Difracción de rayos X del músculo esquelético murino intacto como herramienta para el estudio de la base estructural de la enfermedad muscular
18 de julio de 2019
Presentamos protocolos detallados para realizar experimentos de difracción de rayos X de ángulo pequeño utilizando músculos esqueléticos de ratón intactos. Con la amplia disponibilidad de modelos de ratón transgénicos para enfermedades humanas, esta plataforma experimental puede formar un banco de pruebas útil para esclarecer la base estructural de las enfermedades musculares genéticas
El músculo esquelético de ratón fisiológicamente intacto puede producir patrones de difracción de rayos X de alta calidad que contienen mucha información estructural que puede proporcionar información sobre los procesos fisiológicos. La difracción de rayos X es la única técnica que permite la adquisición de información estructural de alta resolución del tejido muscular vivo en condiciones fisiológicas reales en tiempo fisiológico real. Muchas enfermedades musculares se heredan.
Con una mayor disponibilidad para modificar genéticamente la mayoría de los modelos de miopatías, la difracción de rayos X puede proporcionar información estructural sobre los mecanismos de la enfermedad e indicar estrategias terapéuticas. La mayoría de los músculos digitorum longus y soleus extensores son particularmente convenientes para este propósito. Pero muchos otros músculos en animales pequeños pueden ser diseccionados intactos y manejados de una manera similar.
Antes de comenzar el procedimiento, encienda el transductor de fuerza motor combinada, el controlador del transductor de fuerza del motor con un estimulador de corriente bifásica de alta potencia y un sistema de control de datos de control de computadora. A continuación, rocía la piel en la extremidad posterior del ratón con la solución fría de Ringer y usa tijeras de disección fina para cortar la piel alrededor del muslo. Usando fórceps número cinco, tire rápidamente de la piel hacia abajo para exponer los músculos y amputar la extremidad posterior.
Coloque la extremidad en un plato diseccionador recubierto de elastómero que contenga la solución de Ringer oxigenada y coloque el plato bajo un microscopio de disección binocular. Para cosechar el músculo soleus, fijar la extremidad posterior con el músculo gastrocnemius mirando hacia arriba. Usa tijeras finas para cortar el tendón distal del grupo muscular gastrocnemius/soleus.
Cortar la fascia a ambos lados del músculo gastrocnemius para permitir que los músculos se levanten suavemente y lentamente lejos del hueso. A continuación, libere el tendón proximal del músculo soleus. Anclar el grupo muscular que contiene el músculo gastrocnemius y el tendón distal en el plato.
Levante suavemente el músculo soleus a través del tendón proximal para separarlo del músculo gastrocnemius, dejando la mayor cantidad posible del tendón distal del soleus. Para cosechar el músculo extens extensor digitorum longus o EDL, ancle la extremidad posterior en la placa con el músculo anterior tibialis hacia arriba y corte la fascia a lo largo del músculo anterior tibialis. Use fórceps para eliminar la fascia y cortar el tendón distal del músculo anterior tibialis.
Levante el músculo anterior tibialis y córtelo cuidadosamente sin tirar del músculo EDL, y abra el lado lateral de la rodilla para exponer los dos tendones. Cortar el tendón proximal, dejándonos gran parte del tendón como sea posible todavía unido al músculo y tire suavemente del tendón para levantar el músculo EDL. A continuación, corte el tendón distal una vez que esté expuesto.
Para montar el músculo cosechado, fijar el músculo a través de los tendones y recortar la mayor cantidad de grasa extra, fascia y tendón como sea posible. Inserte un tendón en un nudo preatado y use fórceps atado de sutura para atar la sutura firmemente. Ate el segundo nudo alrededor del gancho de metal y repita el procedimiento en el otro extremo del tendón.
A continuación, conecte el gancho corto a la parte inferior de la cámara experimental y el gancho largo al motor de transductor de fuerza de modo dual. Burbuja la solución en la cámara experimental con 100% oxígeno. Para optimizar el protocolo de estimulación y la longitud muscular ajuste los micro manipuladores unidos al motor del transductor para generar una tensión basal entre 15 a 20 milinewtons para encontrar los mejores parámetros de estímulo para estirar el músculo.
Ajuste la tensión de estimulación a 40 voltios. La corriente de estimulación se incrementará sistemáticamente hasta que no haya un aumento adicional en la fuerza de contracción. Para encontrar la longitud óptima, aumentar la longitud muscular y activar el músculo con una sola contracción hasta que la fuerza activa deje de aumentar.
