplacas a 510 nm. Asegúrese de que no haya burbujas ni polvo en los pocillos microtíteres o en la parte inferior de la placa, respectivamente.</li>
		<li>Calcule la concentración de TC de la siguiente manera: TC cont. - normas de colesterol cont.</li>
	</ol></li>
	<li>Medición del contenido de TG
	<ol>
<li>Etiquete la botella de reactivo de color (25 ml) del kit de ensayo TG como "Solución de trabajo TG".</li>
		<li>Vortex los especímenes refrigerados brevemente.</li>
		<li>Añadir 2,5 l de normas de TG (2,26 mmol/L) a o 2,5 l de plasma diluido o 2,5 l de agua destilada (en blanco) a los pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos. Se recomienda triplicación.</li>
		<li>A todos los pozos, agregue 250 s de reactivo de color.</li>
		<li>Incubar a 37oC durante 10 min.</li>
		<li>Encienda el lector de microplacas y deje un calentamiento de 10 minutos.</li>
		<li>Retire la(s) placa(s) de la incubadora(s) y lea el lector de microplacas a 510 nm. NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas o polvo en los pocillos de microtíter o en la parte inferior de la placa.</li>
		<li>Calcule la concentración de TG de la siguiente manera: TG cont. - Estándares TG cont. ( muestra de plasma O.D.-o.D.o en blanco)/(Normas TG O.D.-O.D. en blanco)</li>
	</ol></li>
</ol>5. Es Análisis facial de lesiones ateroscleróticas aórticas
<ol><li>Aislamiento y escisión de Aorta
	<ol>
<li>En la semana 12, después de un ayuno nocturno, anestesiar a los ratones con avertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente). Eutanasia a los ratones por luxación cervical bajo esta condición anestésica profunda. NOTA: Usamos 3 ratones por grupo.</li>
		<li>Prepare la zona del pecho ventral con 70% de etanol. Usa tijeras y fórceps para abrir la cavidad torácica y cortar las costillas hasta que el corazón latiendo esté expuesto.</li>
		<li>Llene una jeringa de 50 ml con solución salina tamponada de fosfato a pH 7.4 (ver Tabla de Materiales). Inserte una aguja de 25 G en el ventrículo izquierdo y corte la aurícula derecha para evitar altas presiones por perfusión.</li>
		<li>Realizar perfusión in situ a un caudal de 0,05-0,08 ml/min. Absorber líquido de perfusión con tejidos.</li>
		<li>Retire las costillas y los pulmones en la cavidad torácica con tijeras y fórceps. Luego, abre la cavidad abdominal y extrae los órganos dentro para una mejor vista de la aorta.</li>
		<li>Retire la aorta sosteniendo el corazón con las microfólceps y separando la aorta de la columna dorsal con microscissdores hasta la bifurcación ilíaca. NOTA: Cuando se disecte cerca de las ramas auriculares renales, corte profundamente usando microtijeras para evitar daños en la aorta.</li>
		<li>Fijar el corazón y la aorta durante 48 h en 4% paraformaldehído. Almacene las aortas en salina a temperatura ambiente o a 2-8oC durante unas horas. NOTA: Este procedimiento facilitará la limpieza.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la aorta
	<ol>
<li>Quita el corazón. Retire cuidadosamente los tejidos adventiales de las aortas usando microcóceps y microscissdores bajo un estereomicroscopio. Use salina para mantener el tejido húmedo durante la limpieza. NOTA: Tenga cuidado de no rasgar o cortar la aorta y algunas ramas importantes, como la arteria nominada, la arteria carótida común izquierda y la arteria subclavia izquierda.</li>
		<li>Dejar 1 mm de las arterias carótidas comunes y dejar las arterias carótidas comunes y cortar toda la arteria subclavia izquierda.</li>
		<li>Cortar la curvatura externa a través de la arteria innominada, luego a la arteria carótida común izquierda, y luego a la arteria subclavia izquierda.</li>
		<li>Cortar abierto a lo largo de la curvatura interna de la parte ascendente a la parte inferior de la parte abdominal.</li>
		<li>Anclar la aorta plana sobre una lámina de plástico negro y aplicar salina para evitar que las aortas se sequen.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagen de la región intimal de la aorta
	<ol>
<li>Tome fotografías de aortas en face con un microscopio estéreo. Incluya una regla de escala milimétrica en las imágenes para calibrar las mediciones.</li>
		<li>Incluya el arco y las regiones torácicas en la misma imagen y la región abdominal en otra. Guardar imágenes como JPEG o TIFF. NOTA: La región del arco es desde la unión del miocardio hasta 3 mm distal de la arteria subclavia izquierda, la región torácica es de 3 mm distal a la arteria subclavia izquierda hasta la última arteria intercostal, y la región abdominal es la última arteria intercostal a la ilíaca Bifurcación.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuantificación del método facial de lesión aterosclerótica
	<ol>
<li>Calibración<ol>
<li>Abra la imagen con el software de análisis de imágenes (consulte Tabla de materiales), vaya a Calibración espacial y siga las instrucciones.</li>
			<li>Cambie las unidades de referencia a mm colocando la regla sobre la línea.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Medición<ol>
<li>Establezca la calibración correcta para cada imagen.</li>
			<li>Mida 3 mm en la regla.</li>
			<li>Medición del arco y la región torácica: Delinee la región del arco desde la unión del miocardio hasta el disal de 3 mm desde la arteria subclavia izquierda y la región torácica de 3 mm de distal a la arteria subclavia izquierda hasta la última arteria intercostal. Traza lesiones en el arco y la región torácica y mira la aorta a través del microscopio.</li>
			<li>Medición de la región abdominal: Esboza la región abdominal desde el final de la región torácica hasta la bifurcación ilíaca. Rastrea lesiones en la región abdominal y observa la aorta a través del microscopio.</li>
			<li>Calcular el área de la lesión en relación con la superficie interna de la aorta.</li>
			<li>Verifique la cuantificación a través de un segundo observador que sea ciego a los grupos de estudio.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran conflictos de intereses.

