Matriz basada en tumores completamente humana en ensayo de invasión de esferoide tridimensional
7 de mayo de 2019
El microambiente tumoral es una parte esencial del crecimiento del cáncer y la invasión. Para imitar la progresión del carcinoma, se necesita una matriz humana biológicamente relevante. Este Protocolo introduce una mejora para el ensayo de invasión de esferoide tridimensional in vitro aplicando una matriz basada en Leiomioma humana. El protocolo también introduce un análisis de invasión celular basado en computadora.
Como ya sabemos, el microambiente tumoral es una parte esencial del crecimiento y la invasión del cáncer. Para imitar la progresión del carcinoma, necesitamos una matriz tumoral humana biológicamente relevante. Este es el único ensayo de invasión in vitro basado en la matriz tumoral humana.
En comparación con el ensayo esferoide clásico, este método no es tan sensible a la temperatura y no requiere transferencia de esferoide. Esta técnica es adecuada para muestras de cáncer sólido derivadas del paciente, como el carcinoma de cabeza y cuello, y puede extenderse hacia la medicina personalizada, incluidas las terapias de quimiodiación. Esta matriz basada en tumores humanos ya se ha utilizado para varias aplicaciones, incluyendo pruebas de fármacos de alto rendimiento, análisis de células vivas, cicatrización de heridas y ensayos de transferencia.
El paso más técnicamente sensible es el manejo del método del fibrinógeno se agrega por lo que es posible que desee primero practicar este paso con pozos vacíos. Es importante mostrar el manejo adecuado de la matriz y es fácil de analizar mostrando el método visualmente. Para la generación de esferoides tumorales multicelulares, dispensar una vez 10 a las terceras células de la línea celular de interés en 50 microlitros de medio completo en cada pozo de una placa de fondo redondo de unión ultra-baja de 96 pozos.
A continuación, coloque la placa en una incubadora de cultivo celular de dióxido de carbono de 37 grados Celsius y 5% de carbono durante cuatro días antes de confirmar visualmente la formación de esferoides tumorales con un microscopio invertido. Para establecer un ensayo de invasión de esferoides tridimensional, descongele la matriz derivada del mioma humano sobre el hielo y descongele la solución de stock de fibrinógenos en un baño de agua de 37 grados centígrados. Cuando los reactivos se hayan calentado, mezcle los volúmenes apropiados de matriz completa derivada del mioma humano, trombina, aprotinina y fibrinógeno, añadiendo el fibrinógeno justo antes de dispensar la mezcla de matriz en las células.
Añadir inmediatamente 50 microlitros del gel resultante en cada pozo de la placa de cultivo de esferoides, dirigiendo la punta hacia la pared interior de cada pozo y pipeteando la ralentización sin mover el esferoide desde el centro del pozo. Dado que el fibrinógeno comienza a gel después de unos minutos, requiere un pipeteo inverso robusto pero preciso y el tratamiento de sólo unos pocos pozos a la vez. Devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante 30 minutos para permitir que el gel de fibrina de matriz derivada del mioma humano se solidifique antes de agregar suavemente 100 microlitros de medio completo a la parte superior de cada gel.
A continuación, imagine la invasión esferoide diariamente. Para la segmentación de imágenes con ilastik, abra el software de clasificación y segmentación de imágenes de código abierto y seleccione Flujo de trabajo de clasificación de píxeles. Guarde el proyecto ilastik en el equipo.
Los píxeles se clasificarán en función de las anotaciones realizadas por el usuario. Haga clic en Datos de entrada y Agregar nuevo para seleccionar imágenes para el análisis. Para la selección de operaciones, haga clic en Selección de operaciones y Seleccionar operaciones.
Haga clic en los cuadros correspondientes para seleccionar las características de interés. Los cuadros seleccionados se volverán verdes. Para un entrenamiento, haga clic en Entrenamiento.
En la sección Entrenamiento, debe haber dos etiquetas, Etiqueta 1 y Etiqueta 2. Marque el fondo con una de las etiquetas y marque las celdas con la otra etiqueta. Cuando se hayan etiquetado todas las celdas y el fondo de la primera imagen, seleccione la siguiente imagen de la vista actual para continuar marcando las celdas y el fondo hasta que se haya marcado el 10% de las imágenes.
A continuación, seleccione Live Update para analizar todas las imágenes. Cuando se haya completado el entrenamiento y ilastik haya analizado todas las imágenes, haga clic en Predicción de exportación y seleccione Segmentación simple desde origen. A continuación, seleccione el formato de archivo de salida deseado en Elegir configuración de imagen de exportación y haga clic en Exportar todo para exportar los resultados del etiquetado.
