Name: Genotipado de anémona sin mar durante el desarrollo temprano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprende a genotipar Nematostella vectensis durante la gastrulación sin sacrificar el embrión. Esta técnica permite identificar mutantes temprano y estudiar fenotipos postembrionarios en biología del desarrollo.

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Agradecemos a los revisores anónimos por los comentarios sobre la versión anterior del manuscrito, que mejoró el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por fondos de la Universidad de Arkansas.

1. Inducción de desove, fertilización in vitro y de-jellying
<ol><li>Mantener nematostella vectensis en el agua de mar con una salinidad de 12 partes por mil (ppt) en la oscuridad a 16 oC, alimentando Artemia diariamente.</li>
	<li>El día antes de la inducción del desove, coloque a los animales en una incubadora controlada por temperatura y luz. Programar la incubadora para que los animales estén expuestos a 8 h de luz a 25oC. Opcional: Alimente una pequeña pieza (<1 mm3) de ostra a animales individuales antes de colocarlos en la incubadora para mejorar el desove.</li>
	<li>Dejar a los animales en la incubadora durante 1 h a 16oC.</li>
	<li>Retire los animales de la incubadora y déjelos en una mesa con luz a temperatura ambiente (RT) para permitir el desove. El desove generalmente ocurre dentro de la siguiente 1.5–2 h.</li>
	<li>Si los machos y las hembras están en recipientes separados, coloque los paquetes de óvulos del recipiente femenino en un recipiente macho que contenga espermatozoides utilizando una pipeta de transferencia cuya punta se corta para agrandar la abertura de modo que los óvulos no se dañen por estrés mecánico durante Transferencia. Deje fertilizar los óvulos dejándolos en el recipiente masculino durante al menos 15 minutos.</li>
	<li>Desgela los paquetes de huevos en agua de mar que contiene 3% de cisteína (pH 7.4) en un plato de Petri o en un tubo de 15 ml. Agitar suavemente en una coctelera durante 12 minutos.</li>
	<li>Utilice una pipeta de plástico para romper los grumos y continúe agitando durante otros 2-3 minutos hasta que se desenjuicie por completo.</li>
	<li>Elimine la cisteína reemplazando los medios por agua de mar fresca durante al menos 5 veces.</li>
	<li>Mantener los huevos fertilizados en un plato de Petri de vidrio a 16 oC o RT.</li>
</ol>2. Extirpación quirúrgica de un tejido aboral de un embrión de gastrula
<ol><li>Preparar un tampón de extracción de ADN que consista en 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40, y 1 mg/ml de proteinasa K. Utilice 20 ml del tampón de extracción por embrión. Mezclar bien mediante el vórtice y alícuota el búfer en tubos PCR.</li>
	<li>Disolver 1% de agarosa en agua de mar y verter la en un plato de Petri para cubrir el fondo. Enfríe en una mesa de trabajo para hacer una cama de gel. Vierta agua de mar fresca para cubrir el lecho de gel en el plato Petri.</li>
	<li>Transfiera embriones de 24 h después de la fertilización (hpf) (etapa de gastrula temprana a media) a la placa Petri que contiene un lecho de gel de agarosa.</li>
	<li>Inserte una aguja de tungsteno en un soporte de aguja y esterilice sumergiendo la punta de la aguja en alcohol (70% o más) y colocándola en llamas para quemar el alcohol.</li>
	<li>Bajo un microscopio de disección (con aumento de 20x a 40x), utilice la aguja de tungsteno para hacer una depresión en el lecho de agarosa quitando un pedazo de agarosa superficial del tamaño de un embrión a manipular, y coloque el embrión en la depresión con su lateral cara hacia abajo con el fin de restringir el movimiento del embrión para la microcirugía.</li>
