Name: TRAMPA digital de gota (ddTRAP): adaptación del Protocolo de amplificación de repetición de telómeros a la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprende a medir la actividad de la telomerasa con el ensayo ddTRAP utilizando PCR digital en gotas. Este método sensible permite analizar hasta 96 muestras simultáneamente para evaluación estadística robusta.

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Los autores le gustaría reconocer las fuentes de financiación de los institutos nacionales de salud (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). Las líneas de cáncer de pulmón de células pequeñas (SHP77 y H82) fueron un regalo generoso de los doctores John Minna y Adi Gazdar del centro médico del sudoeste de UT.

1. preparación y almacenamiento del búfer
<ol><li>Preparar 50 ml de 1x stock-/DNase-Free NP-40 lisis buffer (Tris-HCl 10 mm [pH 8,0], 1 mm MgCl2, 1 mm ácido ethylenediaminetetraacético (EDTA), 1% [VOL/VOL] NP-40, 10% [VOL/VOL] glicerol, 150 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoetanol, y 0,1 mm 4- clorhidrato de fluoruro de Bencenosulfonilo (AEBSF)). Este búfer puede ser alicitado y almacenado a-20 ° c para su uso futuro. Evitar el congelamiento/descongelación de ciclos para obtener una lisis óptima de las células.</li>
	<li>Prepare 50 mL de un buffer de extensión de trampa libre de Rnasa-/DNase-10 (200 mM Tris-HCl [pH 8,0], 15 mM MgCl2, 630 mm KCl, 0,5% [VOL/VOL] Tween 20, y 10 mm etilenglicol-bis (β-aminoetilo éter)-N, N, n ′, n′-tetraacético ácido (EGTA)). Este buffer puede ser alicizado en 1 mL alícuts y almacenado a-20 ° c para uso futuro.</li>
</ol>2. lisis celular
<ol><li>
Preparación de las células
	<ol>
<li>Descongelar una alícuota congelada de tampón de lisis NP-40. Una vez descongelada, coloque el tampón de lisis sobre hielo. Añadir fluoruro de fenilmetilsulfonyl (inhibidor de la proteasa de PMSF) al tampón de lisis NP-40 para alcanzar una concentración final de 0,2 mM. Nota: esto debe hacerse inmediatamente antes de la alisado de las células.</li>
		<li>Retire cualquier exceso de líquido de los gránulos celulares recolectados para asegurar un pellet de células secas. Tenga en cuenta que los pellets celulares, ya sean recién recolectados o previamente congelados (-80 ° c o Flash congelado en líquido N2), no deben contener ninguna solución sobrante de centrifugaciones anteriores, ya que estas soluciones pueden interferir con los procedimientos descendentes.</li>
		<li>Crecen, recolectan y congelan las líneas celulares de telomerasa positiva y telomerasa negativa (BJ fibroblastos, IMR-90 o U2OS) con el fin de utilizarlos como controles positivos y negativos. Utilice nuevos lisados de control cada vez que se realice el ensayo para garantizar la reproducibilidad del ensayo. Nota: se aconseja que se cultiva una gran cultura de células telomerasas negativas y se alicitan antes de la congelación para eliminar cualquier artefacto relacionado con la cultura del tejido que pueda introducirse durante el cultivo a largo plazo de las líneas celulares para ayudar a garantizar resultados reproducibles de la muestra de control negativo.</li>
		<li>Coloque los gránulos de la célula en el hielo. Si las células estuvieran congeladas, permítales que se descongelen brevemente sobre el hielo. Nota: los tamaños típicos de pellet de células para el ddTRAP están entre 500.000 y 1 millón celdas. Pellets de células más pequeñas también se pueden utilizar si es necesario, pero el número de celda debe/idealmente debe conocerse. El ddTRAP también se puede realizar en función de la entrada de proteína mediante un ensayo de proteína BCA (la entrada suele ser de 1 μg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
La lising de las células
	<ol>
<li>Lyse las células en el tampón de lisis NP-40. Mantener una equivalencia celular de 25.000 células/μL de tampón. Por ejemplo, Lise un pellet (que contiene 1 millón células) en 40 μL de tampón de lisis NP-40. Acaricie suavemente el lysate hacia arriba y hacia abajo para romper las células. Trate de evitar hacer burbujas.</li>
		<li>Deje que las células se Lise sobre hielo durante 30 min. Asegúrese de torbellino suavemente el lisado para evitar que se formen los racimos de desechos celulares. Esto se puede hacer cada 10 minutos y está destinado a mantener el lisado una mezcla homogeneizada.</li>
		<li>Diluir el lisado celular (25.000 células/μL) 1:20 en el tampón de lisis NP-40, haciendo la nueva equivalencia celular 1.250 células/μL. Por ejemplo, diluir 5 μL de lisado celular en 95 μL de tampón de lisis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. reacción de extensión de telomerasa