La metodología descrita aquí es un modelo de ratón que se asemeja a la alteración de los lípidos y la aterosclerosis vista en las mujeres menopáusicas. Está bien documentado que la deficiencia de estrógeno en mujeres posmenopáusicas puede agravar la incidencia de hipercolesterolemia preexistente o en curso con lesiones aterosclerosósticas progresivamente complejas y generalizadas1. Para imitar el estado propenso a la aterosclerosis en la clínica, se aplicaron ratones apoE deficientes, una fuente r...

Los estudios epidemiológicos y clínicos han demostrado que las mujeres posmenopáusicas tienen un riesgo considerablemente mayor de enfermedad cardiovascular que las mujeres premenopáusicas1,2. La terapia de reemplazo hormonal (HRT) puede reducir el riesgo relativo de enfermedad cardiovascular a 0,37-0,793. Entre otras complicaciones, la aterosclerosis causada por enfermedades cardiovasculares es la principal causa de muerte en todo el mundo4. Sin embargo, faltan modelos de laboratorio que involucran ratones con deficiencia de estrógeno que presentan un estado propenso a la aterosclerosis. Este protocolo proporciona un modelo de ratón por deficiencia de estrógeno in vivo para la detección de tratamientos de estrógeno exógenos de disfunción cardiovascular después de la menopausia.
Estudios anteriores muestran que la aplicación de OVX en roedores aterosclerósicos alimentados con una dieta alta en colesterol puede imitar a las mujeres posmenopáusicas que sufren de aterosclerosis5,6,7,8. Un modelo animal reproducible y conveniente que se asemeja al estado aterosclerógeno en las mujeres menopáusicas es la base de la investigación de estrógenoexógenos. Aquí, se aplicó una doble incisión dorsal-lateral de la ovariectomía bilateral en ratones propensos a la aterosclerosis E knockout (apoE-/-)9,10. En comparación con la incisión abdominal o dorsal media, la incisión dorsal doble es un método más fácil y lento que puede evitar la adhesión e inflamación graves de la cavidad abdominal. La administración peroral a través de la propagación de avellanas (ver Tabla de Materiales)no es invasiva y conveniente, por lo que es ampliamente aplicable como modo de administración a largo plazo11. La implantación de pellets de liberación lenta también es popular6. Sin embargo, los implantes pueden agravar la incidencia de infección, especialmente en ratones sometidos a OVX. Otros modos de administración no invasivos, como el gavage oral y la administración del agua, también tienen muchos inconvenientes. Por lo general, el avalo oral estresa a los ratones y puede causar lesiones esofágicas. La administración de la hormona a través del agua potable es altamente beneficioso; sin embargo, la adición de DMSO como emulsionante es inevitable ya que los estrógenos exógenos son insolubles en agua. Aquí, elegimos el reemplazo de hormona peroral 17o-estradiol o fitoestrógeno a través de la propagación de avellanas para la administración a largo plazo.
Recientemente, el efecto beneficioso de la HRT en el sistema cardiovascular de las mujeres posmenopáusicas se ha disputado en los ensayos12de la iniciativa de salud de la mujer (WHI). Por un lado, estrógeno exógeno por sí solo ejerce un efecto beneficioso sobre el sistema cardiovascular; por otro lado, se puede combinar con acetato de metohidroxiprogesterona para aumentar el riesgo de eventos cardiovasculares. Más en serio, HRT puede conducir a la progresión de la mama y el tumor uterino, y este efecto ha limitado notablemente su uso13,14. Más interés se ha centrado en los efectos cardiovasculares-protectores de los estrógenos exógenos que carecen de actividad mitotica en las células tumorales15,16,17. Múltiples estudios en seres humanos y animales sugieren que los fitoestrógenos con estructuras similares a la de los estrógenos pueden desempeñar un papel beneficioso en la protección cardiovascular15,18.
Por lo tanto, los objetivos del presente trabajo son (i) construir un modelo de ratón con deficiencia de estrógeno in vivo mediante ovariectomía bilateral a través de una doble incisión dorsal-lateral en ratones apoE-/- y (ii) comparar los efectos protectores cardiovasculares de peroalmente administrado 17o-estradiol y pseudoprotodioscina (PPD), a través de la propagación de avellanas. 17o-estradiol es un tipo de estrógeno exógenoque pertenece a las hormonas sexuales femeninas 6,11,19. PPD, un esteroide saponina y fitoestrógeno de plantas de Dioscorea, se ha divulgado previamente para ejercer propiedades antitumorales20.

