Name: Difracción de rayos X del músculo esquelético murino intacto como herramienta para el estudio de la base estructural de la enfermedad muscular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprende difracción de rayos X de músculo esquelético murino intacto para estudiar la base estructural de enfermedades musculares hereditarias. Este método revela cambios nanométricos en sarcomeros durante la contracción.

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Esta investigación utilizó recursos de la Advanced Photon Source, una Oficina de Usuarios de Ciencia del Departamento de Energía de los Estados Unidos (DOE, por sus aires) operada para la Oficina de Ciencia del DOE por el Laboratorio Nacional de Argonne bajo el Contrato No. DE-AC02-06CH11357. Este proyecto fue apoyado por la subvención P41 GM103622 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud. El uso del detector Pilatus 3 1M fue proporcionado por la concesión 1S10OD018090-01 de NIGMS. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no refleja necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales o de los Institutos Nacionales de Salud.

Todos los protocolos de experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Tecnología de Illinois (Protocolo 2015-001, Fecha de aprobación: 3 de noviembre de 2015) y siguieron a la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio"9 .
1. Preparación previa al experimento
<ol><li>Preparar 500 ml de la solución de Ringer (contiene: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 1,0 mM CaCl2, 10,0 mM HEPES, 11 mM de glucosa, pH 7,4) recién para cada día del experimento.</li>
	<li>Llene 200 ml de la solución de Ringer en una botella de spray y guárdela a 4 oC en nevera. Llene una placa Petri (10 cm de diámetro) con la solución de Ringer y perfundie con oxígeno 100% conectando el tubo de un cilindro de oxígeno a una piedra de aire del acuario. Los platos De Petri ("platos de disección") fueron recubiertos previamente con un compuesto de elastómero para permitir la inserción de alfileres durante la disección.</li>
	<li>Prepare ganchos de montaje metálicos. Corte dos piezas de alambre de acero inoxidable, de 0,5 mm de diámetro, a la longitud adecuada y doble el alambre en ambos extremos para formar ganchos. Organice todas las herramientas de diselación, tijeras, fórceps de atablimiento de sutura, microtijeras a mano para su uso. NOTA: La parte del gancho debe ser de unos 3 mm de largo. El cable más largo (que termina en un gancho) debe ser de unos 5 cm de largo, y el alambre más corto (que también termina en un gancho) debe ser de aproximadamente 1 cm de largo para adaptarse a las cámaras personalizadas utilizadas en BioCAT y permitir un rango de movimiento suficiente para el brazo del transductor.</li>
	<li>
Conecte y encienda todo el equipo. Esto incluye un motor/transductor de fuerza combinado, un controlador de transductor de motor/fuerza, un estimulador de corriente bifásica de alta potencia y un sistema de adquisición/control de datos controlado por computadora.
	<ol>
<li>Encienda el sistema de adquisición de datos y bistúrelo antes de iniciar el experimento10. Brevemente, calibrando la fuerza añadiendo un conjunto de pesos conocidos, cubriendo hasta el 50% de la fuerza máxima medida por el transductor de fuerza en una progresión lineal, en el transductor de fuerza y registrando los cambios de voltaje de salida. Calibrar la longitud aplicando un conjunto de voltaje de salida conocido al brazo de la palanca y medir el cambio de longitud del brazo.</li>
		<li>Conecte las mangueras del bloque térmico del soporte de la muestra a un baño circulante refrigerado y ajuste la temperatura para mantener la temperatura deseada en la cámara a entre 10 oC y 40 oC. Determine esto empíricamente con antelación ajustando el baño circulante a un rango de temperaturas y midiendo la temperatura en la cámara con un termopar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación muscular
<ol><li>
Eutanasia del ratón
	<ol>
<li>Eutanasia el ratón por inhalación de dióxido de carbono seguida de luxación cervical.</li>
		<li>Rocíe la piel de la extremidad posterior con la solución fría de Ringer para evitar que el cabello sople en la preparación. Retire la piel cortándola alrededor del muslo usando tijeras de disección fina y tire rápidamente de la piel hacia abajo usando #5 fórceps para exponer los músculos.</li>
		<li>Amputar la extremidad posterior y transferirla a una placa de disección que ha sido llena de solución de Ringer oxigenada, y luego colocar bajo un microscopio de disección binocular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de un músculo soleus
	<ol>
<li>Ancle la extremidad posterior hacia abajo en el plato de diseción con el músculo gastrocnemius hacia arriba. Corta el tendón distal del grupo muscular gastrocnemius/soleus y levanta los músculos suavemente y lentamente cortando la fascia a ambos lados del músculo gastrocnemius usando tijeras finas. Aísle el grupo muscular gastrocnemius/soleus de la extremidad después de liberar el tendón proximal del músculo soleus.</li>
		<li>Ancle el grupo muscular que contiene el músculo gastrocnemius y el tendón distal hacia abajo en la placa de diseción. Levante el músculo soleus suavemente a través del tendón proximal y sepárelo del músculo gastrocnemius dejando la mayor parte del tendón distal soleus intacto como sea posible.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de un extensor digitorium longus (EDL) muscular
	<ol>
<li>Ancle la extremidad posterior hacia abajo en la placa de diseción con el músculo anterior tibialis hacia arriba. Corta la fascia a lo largo del músculo tibialis anterior (TA) y tira de ella con fórceps. Identificar y cortar el tendón distal del músculo TA. Levante el músculo TA y córtelo cuidadosamente sin tirar del músculo EDL.</li>
		<li>Cortar el lado lateral de la rodilla y exponer los dos tendones. Cortar el tendón proximal, dejando la mayor cantidad posible del tendón todavía unido al músculo, y levantar el músculo EDL (músculo medial) tirando suavemente del tendón. Corte el tendón distal una vez expuesto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaje del músculo
	<ol>
<li>Anclar el músculo a través de los tendones, y recortar toda la grasa extra, fascia y tendón de distancia tanto como sea posible. Inserte un tendón en un nudo preatado y ate la sutura firmemente con fórceps de sutura. Ate el segundo nudo alrededor del gancho de metal.</li>