<ol><li>Prepare una mezcla maestra (tabla 1) para la reacción de extensión de la telomerasa (por reacción). Nota: es mejor preparar la mezcla maestra de reacción de extensión durante la lisis celular y almacenarla en hielo.<ol>
<li>Pipet 48 μL de extensión de la mezcla maestra en cada tubo PCR.</li>
		<li>Añadir 2 μL del lisado diluido (1.250 células/μL) a la reacción de extensión. El volumen total ahora debe ser de 50 μL con una equivalencia de celda final de 50 células/μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realice la reacción de extensión de la telomerasa (tabla 2).</li>
	<li>Almacene los productos de extensión de telomerasa a 4 ° c durante un máximo de 3 a 5 días; sin embargo, es óptimo utilizar los productos de extensión dentro de las primeras 24 h.</li>
</ol>4. la configuración de PCR digital de gota
<ol><li>Prepare una mezcla maestra (tabla 3) para el ddtrap (por reacción). Nota: una vez que los reactivos estén a temperatura ambiente, no los coloque ni la mezcla principal sobre hielo. Colocar la mezcla sobre hielo puede aumentar la viscosidad y provocar una mala formación de gotas. La polimerasa de ADN en el Supermix ddPCR es un comienzo caliente y debe ser estable a temperatura ambiente. El Supermix ddPCR puede almacenarse a 4 ° c después de un deshielo inicial de-20 ° c.<ol>
<li>Pipet 19,8 μL de mezcla maestra de ddPCR en cada tubo de PCR.</li>
		<li>Añadir 2,2 μL de la reacción de extensión a cada tubo. Tenga en cuenta que el volumen total debe ser ahora de 22 μL. Nota: la cantidad total de muestra necesaria para un ddTRAP es de 20 μL (equivalencia celular de 100 células). El volumen adicional es una precaución para el error de Pipet o la pérdida de la muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configure el cartucho de generación de gotas. Nota: el cartucho contiene tres columnas diferentes de pozos etiquetados.<ol>
<li>Cargar 20 μL de la reacción preparada de acuerdo con el paso 4.1.2 en el pozo de la muestra (pozo medio) en el cartucho. Evite las burbujas al pipetear la muestra. Nota: si hay burbujas, golpee suavemente el lado del cartucho para que estas burbujas se hagan a la parte superior de la solución.</li>
		<li>Cargar 70 μL de aceite de generación de gotas en el pozo de aceite (izquierda bien). Nota: con el fin de evitar la contaminación, utilice estrictamente un conjunto separado de pipetas y puntas para los pasos de generación de gotas ddPCR. El orden de carga del cartucho es importante. La muestra debe cargarse antes de la carga de aceite ya que el aceite es más pesado y llenará las cámaras de microfluidos y conducirá a una mala formación de gotas. El número mínimo de muestras que se pueden ejecutar es ocho. Todos los pozos del cartucho deben cargarse con la muestra, ya que cualquier pozo vacío llevará a un alto en la generación de gotas del generador de gotas. Si no se dispone de muestras adecuadas para cargar los ocho pozos dentro de un cartucho, se pueden cargar 20 μL de la mezcla Master ddTRAP (paso 4,1) en los cartuchos restantes.</li>
		<li>Asegure la Junta en su lugar mediante el anclaje a los extremos del cartucho. Nota: la falta o colocación inadecuada de la Junta evitará que el generador genere gotas.</li>
		<li>Coloque el cartucho cargado y montado en el generador de gotas. Nota: el cartucho es reconocido por un imán en el generador, que informará al usuario cuando el cartucho esté colocado correctamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraiga el cartucho una vez que se generen las gotas y se complete el ciclo (~ 60 – 90 s).<ol>
<li>Quite suavemente la Junta del cartucho. Pipet las gotas recién generadas (pozo derecho), utilizando una picada multicanal, en una placa de PCR de 96-well. Nota: el volumen aproximado de la emulsión de gota recién generada debe ser de 40 – 43 μL.</li>
		<li>Selle el calor de la placa con sellos de placa de aluminio PCR una vez que todas las muestras se cargan en la placa de 96-Well con el fin de evitar la evaporación durante los pasos de PCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cargue la placa 96-well en el termociclador y realice la siguiente reacción PCR (tabla 4). Nota: todas las velocidades de rampa entre los pasos de temperatura deben establecerse en 2,5 ° c/s con el fin de calentar adecuadamente las reacciones.</li>
</ol>5. detección de productos de extensión de telomerasa
<ol><li>Cargue la placa 96-well en el lector de gotas. Nota: Asegúrese de orientar la placa correctamente para que la muestra a1 coincida con la del soporte.<ol>
