Name: Cultivo celular bacteriano en el nivel de una sola célula dentro de las vesículas gigantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprende a cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de vesículas gigantes usando el método de transferencia de gotas. Esta técnica permite la observación directa del crecimiento bacteriano.

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Este trabajo fue apoyado por una Iniciativa Líder para Excelentes Investigadores Jóvenes (LEADER, No. 16812285) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón, una Beca en Ayuda para la Investigación de Jóvenes Científicos (No 18K18157, 16K21034) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) a M.M., y la Beca en Ayuda de MEXT a K.K. (No 17H06417, 17H06413).

1. Preparación de LOS GV que contienen células bacterianas por el método de transferencia de gotas
<ol><li>Preparar soluciones de stock de lípidos de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) y 1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] (biotina-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) en cloroformo/ metanol (2/1, v/v) y almacene el stock a -20 oC.</li>
	<li>Preparación de una solución de aceite que contenga lípidos
	<ol>
<li>Vierta 20 ml de la solución POPC y 4 l de la solución biotina-PEG-DSPE en un tubo de vidrio (Figura1b (i)).</li>
		<li>Evaporar el disolvente orgánico por flujo de aire para formar una película lipídica y colocar la película en un desecador durante 1 h para evaporar completamente el disolvente orgánico (Figura1b (ii)). NOTA: Es necesario evaporar el disolvente orgánico en una campana de humo.</li>
		<li>Añadir 200 l de aceite mineral (0,84 g/ml, tabla de materiales)al vial de vidrio (Figura1b (iii)).</li>
		<li>Envuelva la parte inicial del vial de vidrio con película y sonicarla en un baño ultrasónico (120 W) durante al menos 1 h (Figura1b (iii)). Las concentraciones finales de POPC y biotina-PEG-DSPE son de 1 mM y 0,002 mM, respectivamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Precultivo de células bacterianas
	<ol>
<li>Inocular E. coli en 1x medio LB (1 g de extracto de levadura, 2 g de bacto triptona y 2 g de cloruro de sodio en 200 ml de agua desionizada) de una placa LB e incubar a 37 oC durante 12-14 h (durante la noche).</li>
		<li>Después de la incubación, recoger 20 l de la solución de cultivo y transferir a 1,98 ml de medio fresco 1x LB, y volver a cultivar las células durante 2 h.</li>
		<li>Compruebe la densidad óptica en el valor de 600 nm (OD600) de la solución de precultivo (preparada en el paso 1.3.2). Se debe utilizar una solución precultal de600 OD a 1,0–1,5.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de las soluciones acuosas externas e internas de los GV
	<ol>
<li>Disolver la glucosa en un medio de 1x LB para preparar una solución acuosa externa de GV. Prepare 20 mL de una solución de glucosa en stock (500 mM).</li>
		<li>Diluir la solución de glucosa en stock con 1x LB medio a 200 mM (Tabla1).</li>
		<li>Disolver la sacarosa en un medio de 1x LB para preparar una solución acuosa interna de GV. Prepare 20 ml de una solución de sacarosa en stock (500 mM).</li>
		<li>Mezclar la solución de precultivo (OD600 a 1,0–1,5), la solución de sacarosa (500 mM) y el medio 1x LB (Tabla1). El valor final de oD600 de la solución de cultivo debe ser 0,01–0,015 y la concentración final de sacarosa debe ser de 200 mM. NOTA: Tenga cuidado de evitar la presión osmótica. Es necesario equilibrar la concentración entre la solución acuosa interna y externa.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de gotas de agua en aceite (W/O) que contienen células bacterianas
	<ol>
<li>Añadir 2 l de la solución acuosa interna de los GV (preparadoen en el paso 1.4.4) a 50 l de la solución de aceite que contiene lípidos (aceite mineral con POPC y biotina-PEG-DSPE) en un tubo de plástico tapado de 0,6 ml (Figura1b (iv)).</li>
		<li>Emulsionar los dos componentes en el tubo de plástico tocando el tubo a mano (Figura1b (v)).</li>
	</ol></li>
	<li>Formación de GV que contienen células bacterianas
	<ol>
<li>Añadir 50 ml de la solución acuosa externa de los GV (preparado en el paso 1.4.2) en un tubo de plástico tapado de 1,5 ml (Figura1b (vi)) y colocar suavemente 150 ml de la solución de aceite que contiene lípidos (aceite mineral con POPC y biotina-PEG-DSPE) en la superficie del acuoso externo solución (Figura1b (vii)). Incubar esta muestra a temperatura ambiente (RT, 25 oC) durante 10-15 min. Compruebe que la interfaz del aceite y las soluciones acuosas sea plana.</li>
		<li>Añadir 50 l de la solución de gotas para rinuofencias (preparada en el paso 1.5.2) en la interfaz del aceite y la solución acuosa utilizando una pipeta (Figura1b (viii)).</li>