		<li>Repita el mismo procedimiento con el gancho largo en el otro extremo del tendón. Asegúrese de que ninguno del cuerpo del músculo es contactado por las suturas. Esto dañará la preparación.</li>
		<li>Fije el gancho corto a la parte inferior de la cámara experimental y el gancho largo al transductor/motor de fuerza de modo dual. Burbuja la solución en la cámara experimental con 100% de oxígeno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Optimización de los protocolos de estimulación y la longitud muscular
	<ol>
<li>Estirar el músculo ajustando los micromanipuladores conectados al transductor/motor para generar una tensión basal entre 15 y 20 mN antes de encontrar los mejores parámetros de estímulo. Ajuste el voltaje de estimulación a 40 V. La corriente de estimulación aumenta sistemáticamente hasta que no hay un aumento adicional en la fuerza de contracción. La corriente más alta encontrada se incrementa en aproximadamente un 50% para garantizar la activación supra-máxima.</li>
		<li>Encuentra la longitud óptima, L0, definida como la longitud muscular que da la máxima fuerza de contracción, aumentando la longitud muscular y activando el músculo con una sola contracción hasta que la fuerza activa (fuerza máxima menos fuerza basal) deje de aumentar.</li>
		<li>Realice una contracción tetanica corta (activación de 1 s) para probar el montaje y estirar el músculo de nuevo a la fuerza basal óptima si es necesario. Registre la longitud muscular en mm con una pinza digital.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Difracción de rayos X
NOTA: La siguiente descripción es para experimentos de difracción de rayos X realizados utilizando el instrumento de difracción de rayos X de ángulo pequeño en la línea de haz BioCAT 18ID en la Fuente Avanzada de Fotones, laboratorio nacional de Argonne, pero métodos similares podrían emplearse en otras líneas de haz como ID 02 en la ESRF (Francia) y BL40XU en SPring8 (Japón). Beamline 18ID se opera a una energía de haz de rayos X fija de 12 keV (0.1033 nm de longitud de onda) con un flujo incidente de 1013 fotones por segundo en el haz completo.
<ol><li>Elija una muestra a la distancia del detector (longitud de la cámara). Utilice una longitud de cámara de 1,8 m para experimentos que examinen las reflexiones de miosina de 2,7 nm de actina y alto orden, como reflejos meridionales de 2,8 nm. Utilice una cámara de 4-6 m para otros experimentos, donde uno está principalmente interesado en detalles finos en el meridiano y las líneas de capa</li>
	<li>
Optimización de la posición de la muestra en la viga
	<ol>
<li>Determine la posición del haz utilizando un trozo de papel sensible a los rayos X que produzca una mancha oscura en respuesta a los rayos X ("una quemadura"). A continuación, utilice un generador de video cruz para crear una cruz alineada con la marca de quemadura en el papel o simplemente haga una marca en la pantalla de video con un rotulador.</li>
		<li>Utilice la interfaz gráfica de usuario suministrada por BioCAT al posicionador de muestra para mover el músculo que se va a centrar en la posición del haz. Oscila la cámara de la muestra a 10-20 mm/s moviendo la etapa de la muestra para extender la dosis de rayos X sobre el músculo durante la exposición. Observe la muestra a medida que se mueve para evitar grandes regiones de fascia (contiene colágeno que contaminará los patrones de difracción) y para asegurarse de que permanece iluminada durante todo el camino de su recorrido. NOTA: Los pasos exactos requeridos en las secciones 3.3 y 3.4 para realizar los ajustes y acciones requeridos utilizando la interfaz gráfica de usuario suministrada por la línea de haz serán específicos de la línea de haz y del detector. Pregunte al personal de la línea de haz sobre cómo realizar estas operaciones.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Configuración del detector CCD (dispositivo acoplado de carga) para patrones de alta resolución desde el músculo en estados estáticos definidos (descanso o durante la contracción isométrica)
	<ol>
<li>Configure el tiempo de exposición y el período de exposición en la interfaz gráfica de usuario con el software de control. Tome una imagen de fondo oscuro antes de tomar la exposición y repita este procedimiento cada 2 horas o después de cambiar el tiempo de exposición para corregir cualquier deriva en la electrónica de lectura del detector.</li>
		<li>Atenúe el haz de rayos X al valor deseado para la exposición. A continuación, tome una imagen. No es posible tomar secuencias de imágenes con este detector. El detector CCD también necesita varios segundos para leer una imagen individual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Configuración del detector de matriz de píxeles para un experimento resuelto en el tiempo
	<ol>
<li>Configure el número de imágenes, el tiempo de exposición y el período de exposición en la interfaz gráfica de usuario. El detector de matriz de píxeles utilizado aquí necesita al menos 1 ms para la lectura. La frecuencia máxima de fotogramas para el detector de recuento de fotones es de 500 Hz. Utilice la señal de salida del detector de recuento de fotones para controlar el obturador de rayos X.</li>
		<li>Atenúe el haz a la intensidad deseada. Armar el detector y esperar el disparador del sistema de adquisición de datos. Sincronice los datos mecánicos y de rayos X accionándolos al mismo tiempo. Los patrones de rayos X se recogen continuamente a lo largo del protocolo a con un tiempo de exposición de 1 ms y un período de exposición de 2 ms. NOTA: El tiempo exacto de exposición y el período de exposición deben determinarse caso por caso para la información deseada y la vida útil observada de la muestra en el haz. Atenúe el haz para no utilizar más haz de rayos X del necesario para proporcionar datos analizables en el período de exposición elegido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Tratamiento muscular post-experimento
<ol><li>Recuperar y sopesar el músculo después de cada experimento mecánico y de rayos X. Calcular el área transversal del músculo utilizando la longitud muscular medida y la masa muscular11 asumiendo una densidad muscular de 1,06 g/mL12.</li>
	<li>Estirar el músculo a la longitud experimental y fijar el músculo en 10% de formalina durante 10 min. Separar el músculo fijo en una serie de haces de fibra seleccionados de lugares a lo largo de toda la sección3de la cruz muscular.</li>
	<li>Mida la longitud del sarcomere utilizando un sistema de medición de longitud de sarcomere de vídeo.</li>
</ol>