<li>Abra el software asociado con el lector de gotas. Haga doble clic en el primer pozo a1 para abrir la pantalla del editor de muestras/pozo.</li>
		<li>Haga clic en experimento y seleccione ABS en el menú desplegable. Nota: el experimento define el tipo de ensayo que se utilizará (es decir, la cuantificación absoluta o el ensayo de número de copia génica). ABS significa cuantificación absoluta.</li>
		<li>Seleccione QX200 ddPCR Evagreen Supermix para asegurarse de que el lector emplea el método de detección correcto. Haga clic en aplicar en la parte inferior derecha de la pantalla del editor de pozos para guardar la configuración definida por el usuario en todos los pozos resaltados. Nota: Supermix define el tipo de mezcla de PCR y la química de detección que será leída por el lector.</li>
		<li>Haga clic en el blanco en la pantalla del editor del pozo del software para definir la muestra.</li>
		<li>Defina el tipo de muestra haciendo clic en el menú desplegable de destino y seleccionando desconocido, referenciao NTC (control sin plantilla). Nota: desconocido se referiría a una muestra experimental, la referencia podría ser una muestra de control de la actividad de la telomerasa conocida, y un NTC es un control crítico para la determinación de la validez del ensayo en términos de contaminación y señal de fondo.</li>
		<li>Etiquete todos los ejemplos en la sección nombre de ejemplo y haga clic en aplicar para asegurarse de que los pozos resaltados se editan apropiadamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Haga clic en Ejecutar para ejecutar/leer la placa. Seleccione columnas o filas en la pantalla Opciones de ejecución cuando se le solicite que informe a la máquina sobre la orientación en la que debe leerse la placa.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Determine el número de gotas aceptadas para cada muestra haciendo clic en pozos individuales. Haga doble clic en los encabezados individuales de los pozos o columnas/filas para ver y analizar los datos de muestra. Nota: los criterios más importantes sobre si se procede o no con el análisis de una muestra en particular es el número de "gotas aceptadas". Para el ddTRAP, las muestras con 10.000 o más gotas aceptadas son válidas para un análisis posterior. Los datos pueden ser proporcionados al usuario en muchos formatos, incluyendo una tabla. csv, imágenes. jpg, histogramas, etc. Hay muchos recursos disponibles para el análisis en profundidad de los datos de ddpcr, incluido el ddtrap11,13. Estos recursos ofrecen una guía para analizar los datos de ddtrap, desde la selección de los umbrales11,13 hasta la elección de muestras para el análisis adicional11,13, la identificación de falsos positivos y negativos13, y solución de problemas general13.</li>
	<li>Resalte los pozos que representan réplicas de muestras y muestras de NTC. Analice las muestras en comparación con las líneas de control NTC o negativas, como las celdas BJ (como se indica en el paso 2.1.2).<ol>
<li>Establezca manualmente el umbral para las muestras haciendo clic en el icono para establecer los umbrales en la parte inferior izquierda de la pantalla. Establezca umbrales para cada pozo individual o para varios pozos a la vez (recomendado). Nota: Si el fondo se detecta en el NTC, se puede restar de todas las otras muestras para ' normalizar ' la señal y asegurarse de que sólo se analiza la señal positiva verdadera. Los valores de NTC están típicamente en el rango de 0,2 – 1 molécula/μL para el sistema de tampón de lisis NP-40. Otros sistemas y componentes de búfer tendrían que probarse (por ejemplo, los búferes CHAPS).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li>
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<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
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<li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddTRAP%3A+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La medición de la actividad de la telomerasa es fundamental para una plétora de temas de investigación, incluyendo, pero no limitado a, cáncer, biología de los telómeros, envejecimiento, medicina regenerativa y diseño de fármacos basados en la estructura. Las RNP de telomerasa son muy abundantes, incluso en las células cancerosas, lo que hace que la detección y el estudio de esta enzima sean desafiantes. En este documento, describimos los procedimientos paso a paso para el nuevo ensayo ddTRAP desarrollado para cuantifica...