		<li>Centrifugar el tubo de plástico tapado de 1,5 ml (del paso 1.6.2) durante 10 min a 1.600 x g a RT en una centrífuga de escritorio (Figura1b (ix)). Después de la centrifugación, aspirar el aceite (capa superior) del tubo de plástico tapado de 1,5 ml utilizando una pipeta, y recoger los GV que contienen células bacterianas (Figura1b (x)).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación de un sistema de observación GV (Sistema de cultivo celular de bacterias)
<ol><li>
Preparación de pequeñas vesículas (SVs) para constructi ng un membrana bicapa apoyada
	<ol>
<li>Vierta 20 ml de la solución POPC y 4 l de la solución biotina-PEG-DSPE en un tubo de vidrio (utilizando la misma composición lipídica utilizada para la preparación de GV en el paso 1.1).</li>
		<li>Evaporar el disolvente orgánico por flujo de aire para formar una película lipídica y colocar esta muestra en un desecador durante 1 h para evaporar completamente el disolvente orgánico.</li>
		<li>Añadir 200 ml de glucosa de 200 mM en un medio de 1x LB (la solución acuosa externa de GV) al vial de vidrio.</li>
		<li>Envuelva la parte inicial del vial de vidrio con película y sonicarla en un baño ultrasónico (120 W) durante al menos 1 h.</li>
		<li>Prepare SVs por el método de extrusión21 utilizando una membrana miniextrusora y policarbonato con tamaño de poro de 100 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de una cámara hecha a mano
	<ol>
<li>Taladre un orificio de 7 mm con un punzón hueco en un sello de doble cara (10 mm x 10 mm x 1 mm).</li>
		<li>Pegue el sello de doble cara con el orificio en un vidrio de cubierta (30 mm x 40 mm, espesor 0,25-0,35 mm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de una membrana bicapa apoyada en el vidrio de la cubierta en el orificio de la cámara
	<ol>
<li>Añadir 30 l de la solución SV al orificio de la cámara (preparado en la sección 2.2) e incubar a RT durante 30 min.</li>
		<li>Lave suavemente el orificio dos veces con 20 ml de medio de 1lb que contiene 200 mM de glucosa (la solución acuosa externa de GV) mediante pipeteo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inmovilización de los GV en el membrana bicapa apoyada en el vidrio de la cubierta en el agujero de la cámara
	<ol>
<li>Introducir 10 ml de neutravidina con la solución acuosa externa de GV (1 mg/ml) en el orificio e incubar a RT durante 15 min.</li>
		<li>Lave suavemente el orificio dos veces con 20 ml de medio de 1lb que contiene 200 mM de glucosa (la solución acuosa externa de GV) mediante pipeteo.</li>
		<li>Añadir toda la solución que contenga GV (preparado en el paso 1.6.3) en el orificio de la cámara y sellar con un vidrio de cubierta (18 mm x 18 mm, espesor 0,13–0,17 mm) (Figura2b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Observación microscópica del crecimiento celular bacteriano dentro de los GV
	<ol>
<li>Establecer un sistema de etapa de calentamiento microscópico con un microscopio invertido equipado con una lente objetivo de apertura numérica (NA) de 40x/0.6 con una larga distancia de trabajo (Figura2b).</li>
		<li>Coloque la cámara en el sistema de etapa de calentamiento microscópico (Figura2b). Incubar los GV que contienen células bacterianas en la cámara a una condición estática durante 6 h a 37 oC.</li>
		<li>Capture y grabe imágenes de microscopio sin crecimiento celular bacteriano dentro de los GV cada 30 minutos mediante el uso de una cámara científica complementaria complementaria de semiconductores de óxido metálico (sCMOS).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li>
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<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li>
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<li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li>
<li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles%3A+a+novel+tool+for+bacterial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li>
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<li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution%2C+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, describimos un método para cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de los GV. Este método simple implica la formación de GV que contienen células bacterianas a nivel de una sola célula mediante el método de transferencia de gotas. En comparación con otros enfoques para la obtención de GV que contienen células bacterianas, este método tiene dos ventajas: (i) es fácil de desarrollar, y (ii) se requiere un pequeño volumen (2 l) de la solución de la muestra para preparar los GV. El método de tran...