	<li>Utilice la aguja de tungsteno para extirpar quirúrgicamente un pedazo de tejido abortivo situado frente a la abertura blastoporal oral. Por lo general, es suficiente un aboral de un tercio a una cuarta parte del tejido embrionario a lo largo del eje oral-aboral.</li>
	<li>Utilice una pipeta P20 para transferir el tejido aboral aislado (en <2 ml) a un tubo PCR que contenga 20 ml de tampón de extracción de ADN.</li>
	<li>Transfiera el embrión post-cirugía a un pozo que contenga al menos 500 ml de agua de mar fresca en una placa de 24 o 96 pocillos.</li>
	<li>Repita los pasos 2.4–2.8 para el número de embriones según sea necesario.</li>
	<li>Coloque la placa de pozo que contiene embriones post-cirugía en una incubadora a 16 oC o RT hasta que se complete el genotipado.</li>
</ol>3. Extracción de ADN genómico y genotipado PCR
<ol><li>Gire brevemente los tubos de PCR que contienen el tampón de extracción de ADN y los tejidos embrionarios aislados utilizando una minicentrífuga (por ejemplo, a 2.680 x g durante 10 s).</li>
	<li>Para extraer ADN genómico de embriones individuales, incubar los tubos de PCR a 55 oC durante 3 h. Vórtice durante 30 s cada 30 min para asegurar la ruptura de los grumos celulares y mejorar la lisis celular.</li>
	<li>Incubar los tubos de PCR a 95 oC durante 5 min para inactivar la proteinasa K.</li>
	<li>Mantener los extractos de ADNG a 4 oC o sobre hielo, y proceder inmediatamente a la PCR. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí colocando extractos de ADNa en un congelador de -20 oC.</li>
	<li>Configure una reacción de PCR utilizando gDNA extraído como plantilla para amplificar el locus genómico de interés.<ol>
<li>Si los diferentes alelos en el locus de interés difieren en tamaño para que la diferencia de tamaño se pueda detectar mediante electroforesis de gel de agarosa, diseñe un solo conjunto de imprimaciones para amplificar todo el locus.</li>
		<li>Alternativamente, utilice imprimaciones específicas de alelos que generen productos de PCR sólo en presencia del alelo específico; por ejemplo, diseñando la imprimación que se une a una región que contiene mutaciones de inserción/eliminación.</li>
		<li>Utilice una mezcla de reacción PCR típica de 20 ml de la siguiente manera: 5 ml de extractos de ADNa-G, 8 ml de agua libre de nucleasa, 4 ml de tampón PCR, 0,2 ml de dNTPs de 10 mM, 0,6 ml de DMSO, 1 ml de imprimación directa de 10 ml, 1 ml de imprimación inversa de 10 mM , y 0,2 ml de ADN polimerasa (ver Tabla de Materiales). NOTA: Se pueden utilizar varios imprimadores en una reacción de PCR. Por ejemplo, se puede combinar una imprimación delantera universal y dos imprimaciones inversas específicas de alelos, siempre y cuando las dos imprimaciones inversas estén diseñadas para generar productos de PCR de tamaños distintos, de modo que la presencia/ausencia de los dos alelos pueda ser inequívoca electroforesis de gel (ver sección de resultados representativos).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecute la electroforesis de gel de agarosa para determinar el tamaño y la presencia/ausencia de los productos pcR. Ajuste el estado de la electroforesis del gel de agarosa (por ejemplo, porcentaje de gel de agarosa, V/cm y duración) dependiendo del tamaño esperado de los productos de PCR.</li>
	<li>Utilice los resultados de la PCR con respecto al tamaño y la presencia/ausencia de productos de PCR para asignar un genotipo a cada embrión post-cirugía. Por ejemplo, si se espera que diferentes alelos generen productos de PCR de diferentes tamaños, utilice la información de tamaño para asignar el genotipo para cada embrión. Si se utilizan imprimaciones específicas de alelo, los datos sobre la presencia/ausencia de productos PCR deben utilizarse para asignar un genotipo a cada embrión.</li>
	<li>Ordenar embriones según genotipo.</li>
</ol>

