Name: Generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprende a generar organoides de conductos biliares extrahepáticos de ratón para estudiar biología de colangiocitos y regeneración tisular. Este método reproducible permite cultivar células epiteliales polarizadas en laboratorios sin acceso a tejidos humanos.

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Este trabajo fue apoyado por la Asociación Americana para el estudio del hígado enfermedades Pinnacle Premio (N.R.) y los institutos nacionales de salud, Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón (premios DK34933 P30 a N.R., DK062041 P01 a J.L.M.). Agradecemos al Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (Universidad de Michigan) por su ayuda con el desarrollo de esta metodología.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Michigan.
1. preparación de equipos y materiales para el aislamiento de EHBD de ratón
<ol><li>Preparar el medio de siembra y tampón de lavado (Tabla de materiales) en 50 mL tubos cónicos y mantenerlos a 4 ° C o en hielo hasta su uso.</li>
	<li>Establecer una mesa de cirugía (figura 1B). Preparar los instrumentos quirúrgicos esterilizados (figura 1).</li>
	<li>Coloque una placa de 24 pocillos estéril en la incubadora de cultivo de tejidos de 37 ° C para pre-calentarlo.</li>
	<li>Colocar una alícuota de la matriz de sótano en el hielo. Matriz de sótano de uso sólo cuando se está completamente licuado.</li>
</ol>2. EHBD aislamiento y cultura organoide biliar
<ol><li>
Aislamiento y la preparación de una suspensión unicelular de ratón EHBD
	<ol>
<li>Eutanasia a un ratón adulto (mayor de 2 meses) según las directrices institucionales. Coloque el ratón en una posición supina. Abrir la cavidad abdominal utilizando un enfoque de línea media y retraer el hígado en el diafragma.</li>
		<li>Identificar el colédoco situado inmediatamente por debajo del hilio hepático tirando suavemente del duodeno proximal con una pinza hemostática. Separar el EHBD de los tejidos circundantes mediante una hoja de bisturí. Sosteniendo el extremo proximal del conducto biliar común con el fórceps, disecar distalmente justo por encima de su unión con el duodeno, luego diseccionar el extremo proximal del conducto del hígado (figura 1). Coloque inmediatamente EHBD aislado (Figura 1E) en tampón de lavado frío.</li>
		<li>Quitar el EHBD de la solución tampón de lavado y pique en secciones de 0,5 mm con una hoja de bisturí estéril. Coloque el tejido en una placa de cristal sobre hielo durante el procedimiento (figura 1B).</li>
		<li>Coloque las secciones EHBD en un tubo conteniendo 500 μl de tampón de la disociación. Incubar por 20 min a 37 ° C. Neutralizar el búfer de disociación por agregar 500 μl de medio de cultivo celular helada.</li>
		<li>Triturate la suspensión celular y progresar a través de agujas de 18 G y 20 G, 20 veces cada uno. Filtrar la suspensión de células a través de un tamiz de célula μm 70 y recogen el flujo a través de un tubo de 50 mL. Nota: Pre-condición de la coladera con 500 μl de tampón fosfato salina (PBS) antes del filtrado para facilitar el paso de la suspensión de células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Establecer EHBD organitas
	<ol>
<li>Centrífuga del flujo a través del paso 2.1.5 a 300 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Retire con cuidado el sobrenadante. Resuspender las células en 1 mL de PBS estéril helada. Transferir la resuspensión en un nuevo tubo de 1,5 mL. Repita el paso 2.2.1.</li>
		<li>Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante de células lavadas recogidas en la parte inferior del tubo. Resuspender el precipitado de células en 120 μl de matriz sótano helado licuado mediante pipeteo arriba y abajo utilizando puntas P200. Nota: Resuspensión de pellet celular en matriz de sótano tiene que realizarse en baño de hielo.</li>
		<li>Placa de 40 μl de la resuspensión de células en la matriz de sótano en el centro de un pozo en una placa de 24 pocillos precalentado. Nota: Evitar aspirar aire mientras manipula la matriz de sótano para evitar formación de burbujas.</li>
		<li>Devolver la placa con las células suspendidas en la matriz del sótano a la incubadora de cultivo de tejidos de 37 ° C durante 15 minutos o hasta que se solidifica matriz de sótano. Añadir 600 μl del medio de siembra calentado a 37 ° C en cada pocillo (Tabla de materiales). Devuelva la placa a la incubadora de 37 ° C cultivo de tejidos.</li>