El cultivo de células bacterianas a nivel de una sola célula ha recibido cada vez más atención. Cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de un espacio confinado puede dilucidar funciones bacterianas como la variabilidad fenotípica1,2,3,4, comportamiento celular5, 6 , 7 , 8 , 9, y resistencia a los antibióticos10,11. Debido a los recientes avances en las técnicas de cultivo, el cultivo de bacterias individuales se puede lograr dentro de un espacio confinado, como en un bien-chip4,7,8, gota de gel12,13 , y gota de agua en aceite (W/O)5,11. Para promover la comprensión o la utilización de células bacterianas individuales, se necesitan desarrollos técnicos adicionales de las técnicas de cultivo.
Las vesículas que imitan la membrana celular biológica son compartimentos esféricos que consisten en moléculas anfifílicas y pueden contener diversos materiales. Las vesículas se clasifican según el tamaño e incluyen vesículas pequeñas (SVs, diámetro < 100 nm), vesículas grandes (LV, <1 m) y vesículas gigantes (GV, >1 m). SVs o LV se utilizan comúnmente como portadores de drogas debido a su afinidad con la membrana celular biológica14. Los GV también se han utilizado como sistema de reactores para la construcción de protocélulas15 o células artificiales16. La encapsulación de células biológicas en GV se ha reportado17,18, y por lo tanto los GV muestran potencial como un sistema de cultivo celular cuando se combina con el sistema del reactor.
Aquí, junto con un video de procedimientos experimentales, describimos cómo los GV pueden ser utilizados como nuevos buques de cultivo celular19. Los GV que contenían bacterias fueron fabricados por el método de transferencia de gotas20 y luego fueron inmovilizados en una membrana apoyada en un vidrio de cubierta. Utilizamos este sistema para observar el crecimiento bacteriano a nivel de una sola célula dentro de los GV en tiempo real.

<table><tbody><tr><td>Bactotriptona</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>032-21921</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos (18 &18 mm)</td><td>Matsunami Glass Ind.</td><td>C018181</td><td>espesor 0.13&ndash; 0,17 mm</td></tr><tr><td>Cubreobjetos (30 y 40 mm)</td><td>Matsunami Glass Ind.</td>espesor <td>de pedido personalizado</td><td>0.25 &ndash; 0,35 mm</td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Hi-Tech Co.</td><td>Tipo de rotor oscilante</td> <td>ATT101</td></tr><tr><td>Sello de doble cara (10 veces; 10 veces; 1 mm)</td><td>Nitoms</td><td>T4613</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidrio</td><td>AS ONE</td><td>6-306-01 Tubo de</td><td>fermentación Durham</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>133-16771</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de etapa de calentamiento microscópico</td><td>TOKAI</td><td>HIT TP-110R-100</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Nacalai Tesque</td><td>23334-85</td><td></td></tr><tr><td>Miniextrusora</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Lente objetivo</td><td>Olympus</td><td>LUCPLFLN 40&times;/0.6 NA</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de policarbonato</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005</td><td>tamaño de poro 100 nm</td></tr><tr><td>Cámara sCMOS</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 plus</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Baño ultrasónico</td><td>AS ONE</td><td>ASU-3D</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de plástico con tapa de 0,6 mL</td><td>Watson</td><td>130-806C</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de plástico con tapa de 1,5 mL</td><td>Sumitomo Baquelita Co.</td><td>MS4265-M</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>850457P</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-snglicero-3-fosfoetanolamina-N-[biotinil(polietilenglicol)-2000]</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>880129P</td><td>Biotina-PEG-DSPE</td></tr></tbody></table>

cultivo celular bacteriano en el nivel de una sola célula dentro de las vesículas gigantes