<ol><li>Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+hypotheses+of+basal+animal+phylogeny+using+complete+sequences+of+large+and+small+subunit+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).</li>
<li>Erwin, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cambrian+Conundrum%3A+Early+Divergence+and+Later+Ecological+Success+in+the+Early+History+of+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals.</a> Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).</li>
<li>Putnam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemone+genome+reveals+ancestral+eumetazoan+gene+repertoire+and+genomic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization.</a> Science. 317 (5834), 86-94 (2007).</li>
<li>Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis+occurs+via+invagination+not+ingression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression.</a> Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).</li>
<li>Nakanishi, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knockouts+reveal+an+endogenous+role+for+ancient+neuropeptides+in+regulating+developmental+timing+in+a+sea+anemone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone.</a> eLife. 7, e39742(2018).</li>
<li>He, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377(2018).</li>
<li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN+and+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nature Communications. 5, 5486(2014).</li>
<li>Servetnick, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-mediated+excision+of+Nematostella+brachyury+disrupts+endoderm+development%2C+pharynx+formation+and+oral-aboral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning.</a> Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).</li>
<li>Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-bilaterian+origin+of+the+blastoporal+axial+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer.</a> Nature Communications. 7, 11694(2016).</li>
<li>Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+axis+specification+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).</li>
<li>Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+developmental+potential+along+the+animal-vegetal+axis+in+the+anthozoan+cnidarian%2C+Nematostella+vectensis%2C+is+mediated+by+Dishevelled%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled.</a> Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).</li>
<li>Shinzato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Acropora+digitifera+genome+to+understand+coral+responses+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change.</a> Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).</li>
<li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+jellyfish+Aurelia+and+the+evolution+of+animal+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).</li>
<li>Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+a+reef-building+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).</li>
<li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+efficiently+induce+gene+knockout+with+low+mosaicism+in+the+hydrozoan+Clytia+hemisphaerica+through+microhomology-mediated+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.</a> Scientific Reports. 8, 11734(2018).</li>
<li>Artigas, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gonad-expressed+opsin+mediates+light-induced+spawning+in+the+jellyfish+Clytia%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia.</a> eLife. 7, e29555(2018).</li>
</ol>

El autor no tiene nada que revelar.

Aquí se describe un protocolo basado en PCR para genotipo un solo embrión de anémonas de mar sin sacrificar al animal. Después del desove y la desgelatina, los huevos fertilizados se pueden convertir en gastrulas. La región aborta de cada embrión de gastrula se extrae quirúrgicamente, y el tejido aboral aislado se utiliza para la extracción genómica posterior de ADN, mientras que los embriones post-cirugía restantes sanan y continúan el desarrollo. Los extractos de ADNG se utilizan para un ensayo de PCR para determinar e...