<table><tbody><tr><td>17&beta;-estradiol, >98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8875-250MG</td><td>Estrógeno</td></tr><tr><td>Jeringas desechables (con agujas de 25 G)</td><td>Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd</td><td>0.5 * 19TWLB</td><td>Hemorragia cardíaca</td></tr><tr><td>Dieta de ratón con alto contenido de colesterol</td><td>Huafukang Bio-Technology</td><td>N/A</td><td>1,25% de colesterol, 0% de colato</td></tr><tr><td>Sistema de microimagen in vivo de alta resolución</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo&reg; 770</td><td>Mediciones del grosor íntima-media y de la disfunción cardíaca</td></tr><tr><td>2-Metil-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463-250ML</td><td>Preparación de avertin</td></tr><tr><td>Micro Pinzas de disección, curvadas de 8 mm</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Herramientas quirúrgicas</td></tr><tr><td>Micro pinzas de disección, rectas de 8 mm</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Herramientas</td></tr> <tr><td>quirúrgicasMicro Tijeras de disección, curvas/afiladas de 8 mm</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Herramientas quirúrgicas</td></tr><tr><td>Micro tijeras de disección, rectas/afiladas de 8 mm</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Herramientas quirúrgicas</td></tr><tr><td>Sutura de monofilamento 4-0 1/2 5 x 12 19 mm</td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd</td><td>R413</td><td>Sutura y ligadura de los tejidos</td></tr><tr><td>Crema de nueces (Nutella)</td><td>Ferrero</td><td>N/A</td><td>Medio para lupa binocular de vidrio óptico OptiVisor peroral 17&beta;-estradiol o PPD</td></tr><tr><td></td><td>Dohegan Optical Company Inc.</td><td>N/A</td><td>Asistente de identificación de los tejidos durante la ovariectomía</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4</td><td>SIGMA</td><td>P3813</td><td>Preparación de solución salina de 1 L</td></tr><tr><td>Lector de microplacas Pro MultiLabel</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Determinación de TC y TG</td></tr><tr><td>por plasma Pseudoprotodioscina</td><td>Shanghai Winherb Medical S & T Desarrollo</td><td>W-0427</td><td>Nº de registro CAS 102115-79-7</td></tr><tr><td>Rimadyl, 50 mg/mL</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td>462986</td><td>Analgesia postoperatoria después de la ovariectomía</td></tr><tr><td>Aceite de sésamo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3547-1L</td><td>Disolución del 17&beta;-estradiol o PPD</td></tr><tr><td>Solcoseryl Eye-Gel</td><td>Menarini, Solco Basle Ltd.</td><td></td><td>Protección ocular durante la anestesia</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>MCALON</td><td>MCL-6STV</td><td>Imagen de la región íntima de la aorta</td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidad modelo de mesa</td><td>SIGMA</td><td>1-14K</td><td>Preparación de plasma</td></tr><tr><td>Tijeras, ligera curva (14 cm)</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Herramientas quirúrgicas</td></tr><tr><td>Tijeras, rectas planas (14 cm)</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Herramientas quirúrgicas</td></tr><tr><td>Pinzas de tejido, dentadas, ligeramente curvadas (14 cm)</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Herramientas quirúrgicas</td></tr><tr><td>Pinzas de tejido, dentadas, rectas Planas (14 cm)</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Herramientas quirúrgicas</td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-5G</td><td>Preparación de avertina</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de triglicéridos (TG)</td><td>Instituto de Ingeniería Biológica de Nanjing Jiancheng</td><td>A110-1 Determinación de</td><td>TG en plasma</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de colesterol total (TC)</td><td>Instituto de Ingeniería de Biología de Nanjing Jiancheng</td><td>A111-1 Determinación de</td><td>TC en plasma</td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón con deficiencia de estrógeno in vivo para la detección de tratamientos de estrógeno exógeno sorgénicos de la disfunción cardiovascular después de la menopausia