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Desarrollamos un método para cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de vesículas gigantes (GV). El cultivo celular bacteriano es importante para entender la función de las células bacterianas en el medio natural. Debido a los avances tecnológicos, varias funciones celulares bacterianas se pueden revelar a nivel de una sola célula dentro de un espacio confinado. Los GV son compartimentos esféricos de tamaño micro compuesto por moléculas de lípidos anfifílicos y pueden contener diversos materiales, incluidas las células. En este estudio, una sola célula bacteriana fue encapsulada en 10-30 m de GV por el método de transferencia de gotas y los GV que contienen células bacterianas fueron inmovilizados en una membrana apoyada en un sustrato de vidrio. Nuestro método es útil para observar el crecimiento en tiempo real de bacterias individuales dentro de los GV. Cultivamos células escherichia coli (E. coli) como modelo dentro de los GV, pero este método se puede adaptar a otros tipos de células. Nuestro método se puede utilizar en los campos científico e industrial de la microbiología, la biología, la biotecnología y la biología sintética.

Presentamos un método sencillo para generar GV que contengan células bacterianas individuales utilizando el método de transferencia de gotas (Figura 1). La Figura 1a muestra una imagen esquemática de la precipitación de los GV que contienen bacterias. Las gotas W/O que contienen bacterias se transfieren a través de la interfaz de agua de aceite (monocapa lipídica) por centrifugación para formar GV. La diferencia de densidad entre...

Demostramos el cultivo monocelular de bacterias dentro de vesículas gigantes (GV). Los GV que contenían células bacterianas fueron preparados por el método de transferencia de gotas y fueron inmovilizados sobre una membrana apoyada sobre un sustrato de vidrio para la observación directa del crecimiento bacteriano. Este enfoque también puede ser adaptable a otras células.

Cultivo celular bacteriano en el nivel de una sola célula dentro de las vesículas gigantes