Los telómeros son complejos de ADN-proteína dinámicos en los extremos de los cromosomas lineales. Los telómeros humanos se componen de una serie de repeticiones hexamericas de 5 '-TTAGGGn que varían en longitud entre 12 – 15 kilobases (KB) al nacer1. La telomerasa humana, la enzima ribonucleoproteína que mantiene los telómeros, se identificó por primera vez en los lisados de las células de la Hela (línea de células cancerosas)2. Juntos, los telómeros y la telomerasa desempeñan un papel importante en un espectro de procesos biológicos como la protección del genoma, la regulación génica y la inmortalidad de las células cancerosas3,4,5,6.
La telomerasa humana se compone principalmente de dos componentes clave, a saber, la transcriptasa inversa de telomerasa y el ARN de telomerasa (hTERT y hTERC, respectivamente). La Subunidad proteica, hTERT, es el componente catalíticamente activo de la transcriptasa inversa de la enzima telomerasa. La plantilla de ARN, hTERC, proporciona telomerasa con la plantilla para extender y/o mantener los telómeros. La mayoría de los tejidos somáticos humanos no tienen actividad de telomerasa detectable. La incapacidad de ADN polimerasa para extender el final de la hebra de ADN rezagado junto con la falta de telomerasa conduce a la reducción progresiva de los telómeros después de cada ronda de división celular. Estos fenómenos conducen al acortamiento de los telómeros en la mayoría de las células somáticas hasta que alcanzan una longitud de corta duración, donde las células entran en un estado de senescencia replicativa. El número máximo de veces que una célula puede dividirse es dictado por su longitud de telómeros y este bloque a la división celular continua se piensa para prevenir la progresión a la oncogénesis7. Las células cancerosas son capaces de superar la senescencia replicativa inducida por el telómero y continúan proliferando utilizando telomerasa para mantener sus telómeros. Aproximadamente el 90% de los cánceres activan la telomerasa, lo que hace que la actividad de la telomerasa sea sumamente importante en la detección y el tratamiento del cáncer.
El desarrollo del ensayo TRAP en la década de 1990 fue instrumental en la identificación de los componentes necesarios de la enzima telomerasa, así como para la medición de la telomerasa en una amplia gama de células y tejidos, tanto normales como cancerosos. El ensayo original de PCR basado en gel utilizó sustratos de ADN etiquetados radioactivamente para detectar la actividad de la telomerasa. En 2006, el ensayo se adaptó a una forma no radioactiva utilizando sustratos con la etiqueta fluorescencia8,9. Mediante el uso de sustratos etiquetados con fluorescencia, los usuarios pudieron visualizar los productos de extensión de telomerasa como bandas en un gel exponiéndolo a la longitud de onda de excitación correcta. La sensibilidad del ensayo TRAP y su capacidad para detectar la actividad de la telomerasa en los lisados de células crudas ha hecho de este ensayo el método más ampliamente utilizado para la detección de la actividad de la telomerasa. Sin embargo, el ensayo TRAP tiene limitaciones. El ensayo está basado en gel, por lo que es difícil realizar las réplicas necesarias en estudios de moderado a alto rendimiento, y por lo tanto, rara vez se logra un análisis estadístico adecuado. Además, el ensayo basado en gel es difícil de cuantificar de forma fiable debido a la incapacidad de detectar menos de dos diferencias en la actividad de la telomerasa entre las muestras. La superación de estas dos limitaciones es fundamental para que los ensayos de actividad enzimática, como el TRAP, se trasladen a la configuración clínica o de la industria para detectar la actividad de la telomerasa en muestras de pacientes o en estudios de diseño de fármacos.