<ol><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thick-Filament+Extensibility+in+Intact+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle.</a> Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).</li>
<li>Ma, W., Gong, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Head+Configurations+in+Resting+and+Contracting+Murine+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).</li>
<li>Kiss, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nebulin+stiffens+the+thin+filament+and+augments+cross-bridge+interaction+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).</li>
<li>Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pointed-end+capping+by+tropomodulin+modulates+actomyosin+crossbridge+formation+in+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).</li>
<li>Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fraction+of+strongly+bound+cross-bridges+is+increased+in+mice+that+carry+the+myopathy-linked+myosin+heavy+chain+mutation+MYH4%28L342Q%29%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q).</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).</li>
<li>Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+diffraction+measurements+of+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+in+contracting+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).</li>
<li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+diffraction+evidence+for+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+during+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).</li>
<li>Anderson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mavacamten+stabilizes+a+folded-back+sequestered+super-relaxed+state+of+%CE%B2-cardiac+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of β-cardiac myosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).</li>
<li>National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the care and use of laboratory animals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+%28U.S.%29+%26+National+Academies+Press+%28U.S.%29%22">Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.)</a>. , National Academies Press. (2011).</li>
<li>Rand, C. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/">https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/</a> (2017).</li>
<li>Alexander, R. M. V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimensions+of+knee+and+ankle+muscles+and+the+forces+they+exert%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Movement+Studies%22%5BJournal%5D)">The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert.</a> Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).</li>
<li>Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+Muscle-Fiber+Types+and+Sizes+and+Muscle+Architectural+Properties+in+the+Mouse+Hindlimb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb.</a> Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).</li>
<li>Jiratrakanvong, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiratrakanvong%2C+J+%22MuscleX%3A+software+suite+for+diffraction+X-ray+imaging+V1.13.1%22">MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1</a>. , (2018).</li>
<li>Reconditi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+filament+activation+in+the+heart+is+tuned+to+the+mechanical+task%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Publicaciones recientes de nuestro grupo mostraron que los patrones de rayos X del músculo esquelético del ratón se pueden utilizar para arrojar luz sobre la información estructural sarcomerica del músculo en la salud y la enfermedad1,2,3 especialmente con la mayor disponibilidad de modelos genéticos de ratón modificados para varias miopatías. Los expertos realizan mejor estudios mecánicos de alta resolución en fibras individuales o pequeños paquetes combinados con difracción de rayos X. Si, sin embargo, información mecánica más modesta será suficiente para sus propósitos, toda la preparación muscular permite la recolección de patrones detallados de rayos X de una preparación simple.
Una disección limpia es clave para un exitoso experimento mecánico y de rayos X combinado. Es muy importante no tirar del músculo objetivo, así como otros músculos asociados con el soleus o los músculos EDL durante la disección ya que esto podría romper partes del músculo y conducir a la reducción de la fuerza. También puede conducir a una estructura interna dañada que degradará los patrones de rayos X. Dado que todo se dispersará en el haz de rayos X, es importante limpiar cualquier grasa extra, el colágeno en la fascia, así como cualquier pelo o trozos sueltos de tejido mientras se hace el siguiente protocolo. Para reducir el cumplimiento adicional en la preparación muscular, también es importante atar de forma segura los tendones a los ganchos, lo más cerca posible del cuerpo muscular sin dañarlo.
Diferentes tiempos de exposición a rayos X pueden proporcionar diferentes tipos de información del mismo músculo. Usando el haz completo en 18ID, se puede obtener un patrón ecuatorial analizable en una exposición de 1 ms (ver Figura 2D). Para una reflexión de línea de capa de miosina analizable, normalmente se requiere un tiempo total de exposición de 10 ms. Para recopilar reflexiones meridionales de orden superior, como la M15 (reflexión de miosina meridional de 2,8 nm) y la reflexión de 2,7 nm de actina meridional, normalmente se requiere al menos 1 s de exposición total, pero se recomienda una exposición total superior a 2 s para una alta precisión Medidas.
La elección del detector de rayos X óptimo para el experimento es importante. Para los patrones de rayos X más detallados, un detector de CCD personalizado, como el de BioCAT con funciones de dispersión de puntos de aprox. 40 m y 65 m en el fósforo, puede proporcionar patrones con un alto rango dinámico y una buena resolución espacial, pero solo puede tomar un fotograma a la vez. Para experimentos resueltos por tiempo, el detector de matriz de píxeles de recuento de fotones en BioCAT puede recopilar patrones de rayos X a 500 Hz. Sin embargo, el tamaño de píxel de 172 m con este detector no proporciona suficiente resolución espacial para estudios detallados de la parte interna del meridiano, pero es adecuado para la mayoría de los otros propósitos. BioCAT adquirió un detector de recuento de fotones de alta resolución que proporciona una resolución real de 75 m a una velocidad de fotogramas máxima de 9.000 Hz. Se espera que detectores similares de este tipo suplanten detectores de corriente para estudios musculares en los próximos años.
Con los flujos muy altos de rayos X en sincrotrones de tercera generación, el daño por radiación es una preocupación grave. Siempre es una buena opción para atenuar la viga para no entregar más viga de la necesaria para observar las características de difracción deseadas. La misma exposición total a los rayos X se puede lograr prolongando el tiempo de exposición de un haz atenuado. Una ventaja de los detectores de matriz de píxeles de recuento de fotones es que los fotogramas individuales se pueden sumar junto sin penalización por ruido. Incluso entonces, el daño por radiación es posible. Los signos de daño por radiación incluyen caída de la fuerza máxima de contracción, manchado de reflejos de la línea de capa, incluso cambio de color muscular.
Una de las limitaciones de la preparación intacta del músculo esquelético del ratón es la dificultad para obtener la longitud del sarcomere del músculo intacto durante los experimentos. Los músculos son demasiado gruesos para la microscopía de vídeo y la difracción láser. Mientras que con los desarrollos futuros puede ser posible estimar la longitud del sarcomere directamente desde los patrones de difracción14, en el corto plazo la única opción es medirlo después del experimento como se describe aquí.