Los cnidarios representan un grupo diverso de animales que incluyen medusas, corales y anémonas de mar. Son diploblasts, compuestos de ectodermo y endoderm que están separados por una matriz extracelular (mesoglea). Cnidaria es un grupo hermano de la especia bilateria, al que pertenecen1. modelos animales tradicionales como Drosophila y Mus. Además, se cree que la divergencia Cnidaria-Bilateria ocurrió en el período pre-Cambriano2. Como tal, los estudios comparativos de cnidarios y bilaterianes son esenciales para obtener información sobre la biología de su ancestro común más reciente. Recientemente, la genómica comparativa ha revelado que los cnidarios y bilaterianes comparten muchos genes del kit de herramientas del desarrollo como la muesca y la bHLH, lo que implica que su ancestro común ya tenía estos genes3. Sin embargo, el papel de estos genes del conjunto de herramientas de desarrollo en el último ancestro común de Cnidaria y Bilateria es comparativamente menos bien entendido. Para abordar este problema, es fundamental estudiar cómo funcionan estos genes profundamente conservados en los cnidarios.
Uno de los modelos genéticos cnidarios emergentes es el antozoiano Nematostella vectensis. Su genoma hasido secuenciado 3, y una variedad de herramientas genéticas, incluyendo el derribo genético mediado por morpholino, la transgénesis mediada por meganucleasas y los knockins y knockouts de genes mediados por CRISPR-Cas9, ahora están disponibles para su uso en este animal. Además, el desarrollo de Nematostella es relativamente bien entendido. Durante la embriogénesis, la gastrulation se produce por invaginación4,y el embrión se convierte en una larva de planula de natación libre. La planula posteriormente se transforma en un pólipo sésil con boca y tentáculos circunportales. El pólipo entonces crece y alcanza la madurez sexual.
La mutagénesis dirigida mediada por CRISPR-Cas9 se utiliza ahora de forma rutinaria para estudiar la función génica en Nematostella vectensis5,6,7,8,9. Para generar mutantes noqueadores en Nematostella, un cóctel que contiene ARN de una sola guía específicos de locus y la proteína endonuclease Cas9 se inyecta primero en huevos no fertilizados o fertilizados para producir animales fundadores de F0 que normalmente muestran Mosaicism. Los animales F0 son posteriormente elevados a la madurez sexual y cruzados entre sí paraproducir una población de F1, un subconjunto de los cuales pueden ser mutantes nocaut 6. Alternativamente, los animales F0 sexualmente maduros se pueden cruzar con animales de tipo salvaje para generar animales heterocigotos F1, y los heterocigotos F1 que llevan un alelo knockout en el locus de interés se pueden cruzar entre sí para producir descendencia F2, una cuarta parte de los cuales se espera que sean mutantes nocaut5. Ambos enfoques requieren un método para identificar mutantes noqueantes de una población genéticamente heterogénea. Los tentáculos de pólipos se pueden utilizar para extraer ADN genómico para el genotipado6,7. Sin embargo, en los casos en que se está investigando la función de desarrollo del gen de interés y los embriones mutantes no alcanzan la etapa de pólipos (es decir, debido a la letalidad larvaria asociada con la mutación), los mutantes noqueantes deben ser identificados al principio de la ontogenia. Aquí se describe un protocolo basado en PCR para genotipo de animales individuales en la etapa de gastrula sin sacrificar al animal, que permite la identificación de mutantes noqueadores de una población genéticamente heterogénea de embriones. La duración de todo el proceso de genotipado depende del número de embriones a ser examinados, pero requiere mínimamente 4-5 h.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Peltier Incubadora refrigerada</td><td>Shellab</td><td>SRI6PF</td><td>Se utiliza para la inducción del desove</td></tr><tr><td>Sal marina oceánica instantánea Océano</td><td>instantáneo</td><td>138510</td><td></td></tr><tr><td>Quistes de camarones en salmuera</td><td>Aquatic Eco-Systems, Inc.</td><td>BS90</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de L-cisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital estándar, modelo 3500</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCl, 1M, pH8.0</td><td>CALIDAD BIOLÓGICA</td><td>351-007-01</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>VWR</td><td>BDH9258</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M pH8</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40 Sustituto</td> US <td>Biológico</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K solución (20 mg/mL), grado de ARN</td><td>ThermoFisher</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>VWR</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>Micro Portaagujas de disección</td><td>Roboz</td><td>RS-6060</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de disección de tungsteno</td><td>Roboz</td><td>RS-6063</td><td></td></tr><tr><td>PCR Eppendorf Mastercycler Termocicladores</td><td>Eppendorf</td><td>E6336000024</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>GLWamide imprimación</td><td></td><td></td> universal directa <td>5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3'</td></tr><tr><td>Imprimación inversa específica para glw-a</td><td></td><td></td><td>5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3'</td></tr><tr><td>Imprimación inversa específica para glw-c </td><td></td><td></td><td>5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3'</td></tr></tbody></table>