		<li>Reemplazar el medio de siembra con 600 μl de medio de cultivo fresco organoide en 3 días y posteriormente cada 3 días. Vigilar crecimiento organoide con un microscopio invertido. Organoides de uso para una aplicación aguas abajo o dividir cada 7 a 9 días antes de la acumulación de colapso de desechos y organoide intramural se observan (figura 2A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EHBD organoide pasaje y almacenaje
<ol><li>
Paso de organoides EHBD 1:3 1:4 cada 7 a 9 días
	<ol>
<li>Retire el medio del pozo y añadir 400 μL de PBS helado. Resuspender el organitas transfiriendo suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo 10 veces en el pozo. Transfiera la mezcla a un tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Paso la mezcla a través de una aguja de 25 G 4 veces para disociar el organitas. Centrifugar la mezcla a 400 x g durante 4 min a 4 ° C.</li>
		<li>Retire con cuidado el sobrenadante y resuspender las células en la matriz del sótano (1:3 1:4) para el cultivo de otras (paso 2.2.4.) o lavar las células con PBS frío hielo para su posterior procesamiento. Nota: Por lo general, 250-300 células se platean en la placa de 24 pocillos para aplicaciones posteriores. Eficiencia de la galjanoplastia se puede evaluar por microscopía de campo brillante usando un microscopio invertido en el día 3-5 después de pases contando el número de organoides y calculando su porcentaje del número inicial de la célula. mRNA puede ser aislada de EHBDOs lavadas en PBS utilizando el protocolo estándar mediante extracción del tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Almacenamiento a largo plazo de EHBD organitas
	<ol>
<li>Retire el medio del pozo y lave los organoides con temperatura PBS. Quitar PBS desde el pozo sin molestar a la caída de la matriz de sótano.</li>
		<li>Añadir 500 μl de celda helada congelación medio al pozo. Resuspender el organitas en matriz de sótano licuado y medio de congelación de la célula y transferir la mezcla en los frascos criogénicos.</li>
		<li>Almacenar los frascos a-80 ° C por 48 h. transferencia los frascos a un tanque de nitrógeno para almacenamiento a largo plazo en una fase de vapor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EHBD organoide utilizar para inclusión en parafina
<ol><li>Suspender las EHBDOs en 500 μl de PBS helado (4 ° C) mediante pipeteo arriba y abajo de 5 a 10 veces. Recoger EHBDO resuspendido en matriz de sótano licuado en un tubo de 1,5 mL. Nota: Para evitar romper organoides, cortar la parte inferior 2-3 mm de una punta de P1000 y quite con cuidado el sobrenadante.</li>
	<li>Centrifugadora EHBD organoides en 350 x g durante 5 minutos Retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar el pellet organoide.</li>
	<li>Añadir 1 mL de helado 4% paraformaldehido (PFA) a los organoides e incubar el organitas en 4% PFA durante la noche a 4° C. Quitar 4% PFA de los organoides usando una punta de P1000 después de la incubación durante la noche.</li>
	<li>Añadir 1000 μl de PBS de temperatura en el tubo con los organoides e incubar 5 min a temperatura ambiente (RT). Centrifugar el tubo con organoides en PBS a 350 x g por 5 min, repetir este proceso dos veces más.</li>
	<li>PBS de quitar y añadir 1 mL de etanol al 30% a los organoides. Incubar por 5 min a TA.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 350 x g durante 5 minutos a quitar RT. 30% etanol. Añadir 1 mL de etanol al 70% e incubar 5 min a TA.</li>
	<li>Centrifugado a x 350 g de etanol al de 70% 5 minutos quitar. Añadir 1 mL de etanol al 100% e incubar 5 min a TA. Nota: Organoides pueden ser guardadas en etanol 100% a temperatura ambiente durante un máximo de 48 h antes de proseguir.</li>
	<li>Calor gel procesamiento de muestra en el microondas por 20 s o hasta que el licuado. Añadir 50 μl de muestra, procesamiento de gel en el tubo con organoides. Coloque el tubo en hielo hasta que se solidifican el procesamiento gel de las muestras.</li>
	<li>Quitar la gota de gel con organoides del tubo de procesamiento de las muestras y colocar entre las almohadillas de esponja azul en un cassette para el procesamiento posterior en el procesador de tejidos. Utilizar 15 minutos para cada paso en el embebido de parafina durante el procesamiento posterior...</li>
	<li>Sección organitas parafina-encajado en procesamiento de muestras gel a 4 μm. proceder con immunohistochemical que manchaba como se describió anteriormente16.</li>
</ol>