La difracción de rayos X de ángulo pequeño de Sincrotrón es el método de elección para estudiar la estructura a escala nm de la contratación activa de preparaciones musculares en condiciones fisiológicas. Es importante destacar que la información estructural de las preparaciones musculares vivas o despellejadas se puede obtener en sincronía con datos fisiológicos, como la fuerza muscular y los cambios de longitud. Ha aumentado el interés en aplicar esta técnica para estudiar la base estructural de las enfermedades musculares hereditarias que tienen su base en mutaciones puntuales en proteínas sarcomricas. La comunidad de biofísica muscular ha sido muy activa en la generación de modelos de ratón transgénicos para estas condiciones de enfermedades humanas que podrían proporcionar camas de prueba ideales para estudios estructurales. Publicaciones recientes de nuestro grupo1,2,3 y otros4,5 han indicado que los patrones de rayos X del ratón extensor digitorum longus (EDL) y los músculos soleus pueden proporcionar todos los músculos soleus pueden proporcionar todos los músculos soleus pueden proporcionar todos los músculos soleus pueden proporcionar todos los información de difracción disponible en organismos modelo más tradicionales como el músculo esquelético de psoas de rana y conejo. Una ventaja de la preparación del músculo esquelético del ratón es la facilidad de la disección y la realización de experimentos fisiológicos musculares enteros intactos de membrana. Las dimensiones del músculo diseccionado tienen suficiente masa para producir patrones musculares muy detallados en tiempos de exposición de rayos X muy cortos (milisegundos por fotograma) en líneas de haz de rayos X de tercera generación.
Los patrones de difracción de rayos X musculares consisten en las reflexiones ecuatoriales, los reflejos meridionales, así como los reflejos de la línea de capa. La relación de intensidad ecuatorial (relación de la intensidad de los reflejos ecuatoriales 1,1 y 1,0, I11/I10), está estrechamente correlacionada con el número de puentes cruzados conectados, que es proporcional a la fuerza generada en el músculo esquelético del ratón 2. Las reflexiones meridionales que informan de las periodicidades dentro de los filamentos gruesos y delgados se pueden utilizar para estimar la extensibilidad de filamentos1,3,6,7. Las características de difracción que no están en el meridiano y el ecuador se llaman líneas de capa, que surgen de las cabezas de miosina ordenadas aproximadamente helically en la superficie de la columna vertebral del filamento grueso, así como de los filamentos delgados ordenados aproximadamente hélically. La intensidad de las líneas de capa de miosina está estrechamente relacionadacon el grado de orden de las cabezas de miosina en diversas condiciones 2,8. Toda esta información se puede utilizar para estudiar los comportamientos de las proteínas sarcomricas in situ en la salud y la enfermedad.
La difracción de rayos X sincrotrón del músculo ha sido realizada históricamente por equipos de expertos altamente especializados, pero los avances en tecnología y la disponibilidad de nuevas herramientas de reducción de datos indican que esto no siempre tiene por qué ser el caso. El BioCAT Beamline 18ID en la Fuente De Fotón Avanzado, Laboratorio Nacional de Argonne tiene personal dedicado e instalaciones de apoyo para realizar experimentos de difracción de rayos X musculares que pueden ayudar a los recién llegados al campo a comenzar en el uso de estas técnicas. Muchos usuarios optan por colaborar formalmente con el personal de BioCAT, pero un número cada vez mayor de usuarios encuentran que pueden hacer los experimentos y el análisis ellos mismos reduciendo la carga en el personal de la línea de haz. El objetivo principal de este documento es proporcionar capacitación que proporcione a los experimentadores potenciales la información que necesitan para planificar y ejecutar experimentos en el sistema muscular esquelético del ratón, ya sea en la línea de haz BioCAT o en otras líneas de haz de alto flujo alrededor de la mundo donde estos experimentos serían posibles.