genotipado de anémona sin mar durante el desarrollo temprano

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Aquí se describe un protocolo basado en PCR para genotipo el embrión de la etapa de gastrula del anthozoiano cnidario Nematostella vectensis sin sacrificar la vida del animal. Después de la fertilización in vitro y la desgelatina, se permite que los cigotos se desarrollen durante 24 horas a temperatura ambiente para llegar a la etapa de gastrula temprana a media. Los embriones de gastrula se colocan en un lecho de gel de agarosa en un plato de Petri que contiene agua de mar. Bajo el microscopio de disección, se utiliza una aguja de tungsteno para separar quirúrgicamente un fragmento de tejido abortivo de cada embrión. Los embriones post-cirugía se les permite sanar y continuar el desarrollo. El ADN genómico se extrae del fragmento de tejido aislado y se utiliza como plantilla para PCR específico del locus. El genotipo se puede determinar en función del tamaño de los productos PCR o de la presencia/ausencia de productos PCR específicos de alelos. Los embriones post-cirugía se clasifican según el genotipo. La duración de todo el proceso de genotipado depende del número de embriones a examinar, pero requiere mínimamente 4-5 h. Este método se puede utilizar para identificar mutantes noqueantes de una población genéticamente heterogénea de embriones y permite analizar fenotipos durante el desarrollo.

El genoma de Nematostella tiene un único locus que codifica una proteína precursora para el neuropéptido GLWamida. Tres alelos mutantes noqueados en este locus (glw-a, glw-b, y glw-c) se han reportado previamente5. Cuatro machos heterocigotos que llevaban un alelo de tipo salvaje (+) y un alelo de nocaut enel locus GLWamide (genotipo: +/glw-c)fueron cruzados con una ...

El objetivo de este protocolo es genotipo la anémona de mar Nematostella vectensis durante la gastrulación sin sacrificar el embrión.