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Las mujeres posmenopáusicas corren un mayor riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares que las mujeres premenopáusicas. Los ratones hembra ovariectomizados (OVX) en la exhibición de destete muestran un aumento de las lesiones ateroscleróticas en la aorta en comparación con los ratones hembra con la función ovárica intacta. Sin embargo, faltan modelos de laboratorio que involucran ratones con deficiencia de estrógeno con estado propenso a la aterosclerosis. Este déficit es crucial porque la deficiencia clínica de estrógeno en mujeres menopáusicas puede agravar la incidencia de la alteración de lípidos preexistentes o en curso y la aterosclerosis. En este estudio, establecemos un modelo de ratón in vivo con deficiencia de estrógeno por ovariectomía bilateral a través de una doble incisión dorsal-lateral en apolipoproteína E (apoE)-/- ratones. A continuación, comparamos los efectos de 17o-estradiol y pseudoprotodioscina (PPD) (un fitoestrógeno) perorgénicamente administrados a través de la propagación de avellanas. Encontramos que aunque ppD ejerce algún efecto en la reducción del peso corporal final y el TG plasmático en ratones OVX apoE-/-, tiene capacidades anti-ateroscleróticas y olascitoras comparables con su contraparte de 17o-estradiol. La PPD es un fitoestrógeno que se ha divulgado para ejercer propiedades antitumorales. Por lo tanto, el método propuesto es aplicable para el cribado de fitoestrógenos a través de la administración peroral para sustituir la terapia tradicional de reemplazo hormonal en mujeres posmenopáusicas, que se ha informado que tiene potencialmente perjudicial tumorigenetica Capacidad. La administración peroral a través de la propagación de avellanas no es invasiva, por lo que es ampliamente aplicable a muchos pacientes. Este artículo contiene demostraciones paso a paso de la ovariectomía bilateral a través de la doble incisión dorsal-lateral en ratones apoE-/- y reemplazo peroral 17o-estradiol o hormona fitoestrógeno a través de la propagación de avellanas. Siguen los análisis de lípidos plasmáticos y de la función cardiovascular mediante ecocardiografía.

Un esquema de tratamiento experimental típico, tal como se utiliza en este estudio, se ilustra en la Figura1. Al destete (edad 28 días), las hembras apoE-/- C57BL/6J ratones fueron anestesiados conavertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente). Los ratones fueron bilateralmente OVX o falsos operados a través de una incisión dorsal de 1 cm. Una semana después del OVX bilateral, los ratones recibieron una dieta alta en colesterol (1,25% c...

Clínicamente, la deficiencia de estrógeno en mujeres menopáusicas puede agravar la incidencia de trastornos lipídicos y aterosclerosis. Establecimos un modelo de deficiencia de estrógeno in vivo por ovariectomía bilateral a través de una doble incisión dorsal-lateral en ratones apoE-/-. El modelo de ratón es aplicable para el cribado de tratamientos de estrógeno exógeno de disfunción cardiovascular después de la menopausia.