<table><tbody><tr><td>#5 pinzas</td><td>WPI</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>4/0 sutura quirúrgica</td><td>Braintree Sci</td><td>SUT-S 108</td><td></td></tr><tr><td>Piedra de aire para acuario</td><td>uxcell</td><td></td><td>una piedra de aire normal de una tienda de mascotas estaría bien</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Detector CCD</td><td>Rayonix Inc</td><td>MAR 165 CCD</td><td></td></tr><tr><td>Datos sistema de adquisición</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>610A</td><td></td></tr><tr><td>Compuesto de elastómero</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Detector de conteo de fotones de alta resolución</td><td>Dectris Inc</td><td>EIGER X 500K</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador de corriente bifásico de alta potencia</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>701</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris</td><td>WPI</td><td>501263-G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Micro tijera</td><td>WPI</td><td>503365</td><td></td></tr><tr><td>Motor/transductor de fuerza</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>300C-LR</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Detector de conteo de fotones</td><td>Dectris Inc</td><td>Pilatus 3 1M</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de acero inoxidable</td><td>McMaster-carr</td><td>8908K21</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de atado de sutura</td><td>WPI</td><td>504498</td><td></td></tr><tr><td>Video sistema de medición de longitud de sarcómero</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>900B</td><td></td></tr></tbody></table>

difracción de rayos x del músculo esquelético murino intacto como herramienta para el estudio de la base estructural de la enfermedad muscular

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Los modelos de ratón transgénicos han sido herramientas importantes para estudiar la relación del genotipo con el fenotipo para enfermedades humanas, incluidas las del músculo esquelético. Se ha demostrado que el músculo esquelético del ratón produce patrones de difracción de rayos X de alta calidad en líneas de haz sincrotrón de tercera generación, lo que proporciona la oportunidad de vincular los cambios a nivel del genotipo con fenotipos funcionales en salud y enfermedad al determinar las consecuencias estructurales de los cambios genéticos. Presentamos protocolos detallados para la preparación de muestras, la recopilación de los patrones de rayos X y la extracción de parámetros estructurales relevantes de los patrones de rayos X que pueden ayudar a guiar a los experimentadores que deseen realizar tales experimentos por sí mismos.