Realice una contracción tetánica de un segundo para probar el montaje y estirar el músculo de nuevo a la fuerza basal óptima según sea necesario. A continuación, registre la longitud muscular en milímetros con una pinza digital. Para determinar la posición del haz, utilice un trozo de papel sensible a los rayos X que produzca una mancha oscura en respuesta a los rayos X y un generador de cinta de vídeo para crear una cruz alineada con la marca de grabación en el papel.
Utilizando la interfaz gráfica de usuario suministrada por BioCAT para el posicionador de muestra, centre el músculo en la posición del haz y mueva la etapa de la muestra para oscilar la cámara de muestra a 10 a 20 milímetros por segundo para extender la dosis de rayos X por todo el músculo durante la exposición. Observe la muestra a medida que se mueve para evitar grandes regiones de fascia que contienen colágeno y para asegurarse de que permanece iluminada durante todo el camino de su recorrido. Armar el detector y esperar el gatillo del sistema de adquisición de datos.
A continuación, active los datos mecánicos y de rayos X al mismo tiempo para sincronizarlos. Los patrones de rayos X se recopilarán continuamente en todo el protocolo con un tiempo de exposición de 10 milisegundos y un período de exposición de 50 milisegundos. En esta contracción tetánica isométrica representativa, el músculo EDL se mantuvo en reposo durante 0,5 segundos antes de que se activara durante un segundo, seguido de una relajación de 1,5 segundos.
El patrón de difracción de rayos X muscular puede dar información estructural de resolución de nanómetros de las estructuras dentro de la sarcomere. Las líneas de capa basadas en miosina que contienen filamentos gruesos son fuertes y nítidas en los patrones del músculo en reposo, mientras que las líneas de capa basadas en actina que contienen filamentos delgados son más prominentes en los patrones de la contracción muscular. Los patrones de diferencia obtenidos restando el patrón de reposo del patrón de contratación pueden arrojar luz sobre los cambios estructurales durante el desarrollo de la fuerza en músculo sano y enfermo.
Al seguir estos cambios estructurales en la escala de tiempo de milisegundos de los eventos moleculares durante la contracción muscular y la relajación, los patrones de difracción de rayos X pueden revelar información estructural sustancial. En este análisis representativo de reflexiones ecuatoriales utilizando la rutina de Ecuador en el paquete MuscleX de código abierto, la relación de intensidad ecuatorial indica la proximidad de la miosina a la actina en el músculo en reposo y está estrechamente correlacionada con el número de puentes cruzados unidos en la contracción del músculo esquelético murino. La distancia entre los dos 1, 0 reflejos está inversamente relacionada con el espaciado entre los interfilamentos.
Una disección limpia es la clave para un experimento exitoso de rayos X musculares intactos, así que trate de evitar cualquier daño mecánico durante la preparación muscular. Cualquier protocolo fisiológico estándar con músculos enteros se puede implementar en estos experimentos y se puede utilizar para estudiar la activación muscular, relajación y comportamiento de puente cruzado durante la transiencia mecánica rápida. La manipulación genética de ratones se está volviendo cada vez más sofisticada.
Los nuevos modelos transgénicos de ratón permitirán diseñar experimentos más específicos y perspicaces para indicar nuevas direcciones terapéuticas para las miopatías humanas.
Resumen
Este artículo presenta protocolos para realizar experimentos de difracción de rayos X de pequeño ángulo en músculos esqueléticos de ratón intactos. El método proporciona información sobre la base estructural de las enfermedades musculares genéticas, aprovechando la disponibilidad de modelos de ratón transgénicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biofísica
- Fisiología muscular
Antecedentes
- La difracción de rayos X ofrece información estructural de alta resolución a partir de tejido muscular vivo.
- El entendimiento de las enfermedades musculares puede beneficiarse de las perspectivas obtenidas mediante análisis estructural.
- Los modelos de ratones transgénicos están disponibles en forma creciente para el estudio de las miopatías.
- Músculos específicos como el extensor digital largo y el sóleo son adecuados para estos experimentos.
Objetivo del estudio
- Elucidar los cambios estructurales en el músculo durante la contracción y la relajación.
- Proporcionar una plataforma para estudiar los mecanismos de las enfermedades musculares hereditarias.