Genotipado de anémona sin mar durante el desarrollo temprano

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Este protocolo permite a un investigador identificar anémonas de mar mutantes durante la embriogénesis temprana para que se pueda analizar el fenotipo post-embrionario del desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para genotipo de anémonas de mar individuales al principio de la ontogenia sin sacrificar la vida del animal. Demostrar este procedimiento estará Miguel Silva, un estudiante graduado de mi laboratorio.El día antes de la inducción de desove, coloque la anémona nematostella vectensis en una incubadora controlada por temperatura y luz, programando la incubadora para que los animales estén expuestos a ocho horas de luz a 25 grados centígrados. Al día siguiente, retire los animales de la incubadora y déjelos en una mesa de sobremesa a temperatura ambiente con la luz encendida para permitir el desove, que ocurrirá dentro de la siguiente y media a dos horas. Use una pipeta de transferencia que se corta la punta para agrandar la abertura y colocar los paquetes de óvulos del recipiente femenino en un recipiente macho que contenga espermatozoides y dejarlos en el recipiente masculino durante al menos 15 minutos para permitir la fertilización.Después de la fertilización, para dejarlly los paquetes de huevos, colóquelos en agua de mar que contiene 3% de cisteína en un plato de Petri de vidrio y agitar suavemente en una coctelera durante 12 minutos. A continuación, romper los grumos con una pipeta de plástico y seguir agitando durante otros dos a tres minutos hasta que se deje completamente. Mantenga los huevos fertilizados en el mismo plato a 16 grados centígrados o a temperatura ambiente.Al día siguiente, prepare el tampón de extracción de ADN como se describe en el manuscrito, mezcle bien por vórtice y aliquotlo en tubos de PCR añadiendo 20 microlitros a cada tubo. Disolver 1% de agarosa en agua de mar, verter en un plato de Petri para cubrir la parte inferior, y enfriar en una parte superior de banco para hacer un lecho de gel. Cubra el lecho de gel con agua de mar fresca.Transfiera embriones post-fertilización las 24 horas utilizando una pipeta en el plato Petri que contiene el lecho de gel de agarosa. Inserte una aguja de tungsteno en un soporte de necesidad y esterilizar sumergiendo su punta en alcohol y colocándola en llamas para quemar el alcohol. Bajo un microscopio diseccionado, haz una depresión en la agarosa usando la aguja de tungsteno para extraer un pedazo de agarosa superficial del tamaño de un embrión que se va a manipular.A continuación, utilizando la aguja de tungsteno, coloque el embrión en la depresión con su lado lateral hacia abajo con el fin de restringir el movimiento del embrión para la microcirugía. Para realizar una cirugía exitosa, es fundamental restringir el movimiento del embrión. Con la aguja de tungsteno, retire quirúrgicamente un pedazo de tejido aboral a lo largo del eje aboral oral, situado frente a la abertura blastoporal oral.Con una pipeta P20, transfiera el tejido aboral aislado a un tubo pcR que contenga 20 microlitros de tampón de extracción de ADN. Transfiera el embrión post-cirugía en un pozo de una placa de 24 pozos que contenga al menos 500 microlitros de agua de mar fresca. Y coloque la placa que contiene embriones post-cirugía en una incubadora a 16 grados Celsius hasta que se complete el genotipado.Para extraer ADN genómico de embriones individuales, primero gire brevemente por los tubos de PCR que contienen el tampón de extracción de ADN y los tejidos embrionarios aislados utilizando una mini centrífuga. Luego incubar los tubos a 55 grados Celsius durante tres horas mientras vórtice durante 30 segundos cada 30 minutos para asegurar la ruptura de los grumos celulares y mejorar la lelisis celular. Después de inactivar la proteinasa K a 95 grados Celsius durante cuatro minutos, configure una reacción PCR utilizando ADN genómico extraído como plantilla para amplificar el locus de interés.Diseñe las imprimaciones deseadas como se describe en el manuscrito. Configure una reacción PCR de 20 microlitros. Después de completar la PCR, ejecutar la electroforesis de gel de agarosa para determinar el tamaño y la presencia o ausencia de productos pcR, asegurándose de ajustar el estado de la electroforesis de gel de agarosa dependiendo del tamaño esperado de los productos de PCR.Utilice los resultados de la PCR con respecto al tamaño y la presencia o ausencia o los productos de PCR para asignar un genotipo a cada embrión postquirúrgico y luego clasificar los embriones según su genotipo. El genoma de la nematostella tiene un solo locus que codifica una proteína precursora para el neuropéptido, GLWamida. Tres alelos mutantes noqueantes en el locus han sido reportados previamente.La PCR es el resultado de embriones muestreados aleatoriamente entre la progenie de un cruce de F1 entre una hembra heterocigota que lleva un alelo noqueador A y los machos heterocigotos que llevan un alelo C knockout muestran diferentes genotipos. Los embriones uno y dos muestran una sola banda de PCR correspondiente al tamaño esperado de A knockout allele. Embryos tres y seis muestran dos bandas de PCR con los tamaños esperados para alelos noqueados A y C.Embryos cuatro, siete y ocho muestran una sola banda de PCR correspondiente al tamaño esperado de alelo C knockout.Embryo 5 no muestra bandas, lo que sugiere la falta de unión de imprimación. Para descartar la posibilidad de fallo genómico de extracción de ADN, se ejecutó otra PCR utilizando una imprimación inversa que puede unirse a la secuencia de tipo salvaje. Cuando se detectó un producto de PCR de un tamaño esperado, la extracción de ADN genómico tuvo éxito.Mientras que ningún producto sugirió un fallo en la extracción. Aunque este protocolo está diseñado para embriones de anémonas de mar, seguro que es posible aplicar este método a otros cnidarios, como corales y medusas, donde la información genómica y los embriones son accesibles. Después de este procedimiento, los mutantes identificados se utilizan para evaluar el fenotipo del desarrollo.Por ejemplo, las técnicas histológicas como la inmunostaining se pueden utilizar para evaluar defectos en la morfología, mientras que la hibridación in situ, la RT-PCR cuantitativa en tiempo real y el ARN-seq se pueden utilizar para evaluar defectos en la expresión génica. Además, las imágenes en vivo se pueden utilizar para evaluar defectos en el comportamiento durante el desarrollo post-embrionario, como en larvas o en pólipos tempranos.

genotyping-of-sea-anemone-during-early-development

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

La microinyección es una técnica común que se utiliza para entregar construcciones de ADN, ARNm, oligonucleótidos antisentido morfolino u otros tratamientos en los huevos, embriones y células de diversas especies.