Contracción tetánica isométrica. Cualquier tipo de experimento mecánico muscular clásico, como contracciones isométricas o isotónicas, se puede realizar con la adquisición simultánea de patrones de rayos X. Figura 1 A muestra la configuración experimental para experimentos mecánicos y de rayos X. En la Figura 1Bse muestra un seguimiento de fuerza de ejemplo para una contracción tetánica isométrica. El músculo se mantuvo en reposo durante 0,5 s antes de activarse durante 1 s. La grabación mecánica se detiene 1 s después del estímulo. Los patrones de rayos X se recogieron continuamente a lo largo del protocolo a 1 ms de tiempo de exposición a 500 Hz.
Patrones de difracción de rayos X. El patrón de difracción de rayos X muscular puede dar información estructural de resolución de nanómetros de estructuras dentro del sarcomere. Los patrones de difracción de rayos X musculares se componen de cuatro cuadrantes equivalentes divididos por el ecuador y el meridiano. El patrón ecuatorial surge del empaque de miofilamento dentro del sarcomere perpendicular al eje de fibra, mientras que los patrones meridionales informan información estructural de los miofilamentos a lo largo del eje muscular. Las reflexiones restantes que no se encuentran en el ecuador o en el meridiano se denominan líneas de capa. Las líneas de capa (por ejemplo, entidades etiquetadas MLL4 y ALL6 en la Figura 2A)surgen de la disposición aproximadamente helicoidal de las subunidades moleculares dentro de la miosina que contienen filamentos gruesos y la actina que contiene filamentos delgados. Las líneas de capa basadas en miosina son fuertes y nítidas en patrones de músculo en reposo (Figura2A), mientras que las líneas de capa basadas en actina son más prominentes en patrones de músculo de conserciación (Figura2B). Los patrones de diferencia obtenidos al restar el patrón de reposo del patrón de contratación (Figura2C) pueden arrojar luz sobre los cambios estructurales durante el desarrollo de la fuerza en el músculo sano y enfermo. Siguiendo estos cambios estructurales en la escala de tiempo de milisegundos de los eventos moleculares durante la contracción muscular, los patrones de difracción de rayos X pueden revelar información estructural sustancial (Figura2D).
Análisis de datos mediante MuscleX. Este es un ejemplo de análisis de reflexiones ecuatoriales utilizando la rutina "ecuador" en el paquete MuscleX (Figura 3). MuscleX es un paquete de software de análisis de código abierto desarrollado en BioCAT13. La relación de intensidad ecuatorial (I1,1/I1,0) es un indicador de la proximidad de la miosina a la actina en el músculo en reposo (Figura3A), mientras que está estrechamente correlacionada con el número de puentes cruzados conectados en la contratación ( Figura 3B) músculo esquelético murino2. La relación de intensidad, I1,1/I1,0, es de aproximadamente 0,47 en el músculo en reposo y aproximadamente 1,2 en el músculo de contracción. La distancia entre los dos 1,0 reflejo (2 * S1,0) está inversamente relacionada con el espaciado entre filamentos. La documentación detallada y los manuales de MuscleX están disponibles en línea13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig1.jpg"> Figura 1 : Configuración y protocolo de experimentos mecánicos y de rayos X. (A) El músculo se monta en un extremo en un gancho dentro de la cámara experimental y el otro extremo a un transductor de motor/fuerza de modo dual. Se mantiene entre dos ventanas de película Kapton para permitir el paso de los rayos X. La cámara está llena de la solución de Ringer perfundida con 100% de oxígeno durante todo el experimento. (B) El protocolo mecánico para experimentos de rayos X en un músculo durante la contracción tetánica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig2.jpg"> Figura 2 : Patrones de difracción de rayos X EDL. Patrón de difracción de rayos X muscular EDL por reposo (A) y contraer (B) músculo. (C) El patrón de diferencia entre el patrón de reposo y de contratación. La región azul indica alta intensidad en el patrón de reposo, mientras que la región amarilla representa una alta intensidad en el patrón de contratación. (D) Patrón de difracción de rayos X a partir de una exposición de 1 ms con músculo EDL. MLL1 - Línea de capa de myosin de primer orden; MLL4 - Línea de capa de miosina de cuarto orden; ALL1 - Línea de capa actin de primer orden ALL6 - Sexta línea de capa de actina de orden; ALL7 - Línea de capa de actina de séptimo orden; Reflejo de tropomiosina (indicado por una caja blanca); M3 - reflexión meridional de tercer orden; M6 - reflexión meridional de sexto orden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig3.jpg"> Figura 3 : Análisis de datos de patrones ecuatoriales utilizando MuscleX. El fondo restaba el perfil de la relación de intensidad ecuatorial (mientras que el área) y las primeras cinco órdenes (líneas verdes) eran adecuadas para calcular la intensidad de cada pico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Presentamos protocolos detallados para realizar experimentos de difracción de rayos X de ángulo pequeño utilizando músculos esqueléticos de ratón intactos. Con la amplia disponibilidad de modelos de ratón transgénicos para enfermedades humanas, esta plataforma experimental puede formar un banco de pruebas útil para esclarecer la base estructural de las enfermedades musculares genéticas