Un modelo de ratón con deficiencia de estrógeno In Vivo para la detección de tratamientos de estrógeno exógeno sorgénicos de la disfunción cardiovascular después de la menopausia

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Faltan modelos de laboratorio que involucren ratones con deficiencia de estrógeno que presenten datos de pons de arteriosclerosis. Este procedimiento es especialmente útil para la detección de tratamientos de estrógeno exógenos de la disfunción cardiovascular después de la menopausia. La principal ventaja de esta técnica es que la ovariectomía sin incisión dorsolateral doble es un método más fácil y que consume menos tiempo que evita la adherencia e inflamación graves de la cavidad abdominal.Demostrando el procedimiento estará Yue-Zhang Yin, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para realizar una ovariectomía bilateral en ratones knockout APOE, primero confirme una falta de respuesta al reflejo del pedal y coloque al animal en la posición propensa en una almohadilla de calentamiento. Aplicar ung ón en los ojos del animal y cubrir al animal con una cortina quirúrgica.Haga una incisión de un centímetro lateral a la línea media, y un centímetro lateral a las costillas costales, y use fórceps para diseccionar sin rodeos el tejido subcutáneo. Usando gafas diseccionentas, identifique el tejido adiposo blanco en la cavidad abdominal. Usando micro tijeras y microppps, haga una incisión de 0.5 a un centímetro a través de la fascia, hasta que se alcance la cavidad abdominal, y use los micro fórceps para retraer suavemente el tejido adiposo blanco.Se debe observar un ovario rosado en forma de morera, envuelto en tejido adiposo, dentro de la cavidad abdominal. Utilice una sutura de monofilamento para ligar el vaso proximal de 0,5 a un centímetro y el cuerno uterino, y utilice las micro tijeras para cosechar el ovario. Devuelva el tejido restante a la cavidad abdominal y utilice suturas monofilamento individuales para cerrar por separado las capas musculares y cutáneas.A continuación, cosechar el ovario en el lado contralateral del animal, como acaba de demostrar, y permitir que el ratón se recupere en una almohadilla de calentamiento con monitoreo, hasta la recumbencia completa. Una vez a la semana, desde la semana anterior hasta las 12 semanas después de la cirugía, mida el peso corporal de cada sham y animal experimental en equilibrio. Para la medición plasmática total de colesterol y triglicéridos, en la semana 12, prepare el área ventral del tórax con 70% de etanol e inserte una aguja de calibre 25 en el ventrículo derecho.Aspirar lentamente, hasta que un mililitro de sangre fluya hacia la jeringa, y dispensar la muestra en un tubo de recogida de 1,5 mililitros que contenga diez microlitros de 0,5 molares EDTA. Invierta el tubo varias veces a fondo para mezclar el EDTA en la sangre, e inmediatamente coloque el tubo sobre hielo. Dentro de los 30 minutos de recolección, centrifugar la muestra durante 20 minutos a 400 veces G y cuatro grados Celsius.Recoja cuidadosamente el sobrenadante de plasma para almacenarlo a menos 80 grados centígrados. Para aislar la aorta, en la semana 12, coloque una aguja de calibre 25 en una jeringa de 50 mililitros llena de PBS e inserte la aguja en el ventrículo izquierdo del animal experimental. Corte la aurícula derecha para evitar la alta presión de la perfusión, y perfunda el tejido cardíaco a un 05 a 08 mililitros de PBS por minuto de caudal.Absorber el líquido de perfusión con tejidos de laboratorio y utilizar tijeras y fórceps para eliminar las costillas y los pulmones. Abra la cavidad abdominal para extraer los órganos internos, para una mejor vista de la aorta. Agarre el corazón con micro fórceps para permitir la separación de la aorta dorsalmente, de la columna vertebral, hasta la bifurcación ilíaca.A continuación, fije el corazón y la aorta durante 48 horas en 4%paraformaldehído, antes de almacenar la muestra de tejido en solución salina o a dos a ocho grados centígrados durante unas horas. Después de doce semanas de una dieta alta en colesterol, los ratones ovariectomizados demuestran un aumento notable en las concentraciones plasmáticas totales de colesterol y triglicéridos. Los ratones ovariectomizados, administrados por vía oral con estradiol 17-beta, o PPD a través de la propagación de avellanas, presentan concentraciones de colesterol total plasmática significativamente más bajas que los ratones operados por sham.Los niveles de triglicéridos plasmáticos disminuyen en ratones ovariectomizados, por vía oral administrada con estradiol 17-beta, pero no con PPD. Mientras que se observa una tendencia hacia un aumento del peso corporal en ratones ovariectomizados, en comparación con ratones operados por sham, no se observan cambios significativos en el peso corporal en general, entre los cuatro grupos de animales. La placa máxima de la aorta ascendente se incrementa en ratones ovariectomizados, en comparación con todos los demás grupos, junto con una disminución general de la función cardíaca, observada en estos animales.Además, el porcentaje medio del área de lesiones aórticas, en relación con toda el área aórtica, aumenta significativamente en ratones ovariectomizados. Como era de esperar, la presencia de estas lesiones se reduce con 17-beta de estradiol, o tratamiento con PPD. El principal riesgo para la operación de la ovariectomía es la ligadura ureteral, que resulta en una alta mortalidad.También recuerde cortar profundamente cerca de las ramas de la arteria renal, para evitar daños aórticos.

an-vivo-estrogen-deficiency-mouse-model-for-screening-exogenous

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Ovariectomía y la consiguiente sustitución de 17β-estradiol por medio de cápsulas de Silastic y Nutella por vía oral se ha demostrado en ratas y ratones.