- Indicar estrategias terapéuticas potenciales basadas en conocimientos estructurales.
Métodos Utilizados
- Extracción de músculos esqueléticos intactos de ratones.
- Preparación de experimentos de difracción de rayos X en condiciones fisiológicas.
- Uso de un transductor de fuerza de modo dual para la estimulación muscular.
- Recolección de patrones de rayos X para analizar cambios estructurales a escala nanométrica.
Resultados Principales
- Los patrones de difracción de rayos X revelan información estructural sobre los sarcómeros.
- Las diferencias en los patrones entre músculos en reposo y en contracción proporcionan información sobre el desarrollo de la fuerza.
- Los cambios estructurales pueden rastrearse a escalas de tiempo de milisegundos durante la actividad muscular.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de la función muscular y los mecanismos de las enfermedades.
Conclusiones
- El estudio demuestra la utilidad de la difracción de rayos X en la investigación muscular.
- Los conocimientos obtenidos pueden orientar enfoques terapéuticos para enfermedades musculares.
- Este método mejora nuestra comprensión de la fisiología y la patología musculares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La difracción de rayos X de músculo esquelético murino intacto permite un análisis estructural a escala nanométrica en condiciones fisiológicas, estableciendo un vínculo directo entre genotipo y fenotipo funcional en modelos de enfermedades musculares. Este enfoque apoya la validación de objetivos al revelar cambios estructurales en el sarcómero durante el desarrollo de la fuerza, ofreciendo una reducción mecanicista de riesgos para estrategias terapéuticas en miopatías hereditarias. El método mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos mediante la cuantificación del espaciado interfilamentos y la dinámica de los puentes cruzados a escalas de tiempo milisegundo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofarmacia
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas al vincular modificaciones genéticas con cambios estructurales sarcoméricos en músculo intacto.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos mediante lecturas estructurales en tiempo real de las interacciones miosina-actina durante la contracción.
- Valor científico: Apoya la confianza predictiva al cuantificar los correlatos estructurales de la unión del puente cruzado y el espaciado entre filamentos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante la preservación de la arquitectura y la fisiología muscular nativas.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante protocolos de estimulación controlados y la recopilación sincronizada de datos de rayos X.
- Valor científico: Destaca la preparación para cribado mediante resultados estructurales cuantitativos, como las relaciones de intensidad ecuatorial y los análisis de líneas estratificadas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Analiza la relevancia de la enfermedad al vincular los cambios estructurales en modelos transgénicos con los mecanismos de miopatía humana.
- Valor operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el monitoreo longitudinal de la estructura.
- Valor científico: Aborda decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la identificación de biomarcadores estructurales de la progresión de la enfermedad.
Integración de la Secuencia de Trabajo y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la validación preclínica, mediante la caracterización fenotípica estructural de la función muscular en condiciones fisiológicas.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método respalda la comprobación de hipótesis, la aclaración de vías y la reducción de riesgos biológicos mediante el análisis estructural de la dinámica del sarcómero.
- Tamizaje: Describe la preparación del ensayo, su reproducibilidad y sus resultados cuantitativos mediante la adquisición sincronizada de datos mecánicos y de rayos X.
- Análisis: Destaca las mediciones, lecturas o resultados estadísticos que ayudan a los equipos a comparar condiciones, incluidos los ratios de intensidad ecuatorial y el espaciado de reflexiones.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica o la alineación de biomarcadores mediante el seguimiento de cambios estructurales en modelos de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable en lugar de una técnica de uso único, mediante protocolos estandarizados de montaje y estimulación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance/no avance, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en etapas avanzadas.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo y decisiones de avance.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados en fisiología muscular, difracción de rayos X y manejo de modelos transgénicos.
- Requisitos de instrumentación e infraestructura analítica, incluyendo líneas de luz de sincrotrón, transductores de fuerza de modo dual y sistemas sincronizados de adquisición de datos.
- Requisitos de estandarización entre equipos para los protocolos de disección, montaje y estimulación muscular en diferentes laboratorios.
- Consideraciones de adaptación entre sistemas modelo, particularmente para diferentes músculos murinos y modelos de enfermedad.
- Limitaciones prácticas respaldadas por la bibliografía, incluyendo la necesidad de una disección limpia para evitar contaminación por fascia y mantener la integridad de la muestra durante la exposición.