High Throughput microinyecciones de Sea Urchin cigotos

El hawaiensis anfípodo Parhyale es un organismo modelo prometedor para los estudios de embriología y desarrollo de artrópodos crustáceos comparativa y evolución. Este protocolo describe un método para la extracción manual de blastómeros individuales a partir de embriones en estadio de división primeros de Parhyale.

Ablación de una sola célula de ocho células de embriones de los crustáceos anfípodos<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Los métodos que producen embriones morphant son esenciales para estudiar los mecanismos de desarrollo y redes reguladoras de genes. La estrella de mar patiria miniata es un sistema modelo emergente para estos estudios. Aquí se presenta un protocolo para la obtención de gametos, la producción de cultivos de embriones, y la rápida microinyección de cigotos de esta especie.

Un método para la microinyección de Patiria minata Los cigotos

El objetivo de este protocolo es proporcionar a los usuarios un conjunto de métodos para la desencapsulación de alto rendimiento de embriones y larvas de Lymnaea stagnalis en preparación para la hibridación in situ de montaje completo, y para posteriores tratamientos de pre y post-hibridación.

A todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; Método de hibridación para el molusco gasterópodo<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Aquí demostramos cómo inducir y monitorizar la regeneración en la anémona de mar estrellada Nematostella vectensis, un antozoo cnidario modelo.  Demostramos cómo amputar y categorizar la regeneración utilizando un sistema de estadificación morfológica, y utilizamos este sistema para revelar un requisito para la autofagia en la regeneración de estructuras de pólipos.

Inducir completa Pólipo regeneración de la aboral Physa de la anémona de mar Starlet Vectensis Nematostella

Este artículo de vídeo detalla una sencilla metodología vivo que se puede utilizar para caracterizar de manera sistemática y eficiente los componentes de las vías de señalización complejos y las redes de regulación en muchos embriones de invertebrados en.

El poder de la simplicidad: Erizo de mar como embriones<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelos de desarrollo para el estudio celular de la célula-a-complejo de señalización de red Interacciones

El objetivo de este protocolo es realizar la hibridación en situ en adultos muestras de corales que han sido incrustadas en parafina y seccionadas en portaobjetos de vidrio. Se trata de un método cualitativo utilizado para visualizar la expresión espacial de una sonda de RNA anti sentida en tejidos embebidos en parafina.

In Situ Técnicas de hibridación para muestras de corales adultos parafinadas

Este protocolo permite la visualización de la expresión génica en embrionario Astyanax cavefish. Este enfoque ha sido desarrollado con el objetivo de maximizar la señal de la expresión del gene, minimizando tinción de fondo inespecífica.

Wholemount hibridación In Situ de embriones de Astyanax

Este trabajo describe un protocolo de semi-alto rendimiento que permite imágenes simultáneas de lapso de tiempo 3D de embriogénesis en embriones de 80-100 C. elegans en una sola carrera nocturna. Además, se incluyen herramientas de visualización y procesamiento de imágenes para agilizar el análisis de datos. La combinación de estos métodos con cepas de reportero personalizadas permite un seguimiento detallado de la embriogénesis.

Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

Aquí, describimos un protocolo para obtener extracto de veneno crudo de la anémona de mar y detectar su actividad hemolítica y fosfolipasa.

Identificación de la actividad hemolítica y fosfolipasa en extractos crudos de anémonas de mar mediante bioensayos sencillos

Se presenta un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (X-ChIP) contra la marca de histonas H3K4me3 para el organismo modelo Exaiptasia diaphana . La especificidad y la eficacia del ensayo se confirman mediante PCR cuantitativa y secuenciación de nueva generación. Este protocolo permite aumentar la investigación de las interacciones proteína-ADN en la anémona de mar E. diaphana.

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Aprende a genotipar Nematostella vectensis durante la gastrulación sin sacrificar el embrión. Esta técnica permite identificar mutantes temprano y estudiar fenotipos postembrionarios en biología del desarrollo.

Genotipado de anémona sin mar durante el desarrollo temprano

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