Difracción de rayos X del músculo esquelético murino intacto como herramienta para el estudio de la base estructural de la enfermedad muscular

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

El músculo esquelético de ratón fisiológicamente intacto puede producir patrones de difracción de rayos X de alta calidad que contienen mucha información estructural que puede proporcionar información sobre los procesos fisiológicos. La difracción de rayos X es la única técnica que permite la adquisición de información estructural de alta resolución del tejido muscular vivo en condiciones fisiológicas reales en tiempo fisiológico real. Muchas enfermedades musculares se heredan.Con una mayor disponibilidad para modificar genéticamente la mayoría de los modelos de miopatías, la difracción de rayos X puede proporcionar información estructural sobre los mecanismos de la enfermedad e indicar estrategias terapéuticas. La mayoría de los músculos digitorum longus y soleus extensores son particularmente convenientes para este propósito. Pero muchos otros músculos en animales pequeños pueden ser diseccionados intactos y manejados de una manera similar.Antes de comenzar el procedimiento, encienda el transductor de fuerza motor combinada, el controlador del transductor de fuerza del motor con un estimulador de corriente bifásica de alta potencia y un sistema de control de datos de control de computadora. A continuación, rocía la piel en la extremidad posterior del ratón con la solución fría de Ringer y usa tijeras de disección fina para cortar la piel alrededor del muslo. Usando fórceps número cinco, tire rápidamente de la piel hacia abajo para exponer los músculos y amputar la extremidad posterior.Coloque la extremidad en un plato diseccionador recubierto de elastómero que contenga la solución de Ringer oxigenada y coloque el plato bajo un microscopio de disección binocular. Para cosechar el músculo soleus, fijar la extremidad posterior con el músculo gastrocnemius mirando hacia arriba. Usa tijeras finas para cortar el tendón distal del grupo muscular gastrocnemius/soleus.Cortar la fascia a ambos lados del músculo gastrocnemius para permitir que los músculos se levanten suavemente y lentamente lejos del hueso. A continuación, libere el tendón proximal del músculo soleus. Anclar el grupo muscular que contiene el músculo gastrocnemius y el tendón distal en el plato.Levante suavemente el músculo soleus a través del tendón proximal para separarlo del músculo gastrocnemius, dejando la mayor cantidad posible del tendón distal del soleus. Para cosechar el músculo extens extensor digitorum longus o EDL, ancle la extremidad posterior en la placa con el músculo anterior tibialis hacia arriba y corte la fascia a lo largo del músculo anterior tibialis. Use fórceps para eliminar la fascia y cortar el tendón distal del músculo anterior tibialis.Levante el músculo anterior tibialis y córtelo cuidadosamente sin tirar del músculo EDL, y abra el lado lateral de la rodilla para exponer los dos tendones. Cortar el tendón proximal, dejándonos gran parte del tendón como sea posible todavía unido al músculo y tire suavemente del tendón para levantar el músculo EDL. A continuación, corte el tendón distal una vez que esté expuesto.Para montar el músculo cosechado, fijar el músculo a través de los tendones y recortar la mayor cantidad de grasa extra, fascia y tendón como sea posible. Inserte un tendón en un nudo preatado y use fórceps atado de sutura para atar la sutura firmemente. Ate el segundo nudo alrededor del gancho de metal y repita el procedimiento en el otro extremo del tendón.A continuación, conecte el gancho corto a la parte inferior de la cámara experimental y el gancho largo al motor de transductor de fuerza de modo dual. Burbuja la solución en la cámara experimental con 100% oxígeno. Para optimizar el protocolo de estimulación y la longitud muscular ajuste los micro manipuladores unidos al motor del transductor para generar una tensión basal entre 15 a 20 milinewtons para encontrar los mejores parámetros de estímulo para estirar el músculo.Ajuste la tensión de estimulación a 40 voltios. La corriente de estimulación se incrementará sistemáticamente hasta que no haya un aumento adicional en la fuerza de contracción. Para encontrar la longitud óptima, aumentar la longitud muscular y activar el músculo con una sola contracción hasta que la fuerza activa deje de aumentar.Realice una contracción tetánica de un segundo para probar el montaje y estirar el músculo de nuevo a la fuerza basal óptima según sea necesario. A continuación, registre la longitud muscular en milímetros con una pinza digital. Para determinar la posición del haz, utilice un trozo de papel sensible a los rayos X que produzca una mancha oscura en respuesta a los rayos X y un generador de cinta de vídeo para crear una cruz alineada con la marca de grabación en el papel.Utilizando la interfaz gráfica de usuario suministrada por BioCAT para el posicionador de muestra, centre el músculo en la posición del haz y mueva la etapa de la muestra para oscilar la cámara de muestra a 10 a 20 milímetros por segundo para extender la dosis de rayos X por todo el músculo durante la exposición. Observe la muestra a medida que se mueve para evitar grandes regiones de fascia que contienen colágeno y para asegurarse de que permanece iluminada durante todo el camino de su recorrido. Armar el detector y esperar el gatillo del sistema de adquisición de datos.A continuación, active los datos mecánicos y de rayos X al mismo tiempo para sincronizarlos. Los patrones de rayos X se recopilarán continuamente en todo el protocolo con un tiempo de exposición de 10 milisegundos y un período de exposición de 50 milisegundos. En esta contracción tetánica isométrica representativa, el músculo EDL se mantuvo en reposo durante 0,5 segundos antes de que se activara durante un segundo, seguido de una relajación de 1,5 segundos.El patrón de difracción de rayos X muscular puede dar información estructural de resolución de nanómetros de las estructuras dentro de la sarcomere. Las líneas de capa basadas en miosina que contienen filamentos gruesos son fuertes y nítidas en los patrones del músculo en reposo, mientras que las líneas de capa basadas en actina que contienen filamentos delgados son más prominentes en los patrones de la contracción muscular. Los patrones de diferencia obtenidos restando el patrón de reposo del patrón de contratación pueden arrojar luz sobre los cambios estructurales durante el desarrollo de la fuerza en músculo sano y enfermo.Al seguir estos cambios estructurales en la escala de tiempo de milisegundos de los eventos moleculares durante la contracción muscular y la relajación, los patrones de difracción de rayos X pueden revelar información estructural sustancial. En este análisis representativo de reflexiones ecuatoriales utilizando la rutina de Ecuador en el paquete MuscleX de código abierto, la relación de intensidad ecuatorial indica la proximidad de la miosina a la actina en el músculo en reposo y está estrechamente correlacionada con el número de puentes cruzados unidos en la contracción del músculo esquelético murino. La distancia entre los dos 1, 0 reflejos está inversamente relacionada con el espaciado entre los interfilamentos.Una disección limpia es la clave para un experimento exitoso de rayos X musculares intactos, así que trate de evitar cualquier daño mecánico durante la preparación muscular. Cualquier protocolo fisiológico estándar con músculos enteros se puede implementar en estos experimentos y se puede utilizar para estudiar la activación muscular, relajación y comportamiento de puente cruzado durante la transiencia mecánica rápida. La manipulación genética de ratones se está volviendo cada vez más sofisticada.Los nuevos modelos transgénicos de ratón permitirán diseñar experimentos más específicos y perspicaces para indicar nuevas direcciones terapéuticas para las miopatías humanas.