Ovariectomía y 17β-estradiol reemplazo en ratas y ratones: una demostración visual

Dos paradigmas de ejercicio se pusieron a prueba en un modelo inducido químicamente menopáusica ratón de nuevo desarrollo para examinar el impacto de la menopausia en la capacidad de ejercicio y la adaptación cardiaca al ejercicio.

Un método para estudiar el impacto de la falla ovárica inducida químicamente en la capacidad de ejercicio y la adaptación cardiaca en ratones

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes en vivo de fluorescencia etiquetadas fragmentos de endometrio humanos injertado en ratones. El método permite estudiar los efectos de los fármacos de elección en el tamaño de la lesión endometriotic a través del monitoreo y cuantificación de la fluorescencia emitida por el reportero fluorescente en tiempo...

Monitoreo no invasivo del tamaño de la lesión en un modelo de ratón heterólogos de la Endometriosis

Describimos el desarrollo de un modelo de ratón de SOP-como magro con dihidrotestosterona pelotilla para el estudio de la fisiopatología del SOP y la descendencia de estas presas como SOP.

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Muchos modelos de roedores de endometriosis están limitados por la complejidad técnica, la reproducibilidad y / o la necesidad de animales inmunocomprometidos o ratones reporteros especiales. Presentamos un sistema simplificado de inducción de lesiones utilizando cualquier ratón experimental con un sistema de puntuación objetivo verificable de forma independiente y sin necesidad de ovariectomía o cirugía de supervivencia.

Un modelo murino singénico de endometriosis utilizando ratones de ciclo natural

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Exploración de los efectos independientes de la hormona folículo estimulante in vivo en un modelo de ratón

Este artículo describe un protocolo detallado para producir un endometrio delgado fiable y reproducible con una tasa de mortalidad muy baja y adherencias intrauterinas mínimas mediante la inyección de etanol al 95% en el útero de ratón en 1-3 minutos.

Establecimiento de un modelo de ratón de endometrio delgado

La adsorción de péptidos a los materiales de plástico durante las diluciones en serie tradicionales basadas en puntas puede afectar significativamente la determinación de la potencia y confundir la comprensión de las relaciones estructura-actividad utilizadas para las fases de identificación y optimización de pistas del descubrimiento de fármacos. Aquí se describen los métodos para la dilución en serie acústica automatizada sin contacto de muestras de péptidos.

Automatizado de dispensación acústica para la dilución en serie del péptido Los agonistas de la potencia Ensayos de Determinación

Aquí, se describe la preparación y uso de una sonda basada en la actividad (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato) que permite la detección y cuantificación de la forma activa de la enzima proinflamatoria N amidasa ácido -acylethanolamine (NAAA), tanto in vitro como ex vivo.

Preparación y<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de una sonda basada en la actividad de<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Ácido amidasa

Alteraciones en la tasa metabólica es central para entender la progresión de varias enfermedades y envejecimiento. Aquí, presentamos una nueva técnica para medir el consumo de oxígeno toda cabeza que más estrechamente se asemeja el estado fisiológico y puede ayudar a revelar nuevos fármacos que modifican la actividad mitocondrial.

Medición e interpretación de las tasas de consumo de oxígeno en su totalidad operan segmentos de cabeza

Aprende a realizar ovariectomía bilateral en ratones apoE -/- para estudiar disfunción cardiovascular postmenopáusica. Este modelo permite evaluar tratamientos de estrógeno exógeno con técnicas quirúrgicas refinadas que minimizan complicaciones.

Un modelo de ratón con deficiencia de estrógeno In Vivo para la detección de tratamientos de estrógeno exógeno sorgénicos de la disfunción cardiovascular después de la menopausia (Video) | JoVE Journal

Un modelo de ratón con deficiencia de estrógeno In Vivo para la detección de tratamientos de estrógeno exógeno sorgénicos de la disfunción cardiovascular después de la menopausia

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