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Este protocolo proporciona un medio para el cultivo de células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de las vesículas gigantes. Es fácil desarrollar las vesículas gigantes, y sólo se requiere un volumen muy pequeño de solución de muestra para preparar las vesículas. Demostrando el procedimiento estará Yuri Ota, un candidato al doctorado de nuestro laboratorio.Comience añadiendo 20 microlitros de solución POPC recién preparada y cuatro microlitros de biotina-PEG-DSPE recién preparada a un vial de vidrio. Evaporar el disolvente orgánico por flujo de aire hasta que se forme una película lipídica. Coloque la película en un desecador durante una hora para evaporar completamente el disolvente orgánico.A continuación, añada 200 microlitros de aceite mineral al vial. Cubra la abertura del vial con película de parafina de plástico y sonice el contenido del vial en un baño ultrasónico a 120 vatios durante al menos una hora. Para una pequeña preparación de vesícula, cree una película de lípidos, como acaba de demostrar, y agregue 200 microlitros de glucosa de 200 milímetros en el medio LB a la película.Luego sonicar la película a 120 vatios durante al menos una hora, seguido de la extrusión de las vesículas gigantes resultantes en pequeñas vesículas utilizando un mini extrusor y una membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 100 nanómetros. Para el preculcalo celular bacteriano, inocular E.coli de una placa LB a mililitros de medio LB para un cultivo nocturno a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, transfiera 20 microlitros del sobrenadante de la cultura a 1,98 mililitros de medio LB fresco para dos horas adicionales de cultivo.Al final de la incubación, compruebe la densidad óptica a 600 nanómetros, o valor OD 600, de la solución de pre-cultivo en un espectrofotómetro. Se debe utilizar una solución de precaldescalado con un OD 600 de uno a 1,5. A continuación, mezcle la solución de precultiva con la solución de sacarosa recién preparada y el medio LB fresco, según la tabla uno.Para la formación de vesículas gigantes, agregue 50 microlitros de una solución acuosa externa recién preparada de vesículas gigantes a un tubo de plástico con tapa de 1,5 mililitros. Capa suave 150 microlitros de la solución de aceite que contiene lípidos sobre la solución acuosa externa de vesículas gigantes. Incubar la solución resultante durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, antes de comprobar que la interfaz del aceite y las soluciones acuosas es plana.Para la formación de gotas de agua y aceite que contengan gotas, agregue dos microlitros de una solución acuosa interna recién preparada de vesículas gigantes a 50 microlitros de la solución de aceite sonicado que contiene lípidos en un tubo de plástico con tapa de 0,6 mililitros. A continuación, toque el tubo para emulsionar los dos componentes. A continuación, utilice una pipeta para añadir 50 microlitros de agua y solución de gotas de aceite a la interfaz del aceite y la solución acuosa, y sedimentar las vesículas gigantes que contienen células bacterianas por centrifugación.A continuación, aspirar la capa de aceite superior y recoger las vesículas gigantes. Para preparar una cámara hecha a mano, taladre un agujero de siete milímetros con un punzón hueco en un sello de 10 por 10 por un milímetro de doble cara, luego pegue el sello de doble cara en un vidrio de cubierta de 30 por 40 milímetros. Para preparar una membrana de dos capas soportada, agregue 30 microlitros de la pequeña solución de vesícula al orificio de la cámara hecha a mano.Incubar las vesículas a temperatura ambiente durante 30 minutos. Al final de la incubación, lave suavemente el agujero dos veces con 20 microlitros de medio LB, complementados con 200 milmiles de glucosa. Para inmovilizar las vesículas gigantes en la membrana bicapa de la partida, introduzca 10 microlitros de neutravidina en la solución de vesícula gigante acuosa externa al agujero para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente.Al final de la incubación, lave suavemente el agujero dos veces con 20 microlitros de medio LB, complementados con glucosa de 200 milmilinos, y agregue todo el volumen de solución de vesícula gigante al agujero en la cámara. A continuación, selle el orificio con un vidrio de cubierta de 18 por 18 milímetros. Para monitorear el crecimiento bacteriano dentro de las vesículas gigantes, seleccione el objetivo 40X en un microscopio invertido y coloque la cámara en el sistema de calentamiento del microscopio.Luego incubar las vesículas gigantes que contienen células bacterianas en la cámara en condiciones estáticas durante seis horas a 37 grados Celsius, capturando y registrando imágenes del crecimiento de células bacterianas cada 30 minutos, con la cámara semiconductora de óxido metálico complementaria científica. Las vesículas gigantes que contienen células bacterianas suelen variar en tamaño de 10 a 30 micrómetros. Para ambos tamaños de vesículas gigantes, las células de E.coli se someten a procesos de alargamiento y división, con algunas células de E.coli creciendo a un gran número de células durante el período de observación de seis horas.La frecuencia relativa de las vesículas gigantes que contienen un nivel de célula única es aproximadamente el 10% de las vesículas gigantes obtenidas, y las vesículas gigantes encapsuladas a nivel de célula única son aproximadamente el 50% de las vesículas gigantes que contienen células bacterianas. La estabilidad de la interfaz aceite-agua es importante para obtener vesículas gigantes que contienen células bacterianas. Tenga cuidado de aspirar el aceite cuidadosamente antes de la corrección de la vesícula gigante.Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de las vesículas gigantes individuales. Nuestro método de cultivo bacteriano es una nueva herramienta en microbiología para el cultivo de bacterias ambientales desconocidas para obtener o analizar sus productos metabólicos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Watson, D. C., et.al. Aislamiento y purificación escalables de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el aislamiento y la concentración de vesículas extracelulares (EV) derivadas de la membrana externa de bacterias modificadas genéticamente. El proceso consiste en cultivar las bacterias para liberar vehículos eléctricos, seguido de pasos secuenciales de centrifugación y filtración para eliminar células y desechos.

Aislamiento y enriquecimiento de vesículas extracelulares derivadas de la membrana externa de bacterias

Fuente: Morita, M., et al. Cultivo de células bacterianas a nivel unicelular dentro de vesículas gigantes. J. Vis. Exp. (2019).Este video demuestra un método para cultivar y observar células bacterianas individuales encapsuladas dentro de vesículas gigantes ancladas a una bicapa lipídica soportada. El sistema permite obtener imágenes estables y a largo plazo de la dinámica de crecimiento de una sola célula en un microambiente confinado y fisiológicamente relevante.