<ol><li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholangiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li>
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<li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li>
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<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tree+stem%2Fprogenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts%3A+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li>
<li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses que compiten.

Este trabajo describe la generación de un modelo de 3 dimensiones organotypic de ratón cholangiocytes EHBD. Pasos importantes en la generación de cultura EHBDO incluyen la disección meticulosa de EHBD para evitar la contaminación de células de páncreas, mantenimiento de condiciones estériles para evitar la contaminación bacteriana y fúngica y manipulación cuidadosa después de la centrifugación para evitar la pérdida de material celular. Se requiere una adhesión estrecha a las condiciones de temperatura descrito. Existen ...

Cholangiopathies son incurables crónica trastornos progresivos que afectan las células biliares en intra y conductos biliares extrahepáticos (EHBDs)1. Algunos cholangiopathies, como colangitis primaria esclerosante, colangiocarcinoma, atresia biliar y quistes coledocales, afectan predominante a EHBDs. Desarrollo de terapias de cholangiopathies está restringida por la limitada disponibilidad de modelos preclínicos. Además, estudios previos enfocados cholangiopathies agrupados: hígado, intra y EHBDs. Sin embargo, intra - y EHBDs tienen un origen embrionario distinto y, por lo tanto, deben considerarse como patologías moleculares distintas. Conductos biliares intrahepáticos se convierten de las placas ductales intrahepáticas y la parte craneal del divertículo hepático, todo EHBDs se convierten de la parte caudal del divertículo hepático2. También cuentan con compartimientos de célula progenitora diferente para homeostasis del adulto, incluyendo los canales de Hering en conductos biliares intrahepáticos y glándulas peribiliary en EHBDs2,3. Uso de modelos animales para estudios preclínicos es limitado por gastos y debe reducirse al mínimo por razones éticas. Por lo tanto, reduccionista, tiempo, reproducible y costo-eficientes modelos in vitro son altamente deseables.
Mayoría de los estudios previa de cholangiopathies utilizados normal del ratón o rata cáncer modelos o colangiocarcinoma humana líneas de células derivadas de intra - y EHBDs4,5,6,7. Sin embargo, estos son los modelos de las células transformadas y no recapitular cholangiocyte normal biología en homeostasis o en un estado saludable. Recientes avances en el desarrollo de modelos de cultura organotypic ha permitido el desarrollo de estructuras 3-dimensionales de tipos de diferentes tejidos, incluyendo tejidos Hepatobiliar, aunque no normal del ratón EHBDs8,9, 10. Estos "órganos" estructuras destinadas a mímico primario del tejido y se cultivan en un nicho artificial apoyando la auto-renovación de las células progenitoras de órgano-específica11.
"Organoide" es un amplio término que más comúnmente se describe modelos de 3 dimensiones del tejido derivados de células madre. Organoides pueden generarse de reprogramadas pluripotentes células madre había representada por las células madre embrionarias e inducida por células madre pluripotentes. También puede generarse a partir de las células madre órgano-específicas12. Se han propuesto algunos modelos de organoide de cholangiocyte en anteriores estudios. Así, organoides derivados de células madre pluripotentes humanas han sido reportados7,9,13 y proporcionan una herramienta eficiente de valioso, tiempo que permite la generación simultánea de diferentes tipos de células. Sin embargo, estos organoides derivados de células madre pluripotentes no reflejan plenamente la estructura y funcionalidad de primaria adultos cholangiocytes EHBD.
Organoides derivan de las células madre adultas de la humana9 y felino10 hígado también fueron propuestos. Modelos felinos no están ampliamente disponibles y tienen un limitado arsenal de herramienta para fines de estudio. Por otra parte, estos organoides de derivados de células madre adultas de derivados hígado no modelo cholangiocytes extrahepática pero cholangiocytes algo intrahepática.
Generación de organoide EHBD informó de humano normal EHBDs14 y ratón EHBD colangiocarcinoma15. Sin embargo, acceso a tejido EHBD humano es extremadamente limitado, y organoides derivados de un modelo murino genético de colangiocarcinoma15 no representan biología de cholangiocyte saludable en homeostasis y se derivan de las células genéticamente modificadas.
Para hacer frente a las limitaciones de pluripotent derivadas de células madre y hígado cholangiocyte organoide modelos y el acceso limitado a los tejidos humanos en modelos preclínicos, hemos desarrollado un modelo murino de organoide EHBD (figura 1A). Este manuscrito describe el desarrollo de una técnica para ratón organitas EHBD derivadas de tejido adulto. Estos organoides EHBD llamados EHBDOs será una importante herramienta en vitro para el estudio de los mecanismos subyacentes a EHBDs cholangiocyte homeostasis y enfermedad procesos como cholangiopathies.