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Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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Los cambios en las extremidades mecánicas propiedades contráctiles del músculo y pasiva son importantes biomarcadores para enfermedades musculares. Este manuscrito describe ensayos fisiológicos para medir estas propiedades en el extensor largo común de los dedos y tibial murino músculos anteriores.

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enfermedades neuromusculares a menudo presentan una patología de variación temporal y espacialmente heterogéneos y de múltiples facetas. El objetivo de este protocolo es la caracterización de esta patología usando métodos de resonancia magnética no invasivos.

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Aquí se muestra un método para visualizar la ultraestructura de la matriz extracelular en tejidos cardíacos descelularizados.

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Medición de la función contráctil del músculo esquelético roedor es una útil herramienta que puede utilizarse para seguir la progresión de la enfermedad, así como eficacia de la intervención terapéutica. Describimos aquí la evaluación no invasiva, de en vivo de los músculos dorsiflexores que puede repetirse en el tiempo en el mismo ratón.

Evaluación no invasiva de la función muscular de los dorsiflexores en ratones

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Aislamiento de miofiber único y cultura de un modelo murino de distrofia muscular de Emery-Dreifuss en el desarrollo post-Natal temprano

Describimos un protocolo para obtener fibras disociadas enzimáticamente de diferentes longitudes y tipos a partir de seis músculos de ratones adultos: tres de ellos ya descritos (flexor corto de los dedos, extensor largo de los dedos, sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo, peroneo largo, peroneo largo de los dedos cuartos).

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Este protocolo utiliza la tomografía microcomputarizada para permitir la cuantificación rentable de la masa magra, incluido el músculo esquelético y el tejido visceral, el tejido adiposo y el tejido esquelético en animales pequeños. Distingue entre tejido magro y adiposo, lo que ofrece ventajas significativas para la investigación biomédica, particularmente en la investigación traslacional en animales pequeños.

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Amyloide y la arquitectura Cross-Beta

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Aprende difracción de rayos X de músculo esquelético murino intacto para estudiar la base estructural de enfermedades musculares hereditarias. Este método revela cambios nanométricos en sarcomeros durante la contracción.

Difracción de rayos X del músculo esquelético murino intacto como herramienta para el estudio de la base estructural de la enfermedad muscular (Video) | JoVE Journal

Difracción de rayos X del músculo esquelético murino intacto como herramienta para el estudio de la base estructural de la enfermedad muscular

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