Cultivo unicelular de bacterias dentro de vesículas gigantes

Fuente: Cabeen, M. T., et al. Análisis microfluídico de célula única de Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)El vídeo demuestra el uso de un dispositivo microfluídico para observar el crecimiento bacteriano a nivel de célula única. Muestra cómo las células bacterianas no móviles, confinadas en trincheras a microescala, son continuamente nutridas e imaginadas bajo un microscopio de fluorescencia. La configuración permite la visualización en tiempo real de la división celular y el seguimiento de...

Seguimiento del crecimiento bacteriano a resolución de célula única en un sistema microfluídico

En este protocolo se introduce la fabricación, configuración y operación básica de un biorreactor de picolitros microfluídico (PLBR) para el análisis de microorganismos procariotas de una sola célula. Se analizaron microorganismos de relevancia industrial como prueba de principio, lo que permitió conocer la tasa de crecimiento, la morfología y la heterogeneidad fenotípica durante ciertos períodos de tiempo, lo que difícilmente es posible con los métodos convencionales.

Biorreactor de picolitro microfluídico para análisis microbiano de una sola célula: fabricación, configuración del sistema y operación

Las vesículas gigantes que contienen componentes altamente empaquetados del tamaño de un micrómetro son modelos celulares útiles. El método de centrifugación en emulsión de agua en aceite es una herramienta sencilla y potente para la preparación de vesículas gigantes con materiales encapsulados.

Preparación de vesículas gigantes Encapsulating microesferas por centrifugación de una emulsión de agua-en-aceite

Se presenta un método para el análisis de microfluídica de linajes de células bacterianas individuales utilizando Bacillus subtilis como ejemplo. El método supera las deficiencias de los tradicionales métodos analíticos en Microbiología por lo que permite la observación de cientos de generaciones de celular bajo condiciones de crecimiento muy uniforme y controlable.

Sola célula microfluídicos análisis de Bacillus subtilis

Aquí, describimos un método de microaspiración de una sola célula para la separación de las amebas infectadas. Con el fin de separar subpoblaciones virales en Vermamoeba vermiformis infectados por Faustovirus y virus gigantes desconocidos, desarrollamos el protocolo detallado a continuación y demostramos su capacidad para separar dos nuevos virus gigantes de baja abundancia.

Microaspiración de células únicas como estrategia alternativa a la clasificación celular activada por fluorescencia para la separación de mezclas de virus gigantes

Las bacterias secretan vesículas extracelulares (EV) de tamaño nanométrico que transportan moléculas biológicas bioactivas. La investigación EV se centra en comprender su biogénesis, su papel en las interacciones y enfermedades microbio-microbio y huésped-microbio, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se presenta un flujo de trabajo para el aislamiento escalable de vehículos eléctricos de varias bacterias para facilitar la estandarización de la investigación de vehículos eléctricos.

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

El presente protocolo proporciona descripciones detalladas para el aislamiento, la concentración y la caracterización de vesículas extracelulares de cultivos de cianobacterias. También se discuten los enfoques para purificar vesículas de cultivos a diferentes escalas, las compensaciones entre metodologías y las consideraciones para trabajar con muestras de campo.

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares cianobacterianas

Este protocolo describe el método de emulsión invertida utilizado para encapsular un sistema de expresión libre de células (CFE) dentro de una vesícula unilaminar gigante (GUV) para la investigación de la síntesis e incorporación de una proteína de membrana modelo en la bicapa lipídica.

Reconstitución del canal receptor de glutamato bacteriano mediante encapsulación de un sistema de expresión libre de células

Este artículo presenta un método para preparar vesículas unilaminares gigantes compuestas (cGUV) con una estructura de vesícula en vesícula, con conductividad eléctrica personalizada en regiones internas, anulares y externas. La electroformación sintetiza GUV simples, que se transforman en estomatocitos y cGUV mediante choque osmótico, proporcionando un modelo valioso para estudiar la biofísica de las células nucleadas.

Síntesis de vesículas unilamelares gigantes compuestas: un modelo biomimético de células nucleadas

Aprende a cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de vesículas gigantes usando el método de transferencia de gotas. Esta técnica permite la observación directa del crecimiento bacteriano.

Cultivo celular bacteriano en el nivel de una sola célula dentro de las vesículas gigantes

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