La PCR digital se desarrolló inicialmente en 1999 como un medio para convertir la naturaleza exponencial y analógica de la PCR en un ensayo lineal y digital10. La PCR digital por gota (ddPCR) es la innovación más reciente de la metodología de PCR digital original. La PCR digital por gota surgió con la llegada de microfluidos avanzados y química de emulsión de aceite en agua para generar de forma fiable gotas estables e igualmente de tamaño. A diferencia de la PCR a base de gel e incluso cuantitativa (qPCR), la ddPCR genera una cuantificación absoluta del material de entrada. La clave de ddPCR es la generación de ~ 20.000 reacciones individuales mediante la partición de muestras en gotas. Después de la PCR de punto final, el lector de gotas escanea cada gota en una forma similar al CITOMETRO-flujo, contando, dimensionando y registrando la presencia o ausencia de fluorescencia en cada gota individual (es decir, ausencia o presencia de los amplicones PCR en cada gota). Luego, utilizando la distribución de Poisson, las moléculas de entrada se estiman en base a la relación de gotas positivas con el número total de gotas. Este número representa una estimación del número de moléculas de entrada en cada PCR. Además, la ddPCR se realiza y se analiza en una placa de pozo de 96 que permite al usuario ejecutar muchas muestras, así como realizar réplicas biológicas y técnicas para un análisis estadístico adecuado. Como resultado, hemos combinado la potente cuantificación y la naturaleza de rendimiento moderado de ddPCR con el ensayo TRAP para desarrollar el ensayo ddTRAP11. Este ensayo está diseñado para que los usuarios estudien y cuantifiquen enérgicamente la actividad de la telomerasa absoluta a partir de las muestras biológicas11,12. La sensibilidad del ddTRAP permite la cuantificación de la actividad de la telomerasa a partir de muestras limitadas y preciosas, incluyendo mediciones de una sola célula. Además, los usuarios también pueden estudiar los efectos de las manipulaciones de telomerasa y/o fármacos con cuantificación absoluta de menos de dos cambios (~ 50% diferencias). El ddTRAP es la evolución natural del ensayo TRAP en la naturaleza digital y de mayor rendimiento de los experimentos de laboratorio modernos y los entornos clínicos.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>libre de ARNasa/ADNasa</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td>libre de RnAsa/ADNasa</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td>Libre de ARNasa/ADNasa</td></tr><tr><td>Surfact- Amps NP-40</td><td>Thermo Scientific</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>100% Glicerol ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>15514011</td><td>Libre de ARNasa/ADNasa</td></tr><tr><td>fluoruro de fenilmetilsulfonilo</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>516732</td><td></td></tr><tr><td>Libre de nucleasas H20</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Libre de ARNasa/ADNasa</td></tr><tr><td>2,5 mM Mezcla de dNTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R72501</td><td>2,5 mM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP</td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td>libre de ARNasa/ADNasa</td></tr><tr><td>100% Tween-20</td><td>Fisher</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA pH 8.0</td><td>Fisher</td><td>50-255-956 Libre de</td><td>ARNasa/ADNasa</td></tr><tr><td>Sustrato de telomerasa (TS) Imprimación</td> Tecnología de <td>ADN integrada (IDT)</td><td>Imprimación personalizada (purificada por HPLC)</td><td>5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'ACX</td></tr> <tr><td>(Revers) Imprimación</td><td>con tecnología de ADN integrada (IDT)</td><td>Imprimación personalizada (purificada por HPLC)</td><td>5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'Tubos</td></tr> de <tr><td>grado PCR DE PARED DELGADA (250 ul)</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>tiras, placas, tubos, etc.</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>Twin-Tec Placa de 96 pocillos</td><td>Fisher</td><td>Eppendorf 951020362</td><td></td></tr><tr><td>Sellado térmico de lámina Piercable</td><td>Bio Rad 1814040</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad (DG8)</td><td>Bio Rad</td><td>1863008</td><td></td></tr><tr><td>Aceite generador de gotas</td><td>Bio Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Junta del generador de gotas</td><td>Bio Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador de 96 pocillos T100</td><td>Bio Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>PX1 Selladora de placas PCR</td><td>Bio Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Lector de gotas y software Quantasoft</td><td>Bio Rad</td><td>1864001 y 1864003</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Aceite lector de gotas</td><td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>Nucleasa Puntas de pipeta filtradas sin nucleasa</td><td>Thermo Científico</td><td></td><td>10 ul, 20 ul, 200 ul y 1000 ul</td></tr></tbody></table>