<table><tbody><tr><td><fuerte>L-WRN medio de cultivo celular</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>avanzado DMEM/F12</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>1%</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td><fuerte>tampón de lavado</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>50 mL</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>125 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Anfotericina B&nbsp;</td><td>6.25 y micro; g/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15290-018</td></tr><tr><td><fuerte>Medio de cultivo de organoides</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-WRN Medio acondicionado&nbsp;</td><td>1:1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td></tr><tr><td>DMEM/F12 avanzado</td><td>1:1</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>N-glutamina</td><td>10 y micro; l/mL</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td></tr><tr><td>N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano ácido sulfónico, HEPES</td><td>10 mM</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td></tr><tr><td>B27</td><td>10 &micro; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td></tr><tr><td>N2</td><td>10 &micro; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td></tr><tr><td><fuerte>Medio de siembra de organoides</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo de organoides&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico (EGF)</td><td>50 ng/mL</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos-10 (FGF10)</td><td>100 ng/mL</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos primarios</</td>anti-citoqueratina 19 (CK19) fuerte> <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo, conejo</td><td>1:250</td><td>Abcam</td><td>ab53119</td></tr><tr><td>Región determinante del sexo Anticuerpo Y-Box 9 (SOX9), Conejo</td><td>1:200</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20095</td></tr><tr><td>Anticuerpo Homeobox 1 (PDX1) duodenal pancreático, Conejo</td><td>1:2000</td><td>DSRB</td><td>F109-D12</td></tr><tr><td>Anticuerpo E-cadherina, Cabra</td><td>1:500</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-31020</td></tr><tr><td>Anticuerpo acetilado &alfa;-tubulina, Ratón</td><td>1:500</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td></tr><tr><td>Anticuerpos</td><td></td><td></td> secundarios<td></td></tr><tr><td>488 etiquetados como anti-conejo, Burro IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td></tr><tr><td>594 etiquetados como anti-cabra, Burro IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11058</td></tr><tr><td>568 etiquetados como anti-ratón, Cabra IgG2b</td><td>1:500</td><td>Invitrogen</td><td>A-21144</td></tr><tr><td>TopFlash Wnt ensayo</td><td></td><td></td><td></td> reportero</tr><tr><td><fuerte>línea celular TopFlash HEK293</fuerte></td><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td></tr><tr>Kit <td></td> de<td>ensayo de luciferasa</td><td>Biotium</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td></tr><tr><td>0.4% Trypan Blue Solution</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td></tr><tr><td>Materiales y reactivos adicionales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matriz basal, Matrigel</td><td></td> sin fenol<td>CORNING</td><td>356237</td></tr><tr><td>Tampón de disociación, Accutase</td><td></td><td>Gibco</td><td>A1110501</td></tr><tr><td>Medio de congelación de cultivo celular, Recovery</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12648010</td></tr><tr><td>Filtro celular (70 y micro; m, estéril)</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td></tr><tr><td>Extracción de ARN de tiocianato-fenol de guanidinio, TRIzol</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td></tr><tr><td>Gel de procesamiento de muestras, HistoGel</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td></tr><tr><td>Kit</td><td></td> universal de detección de micoplasma <td>ATCC</td><td>30-1012K</td></tr><tr>Tubo <td></td> de<td>microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td></tr><tr>Placa <td></td> de<td>24 pocillos</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7524</td></tr><tr><td>Tubo centrífugo cónico de 50 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-432-22</td>Microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse E800 Microscopio invertido Biotium 30003-2 Bandeja de necropsia Fisherbrand 13-814-61 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, que afectan a los conductos biliares extrahepáticos (EHBDs), incluyen la atresia biliar, la colangitis esclerosante primaria y colangiocarcinoma. No tienen ninguna opciones terapéuticas eficaces. Herramientas para el estudio de EHBD son muy limitadas. Nuestro propósito fue desarrollar un modelo de cholangiocyte preclínicos, derivadas de células madre órgano-específicas, versátil, adultos que se puede generar fácilmente de tipo salvaje y de ratones modificados genéticamente. Así, nos informe sobre la nueva técnica de desarrollo de un sistema de cultivo de organoides (EHBDO) EHBD de EHBDs de ratón adulto. El modelo es costo-eficiente, capaz de ser analizado fácilmente, y tiene múltiples usos aguas abajo. Específicamente, se describe la metodología de aislamiento de EHBD de ratón y disociación unicelular, organoide cultura iniciación, propagación y mantenimiento a largo plazo y almacenamiento. Este manuscrito también describe EHBDO procesamiento por inmunohistoquímica, microscopía fluorescente y cuantificación de abundancia del mRNA por reacción en cadena de polimerasa de transcripción reversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Este protocolo tiene ventajas significativas además de producir organoides específicos EHBD. El uso de un medio condicionado de las células L-AVS reduce significativamente el costo de este modelo. El uso del ratón EHBDs proporciona tejido casi ilimitado para la generación de cultura, a diferencia de los tejidos humanos. EHBDOs ratón generados contienen una población pura de células epiteliales con marcadores del progenitor endodérmico y biliares células diferenciadas. Organoides cultivadas mantienen morfología homogénea a través de múltiples pasos y pueden ser recuperados después de un período de almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido. El modelo permite el estudio de la proliferación celular biliar del progenitor, se puede manipular farmacológicamente y puede generarse a partir de ratones modificados genéticamente. Se necesitan futuros estudios para optimizar las condiciones de cultivo con el fin de aumentar la eficiencia de la galjanoplastia, evaluar la madurez funcional de la célula y diferenciación celular directa. Desarrollo de modelos de co-cultivo y una matriz extracelular biológicamente más neutral son también deseables.