Los archivos se exportarán a la misma carpeta con las imágenes originales. Para el análisis de área, abra primero la imagen original con una barra de escala en Fiji ImageJ, teniendo cuidado de que la imagen tenga el mismo tamaño y dimensión que las imágenes analizadas. Utilice la herramienta de selección de líneas para dibujar una línea de una longitud conocida y haga clic en Analizar y establecer escala.
A continuación, establezca la distancia conocida en el campo Distancia conocida. Establezca la unidad adecuada y haga clic en Global. Para instalar el complemento ilastik, haga clic en Ayuda y actualización y haga clic en Administrar sitios de actualización en la ventana del actualizador de ImageJ.
Haga clic junto a ilastik, Cerrar y Aplicar cambios. Después de varios minutos, aparecerá una ventana de información que dice que se ha actualizado correctamente. Haga clic en Aceptar y reinicie ImageJ.
A continuación, haga clic en Plugins, Macros e Instalar y seleccione el contador. archivo ijm. A continuación, haga clic en Abrir.
Para completar el análisis de área, haga clic en Plugins y desplácese para seleccionar ilastik. Seleccione Importar HDF5 y seleccione el archivo con el formato h5. Haga clic en Abrir y cargar y aplique la tabla de búsqueda.
A continuación, haga clic en el botón A en el teclado y el área aparecerá en la ventana de resumen como el área total. En este experimento representativo, cuatro días después de la siembra de la línea de carcinoma de células escamosas laringe metastásica, se añadió matriz a los esferoides formados como se demostró y la invasión fue monitoreada diariamente en un microscopio invertido. Una vez incrustadas, las células de la matriz de fibrina derivada del mioma humano comenzaron a invadir rápidamente después de un día y se extendieron a la matriz durante los dos días siguientes.
Las células de la matriz derivada del sarcoma del ratón no invadieron la matriz circundante, sino que formaron una estructura asimétrica. Las células del colágeno invadieron ligeramente, pero debido a la contracción de la matriz el análisis se volvió difícil. En algunos pozos, los esferoides incluso desaparecieron después de tres días.
Aquí, se muestra la cuantificación de la invasión de una célula de carcinoma de células escamosas laríngeas primarias y metastásicas en la matriz de fibrina derivada del mioma humano. El análisis de células vivas de la invasión esferoide de matriz de fibrina derivada de mioma humano revela el movimiento celular en hebras a lo largo de la matriz que es seguido por otras células con el tiempo. Recuerde tener cuidado de no mover el esferoide desde la posición central al agregar la matriz a los pozos.
Este procedimiento se puede utilizar para estudiar cómo la irradiación y moléculas específicas como los medicamentos contra el cáncer afectan la invasión. Las células se pueden fijar y teñir para estudios posteriores. En el modelo clásico de sarcoma de ratón, las células proliferan principalmente y el aspecto de invasión es mínimo.
Esta matriz basada en tumores humanos induce la invasión, haciendo que los estudios de inhibición sean más eficientes.
Descripción general
Este estudio presenta un nuevo ensayo de invasión in vitro en esferoides tridimensionales que utiliza una matriz derivada de leiomioma humano, mejorando la simulación de la progresión del carcinoma. El método permite un análisis mejorado de la invasión de células tumorales y es aplicable a muestras de cáncer sólido derivadas de pacientes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Biología del cáncer
- Microambiente tumoral
- Ensayos in vitro
Antecedentes
- El microambiente tumoral desempeña un papel fundamental en el crecimiento y la invasión del cáncer.
- Una matriz tumoral humana biológicamente relevante es esencial para la modelización precisa de la progresión del carcinoma.
- Este método es menos sensible a la temperatura en comparación con los ensayos clásicos de esferoides.
- Es adecuado para aplicaciones en medicina personalizada, incluyendo terapias de quimiorradiación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un ensayo basado en matriz tumoral humana para estudiar la invasión de células cancerosas.
- Proporcionar un protocolo que minimice los desafíos técnicos asociados con los métodos tradicionales.
- Permitir pruebas de fármacos de alto rendimiento y análisis de células vivas.
Métodos Utilizados
- Generación de esferoides tumorales multicelulares en placas de adherencia ultra baja.
- Preparación de una matriz derivada de leiomioma humano y fibrinógeno para el ensayo de invasión.