trampa digital de gota (ddtrap): adaptación del protocolo de amplificación de repetición de telómeros a la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

El protocolo de amplificación de repetición de telómeros (TRAP) es el ensayo más ampliamente utilizado para detectar la actividad de la telomerasa dentro de una muestra determinada. El método basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite mediciones robustas de la actividad enzimática de la mayoría de los lisatos celulares. El TRAP basado en gel con imprimadores con etiquetas fluorescentemente limita el rendimiento de la muestra, y la capacidad de detectar diferencias en las muestras está restringida a dos pliegues o mayores cambios en la actividad enzimática. El TRAP digital de gota, ddTRAP, es un enfoque altamente sensible que ha sido modificado a partir del ensayo TRAP tradicional, permitiendo al usuario realizar un análisis robusto en 96 muestras por corrida y obtener la cuantificación absoluta de los productos de DNA (extensión de telomerasa ) dentro de cada PCR. Por lo tanto, el ensayo ddTRAP recientemente desarrollado supera las limitaciones del ensayo TRAP tradicional basado en gel y proporciona un enfoque más eficiente, preciso y cuantitativo para medir la actividad de la telomerasa en entornos clínicos y de laboratorio.

Usando el ddTRAP, la actividad de telomerasa se midió en un panel celular que consta de las siguientes líneas celulares (figura 1): cáncer de pulmón de células no pequeñas (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 y H2887), cáncer de pulmón de células pequeñas (H82 y SHP77) y telomerasa negativa fibroblastos (BJ). 1 millón pellets de células fueron lisados en tampón NP-40, y las reacciones de extensión de telomerasa se realizaron en triplicados biológicos. Un control ...

Hemos convertido con éxito el ensayo estándar de protocolo de amplificación de repetición de telómeros (TRAP) que se empleara en las reacciones de la cadena de polimerasa digital de gotas. Este nuevo ensayo, llamado ddTRAP, es más sensible y cuantitativo, lo que permite una mejor detección y análisis estadístico de la actividad de la telomerasa dentro de varias células humanas.

TRAMPA digital de gota (ddTRAP): adaptación del Protocolo de amplificación de repetición de telómeros a la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