Nuestro protocolo describe la generación de ratón EHBD organoides que son específicas de tejido y derivados de la célula de vástago del adulto. Después de los organoides se cultivan, la formación de una estructura enquistada puede observarse tan pronto como 1 día después del aislamiento de EHBD. Contaminación con fibroblastos no se observa normalmente durante la generación de cultura. EHBDO eficacia de la galjanoplastia es aproximadamente el 2% cuando están aisladas de neonatal o de adult...

Este protocolo describe la producción de un sistema de 3 dimensiones organoide ratón vía biliar extrahepática. Estos organoides biliares se pueden mantener en cultivo a estudiar biología de cholangiocyte. Organoides biliares expresan marcadores de progenitoras y células biliares y están compuestas de células epiteliales polarizadas.

Generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Este sistema organoide de conductos biliares extrahepático murino puede abordar el acceso limitado a los modelos de colangiopatías preclínicos y las limitaciones de las células madre pluripotentes y los modelos organoides de colangiocito derivados del hígado. Nuestro modelo es específico de tejido adulto, reduccionista, reproducible y de tiempo y costo y rentable. Será de especial beneficio para los laboratorios que no tienen acceso a los tejidos humanos.Nuestra técnica permite el cultivo de un número casi ilimitado de colangiocitos extrahepáticos de los conductos biliares para estudiar la regeneración tisular y las interacciones de célula a célula. Demostrando el procedimiento estará Junya Shiota, un post-doc de mi laboratorio. Para el aislamiento intrahepático del conducto biliar, coloque el ratón adulto en una posición supina y abra la cavidad abdominal a lo largo de la línea media.Retirar el hígado para descansar sobre el diafragma y utilizar un hemostat para tirar suavemente del duodeno proximal para revelar el conducto biliar común inmediatamente debajo del hilo hepático. Usa un bisturí para separar el conducto biliar extrahepático de los tejidos circundantes. Sosteniendo el

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Una técnica para aislar cholangiocytes de los conductos biliares extrahepáticos de ratones recién nacidos se describe. Los conductos están meticulosamente disecados, y luego las células se aíslan por consecuencia en geles de colágeno gruesas. Este método proporciona una herramienta útil para el estudio del desarrollo de vías biliares extrahepáticas y patología.