- Imagen diaria de la invasión del esferoide mediante un microscopio invertido.
- Análisis de imágenes mediante ilastik para segmentación y cuantificación del área.
Resultados Principales
- Las células en la matriz derivada de leiomioma humano invadieron rápidamente, demostrando una modelización eficaz del comportamiento tumoral.
- La comparación con otras matrices mostró patrones de invasión distintos, destacando las ventajas de la matriz de origen humano.
- El análisis de células vivas reveló un movimiento celular dinámico e invasión a lo largo del tiempo.
- El método puede adaptarse para estudiar los efectos de diversos tratamientos sobre la invasión tumoral.
Conclusiones
- La matriz derivada de mioma humano proporciona una plataforma sólida para estudiar la invasión de células cancerosas.
- Este ensayo puede facilitar la investigación sobre intervenciones terapéuticas para el cáncer.
- El manejo adecuado y la metodología son cruciales para la implementación exitosa del ensayo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este ensayo aborda un vacío crítico en la investigación preclínica del cáncer al proporcionar una matriz derivada de tumores humanos que reproduce mejor el microambiente in vivo en comparación con las alternativas derivadas de animales. Permite un modelado más predictivo de la invasión de carcinoma, apoyando la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. La plataforma es adecuada para aplicaciones de cribado y para la continuidad traslacional, particularmente para carcinoma de cabeza y cuello y muestras derivadas de pacientes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas al permitir la validación funcional de dianas en un contexto de matriz extracelular relevante para el ser humano.
- Valor operativo: Reduce la ambigüedad mecanicista mediante la observación directa de fenotipos de invasión en un sistema biológicamente pertinente.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al identificar compuestos que modulan la invasión en un modelo predictivo del comportamiento tumoral humano.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona un sistema tridimensional estandarizado y reproducible para la evaluación cuantitativa de los efectos de compuestos sobre la invasión celular.
- Valor operativo: Permite pruebas de fármacos de alto rendimiento con variabilidad técnica mínima debido a la reducida sensibilidad a la temperatura y a la ausencia de necesidad de transferir esferoides.
- Escalabilidad: Compatible con placas de 96 pocillos de adherencia ultrabaja, lo que facilita la miniaturización del ensayo y el cribado con múltiples condiciones.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Utiliza una matriz derivada de leiomios humanos para vincular los hallazgos del descubrimiento con la validación preclínica en un sistema relevante para la enfermedad.
- Alineación de Biomarcadores: Facilita el análisis en células vivas de la dinámica de invasión, permitiendo la correlación con firmas moleculares o respuestas al tratamiento.
- Avance Ajustado al Riesgo: Apoya decisiones de avance o interrupción al cuantificar la inhibición de la invasión, un punto final fenotípico clave en la prevención de metástasis.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación de la eficacia preclínica, especialmente para programas centrados en metástasis.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre factores impulsores de la invasión y modificadores de rutas en el contexto del microentorno tumoral humano.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas basadas en imágenes, adecuadas para análisis automatizado y perfilado de compuestos.
- Análisis: Genera mediciones del área de invasión mediante ilastik e ImageJ, permitiendo comparaciones estadísticas entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos al modelar una etapa clave de la metástasis utilizando una matriz derivada de tejido humano.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable aplicable a diversos tipos de cánceres sólidos y modalidades terapéuticas, incluida la quimiorradioterapia.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la dependencia de matrices no humanas que imitan deficientemente el estroma tumoral humano.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante un protocolo definido de preparación de matrices y un flujo de trabajo de imagen.
- Valor estratégico: Aumenta la eficiencia del capital al mejorar la predicción temprana de la trasladabilidad clínica, reduciendo los fracasos en fases avanzadas debido a una modelización deficiente de la metástasis.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en la potencia de inhibición de la invasión en un sistema relevante para el ser humano.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular 3D, manipulación de matrices y técnica estéril para la preparación de geles de fibrina.
- Depende del acceso a microscopios invertidos, ilastik y Fiji ImageJ para la adquisición de imágenes y su análisis.
- Necesita una estandarización entre equipos en la formación de esferoides y la dispensación de matrices para evitar artefactos posicionales.
- La adaptación a otros sistemas modelo requiere la validación de la compatibilidad de la matriz y de la cinética de invasión.
- Limitación práctica: el fibrinógeno inicia una gelación rápida, lo que exige una pipetación precisa y cronometrada para mantener la integridad del esferoide.