El ensayo ddTRAP proporciona la capacidad de obtener una medición sensible, robusta y altamente cuantitativa de la actividad enzimática de la telomerasa en las células. La capacidad de ejecutar hasta 96 muestras por ejecución de forma mediana nos ofrece una gran ventaja. Podemos ejecutar los controles y réplicas para un análisis estadístico adecuado de los datos recopilados.Inmediatamente antes de la eleje de la célula, descongele una alícuota congelada del búfer de lelisis NP-40. Una vez descongelado, coloque el tampón de lelisis sobre hielo. Añadir inhibidor de la proteasa de PMSF al tampón de la lelisis NP-40 para alcanzar una concentración final de 0,2 milimolares.Luego, agregue 40 microlitros del tampón de lysis al tubo que contiene un pellet celular para alcanzar una equivalencia celular de 25.000 células por microlitro. Pipetee suavemente el izado hacia arriba y hacia abajo para romper las celdas. Trate de evitar hacer burbujas.Deje que las células se licen sobre hielo durante 30 minutos. A vórtice suavemente el licate cada 10 minutos para evitar que se formen racimos de desechos celulares. Durante la lelisis celular, prepare una mezcla maestra en un tubo de microcentrífuga para la reacción de extensión de la telomerasa y guárdelo en hielo.Después de la lelisis celular, pipeta 48 microlitros de extensión master se mezclan en cada tubo PCR. Añadir dos microlitros de izado diluido a cada tubo pcR para alcanzar una equivalencia celular final de 50 células por microlitro, y continuar la reacción de extensión de la telomerasa según el manuscrito. Prepare una mezcla maestra en un tubo de microcentrífuga para el ddTRAP y manténgalo a temperatura ambiente.Pipetear 19,8 microlitros de ddPCR mezcla maestra en cada tubo PCR. Añadir 2,2 microlitros de la solución de reacción de extensión anterior a cada tubo, dejando un volumen total de 22 microlitros. Para configurar el cartucho de generación de gotas, primero cargue 20 microlitros de la solución preparada en el pozo de muestras centrales en el cartucho.Toque suavemente el lado del cartucho para mover cualquier burbuja a la parte superior de la solución. Todos los pozos del cartucho deben cargarse con muestra antes de cargar el aceite. A continuación, cargue 70 microlitros de aceite de generación de gotas en el pozo de aceite izquierdo.Fije la junta en su lugar atándola a los extremos del cartucho y coloque el cartucho cargado y montado en el generador de gotas. El generador muestra una luz verde sólida para informar que el cartucho se coloca correctamente. Después de 60 a 90 segundos, cuando la luz del generador deja de parpadear, el ciclo se completa.Ahora retire el cartucho. Retire suavemente la junta del cartucho. Utilice una pipeta multicanal para pipetear aproximadamente 40 microlitros de las gotas recién generadas desde el pozo derecho en una placa PCR de 96 pozos.Selle la placa con sellos de placa PCR de papel de aluminio una vez que todas las muestras se cargan en la placa de 96 pocillos para evitar la evaporación. A continuación, cargue la placa de 96 pozos en un termociclador para realizar la reacción PCR. Para empezar, cargue la placa de 96 pozos en el lector de gotas.Oriente la placa correctamente para que la muestra A1 coincida con la del soporte. Abra el software asociado con el lector de gotas. Haga doble clic en el primer pozo, A01, para abrir la pantalla del editor de pozos de muestra.Haga clic en Experimento y seleccione el tipo de ensayo que se utilizará en el menú desplegable. Seleccione QX200 ddPCR EvaGreen Supermix como el método de detección correcto. Haga clic en Aplicar en la parte inferior derecha de la pantalla del editor de pozos para guardar la configuración definida por el usuario en todos los pozos resaltados.A continuación, haga clic en Destino en la pantalla del editor de pozos y haga clic en el menú desplegable Destino para seleccionar el control desconocido, de referencia o sin plantilla para definir el tipo de muestra. En la sección Nombre de ejemplo, etiquete todos los ejemplos y haga clic en Aplicar. Haga clic en Ejecutar para leer la placa.Seleccione Columnas o Filas en la pantalla Opciones de ejecución cuando se le solicite informar sobre la orientación en la que se debe leer la placa. Determine el número de gotas aceptadas para cada muestra haciendo doble clic en los pozos individuales o encabezados de columna y fila para proporcionar una tabla de información. Para el ddTRAP, las muestras con 10.000 o más gotas aceptadas son válidas para su posterior análisis.Resalte los pozos que representan réplicas de muestra y muestras de NTC. Establezca manualmente el umbral para las muestras haciendo clic en el icono para establecer umbrales en la parte inferior izquierda de la pantalla. En este protocolo, la actividad de la telomerasa se midió en un panel celular compuesto por nueve líneas celulares de cáncer de pulmón y fibroblastos negativos de telomerasa.Se estableció un umbral en alrededor de 2.000 de amplitud de fluorescencia para las tres réplicas biológicas para SHP77, H2887 y NTC. Las gotas positivas tenían una intensidad de fluorescencia alrededor de 6.000 de amplitud de fluorescencia, que formaban una población clara en la parte superior, y se separaban de las gotas negativas alrededor de 1.100 amplitudes de fluorescencia. Los productos de extensión total de telomerasa por equivalente celular entre todas las muestras se estimaron a partir de la concentración medida de los ácidos nucleicos, lo que representa la actividad de la telomerasa en las líneas de cáncer de pulmón.Cualquier contaminación por ARNase durante los pasos de la lesis o de la reacción de extensión destruirá la actividad enzimática de la telomerasa, ya que es un complejo ribonucleoproteína. ddTRAP se puede seguir con ddPCR en los niveles de expresión de hTERT mRNA en la célula. Los dos conjuntos de datos nos permiten correlacionar la expresión de hTERT con la actividad de la telomerasa y profundizar en posibles mecanismos reguladores de la telomerasa, como el empalme alternativo.Podemos explorar las manipulaciones a factores de empalme específicos y sus efectos en la actividad de la telomerasa. Actualmente, estamos diseñando moduladores de empalme de oligonucleótidos como fármacos potenciales dirigidos a la actividad telomerasa.

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Aislamiento y cuantificación de ARNm axonales mediante inserciones porosas de membrana y RTddPCR

Aprende a medir la actividad de la telomerasa con el ensayo ddTRAP utilizando PCR digital en gotas. Este método sensible permite analizar hasta 96 muestras simultáneamente para evaluación estadística robusta.

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TRAMPA digital de gota (ddTRAP): adaptación del Protocolo de amplificación de repetición de telómeros a la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas

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