Aislamiento de Neonatal extrahepática cholangiocytes

El método de cultivo en tres dimensiones se describe en este protocolo recapitula el desarrollo del páncreas a partir de progenitores páncreas de ratón embrionarias dispersas, incluyendo su expansión sustancial, diferenciación y morfogénesis en un órgano ramificada. Este método es susceptible de formación de imágenes, la interferencia funcional y la manipulación del nicho.

In Vitro Páncreas Organogenesis de dispersos embrionarios de ratón Progenitores

Presentamos un método bastante simple y sensible para la cuantificación precisa de la densidad de las vías biliares en el hígado del ratón. Este método puede ayudar a determinar los efectos de los modificadores genéticos y ambientales y la eficacia de las terapias potenciales en modelos de ratón de enfermedades biliares.

Determinación de la densidad del conducto biliar en el hígado del ratón

Mostramos un método para la necropsia y la disección de modelos de cáncer de próstata de ratón, centrándose en la disección tumoral de próstata. También se presenta un protocolo paso a paso para la generación de organoides tumorales de próstata de ratón.

Generación de organoides tumorales a partir de modelos de ratón de ingeniería genética del cáncer de próstata

Los sistemas celulares tridimensionales (3D) son modelos relevantes para investigar la organogénesis. Se propone un método basado en hidrogeles para la producción de quistes biliares y su caracterización. Este protocolo desentraña las barreras de la caracterización 3D, con un método sencillo y confiable para evaluar la eficiencia de la formación de quistes, los tamaños y para probar su funcionalidad.

Generación y caracterización cuantitativa de quistes epiteliales biliares funcionales y polarizados

Se estableció un sistema de cultivo de organoides 3D ex vitro a largo plazo a partir de hepatocitos de ratón. Estos organoides pueden ser atravesados y manipulados genéticamente por infección por lentivirus de construcción shRNA/ectópica, transfección de siRNA e ingeniería CRISPR-Cas9.

Establecimiento y manipulación genética de organoides hepatocitos murinos

Para la observación de los trastornos murinos del conducto biliar neonatal, se requiere un conducto biliar intacto y una preparación eficiente. Por lo tanto, se desarrolló con éxito un nuevo enfoque para aislar todo el sistema de vías biliares extrahepáticas en neonatos murinos mientras se mantenía la integridad del conducto biliar.

Disección extrahepática de las vías biliares y la vesícula biliar en neonatos de ratón de nueve días de edad

Este protocolo describe la generación de organoides hepáticos endodérmicos (eHEPOs) rápidos y reproducibles. Con este protocolo, los eHEPOs pueden producirse en 2 semanas y expandirse a largo plazo (más de 1 año) sin perder su diferenciación y funcionalidad.

Generación de organoides hepáticos endodérmicos funcionales

Los organoides generados a partir de los tumores de los pacientes se inyectan ortotópicamente en el hígado del ratón. La resección del tejido hepático no tumoral conduce a un entorno regenerativo en el tejido hepático donde se encuentra el tumor.

Un modelo de xenoinjerto de organoide derivado de pacientes con cáncer hepatocelular para investigar el impacto de la regeneración hepática en el crecimiento tumoral

Este protocolo presenta una técnica optimizada de perfusión hepática de colagenasa en dos pasos en un modelo de rata y muestra el uso de hepatocitos aislados para el cultivo in vitro a largo plazo de organoides 3D.

Perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3D de última generación

Aprende a generar organoides de conductos biliares extrahepáticos de ratón para estudiar biología de colangiocitos y regeneración tisular. Este método reproducible permite cultivar células epiteliales polarizadas en laboratorios sin acceso a tejidos humanos.

Generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón

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