Enriquecimiento de partículas de lipoproteínas nativas con microRNA y determinación posterior de su contenido absoluto/relativo de microRNA y su tasa de transferencia celular

Las partículas de lipoproteínas son vehículos de transporte nativos. El enriquecimiento de sustancias extrañas facilita su uso como portador de vías. El etiquetado específico de moléculas o partículas enteras hace factible medir la absorción celular.

Los dos métodos de enriquecimiento son rápidos y fáciles de usar, y se pueden adaptar para una amplia gama de sustancias. Demostrando el procedimiento serán Markus Axmann y Andreas Karner, dos postdoctorados de mi laboratorio. Para comenzar la delipidación en una campana de humo, mezcle de uno a dos mililitros de solución HDL preparada que contenga cinco miligramos de partículas HDL con 50 mililitros de mezcla preenfriada de tres a dos de éter dietílico de etanol en un tubo de centrifugación cónica.

Incubar durante dos horas a 20 grados centígrados negativos. Centrifugar a 2500 veces g durante 10 minutos a 10 grados Celsius negativos. Deseche el sobrenadante, resuspender el pellet en 50 mililitros de mezcla de éter de etanol dietil preenfriado, y vórtice brevemente.

Incubar por segunda vez durante dos horas a 20 grados centígrados negativos. Centrifugar de nuevo a 2500 veces g durante 10 minutos a 10 grados Celsius negativos. A continuación, inserte tubos que suministren el flujo de gas nitrógeno para secar el pellet.

Y lo resusppend en 250 microlitros del tampón A.Determinar la concentración de proteína utilizando el ensayo de proteína Bradford u otro apropiado. Es fundamental eliminar los restos de la mezcla de éter de etanol dietil, ya que estos disolventes inhibirían la relipidación de las apolipoproteínas. A continuación, diluir a una concentración final de un miligramo de proteína por cada 250 microlitros del tampón A.Inserte un tubo que suministre gas inerte en la parte de la solución en el tubo.

Si es necesario, guarde la solución durante la noche a cuatro grados centígrados bajo la atmósfera de gas inerte. Para comenzar la reconstitución, en un tubo de vidrio limpio, mezcle 100 microlitros de CO, 13,5 microlitros de C y 500 microlitros de PC. A continuación, gire el tubo de vidrio mientras se vacía el gas nitrógeno dentro del tubo para secar la mezcla con el fin de producir una capa de superficie homogénea. En un tubo de reacción de 0,5 mililitros, prepare una solución fresca de espermatozoides de 30 mililitros en el tampón A.Then mezcle 100 microlitros de microARnes sintéticos de 10 micromolares con 100 microlitros de solución de espermatozoides en un tubo de reacción de dos mililitros.

Y incubar durante 30 minutos a 30 grados centígrados. A continuación, transfiera la solución incubada de 200 microlitros al tubo de vidrio para rehidratar la capa de superficie mastermix PC-CO-C preparada. Y luego añadir 50 microlitros de una solución de desoxicolato de sodio de 30 miligramos por mililitro.

Revuelva a cuatro grados centígrados durante dos horas. Después de eso, agregue 250 microlitros de la solución HDL deslipidada en el tubo de vidrio. Y revuelva a cuatro grados centígrados durante la noche.

Para comenzar la diálisis, primero agregue 50 gramos de perlas adsorbentes a 800 mililitros de agua doble destilada. Y usa un agitador magnético para remover durante un minuto. Espere 15 minutos hasta que las cuentas se asienten y decante el sobrenadante.

Repita el procedimiento con PBS preenfriado. Cassettes de diálisis pre-húmedos en PBS. Utilice una jeringa para añadir la mezcla previamente preparada en los cassettes de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Agregue las perlas adsorbentes tratadas con PBS a tres litros de PBS, y coloque los casetes en el PBS para dializar a cuatro grados centígrados. Las perlas mantienen constante el gradiente de densidad a lo largo de la membrana de diálisis. Cambie el búfer y las cuentas después de una hora y dos horas.

Después de 24 horas, con una jeringa, extraiga la solución del cassette en un tubo de reacción de 1,5 mililitros para recuperar la solución de partículas HDL reconstituida. Determinar la concentración de proteínas utilizando el ensayo Bradford. Suministre gas inerte al tubo de reacción, ciérrelo y almacene la solución de partículas HDL reconstituida bajo atmósfera de gas inerte a cuatro grados centígrados.

En primer lugar, preparar una solución fresca de espermatozoides de 30 mililitros en agua libre de RNAse. Mezclar 100 microlitros de 10 micromolares de microARN sintético con 100 microlitros de solución de espermatozoides en un tubo de reacción de dos mililitros. Y incubar durante 30 minutos a 30 grados centígrados.

A continuación, añada 100 microlitros de DMSO y 1,2 mililitros de tampón 1X LDL a la solución de espermatozoides de microARN preparada. Diluir la solución de partículas LDL previamente preparada con PBS a una concentración final de aproximadamente cuatro miligramos por mililitro. A continuación, dibuje 450 microlitros de la solución diluida en un tubo de reacción de 1,5 mililitros y mezcle con 50 microlitros de tampón 10X LDL.

Incubarlo durante 10 minutos sobre hielo. Después de la incubación, combine la solución de partículas LDL de 500 microlitros y la solución de microRNA-espermato-espermicida-DMSO de 1,5 mililitros, e i incuba durante dos horas a 40 grados centígrados. Realice diálisis de forma similar a la descrita anteriormente y almacene la solución de partículas LDL etiquetada bajo atmósfera de gas inerte a cuatro grados centígrados.

Para comenzar, diluya la solución de partículas HDL o LDL en PBS entre uno a 100 y uno a 1.000. Corte la mica presionando la cinta adhesiva contra el sustrato de mica, y tirando de la cinta para quitar las capas superiores de mica. Utilice una pipeta para depositar dos microlitros en mica recién cortada para incubar durante cinco minutos.

Las partículas de lipoproteínas tienden a formar membranas de unión continuas en las superficies. Por lo tanto, es importante ajustar la concentración de partículas en la superficie de la mica para obtener las individuales. Después de la incubación, enjuague la muestra con PBS.

Llene la célula líquida AFM de alta velocidad con PBS y monte el escáner portador de mica en la etapa AFM de alta velocidad. En el software de control, inicie el proceso de aproximación del voladizo a la superficie de la mica. Utilice tamaños de escaneado inferiores a un micrómetro cuadrado y mantenga las fuerzas de imagen lo más bajas posible.

Imagen de la muestra en modo de toque. Cargue los datos en el Gwyddion y detecte las partículas a través de los granos de marca por función de umbral. Ajuste el valor del umbral de altura para enmascarar las partículas individuales.

Por lo general, un nivel alrededor del 50% es un buen punto de partida. Elimine el fondo polinómico para aplanar la imagen y active la opción Excluir región enmascarada. Exporte los valores de altura máxima de las partículas detectadas utilizando la distribución de varias características de grano y repita estos pasos para todas las imágenes grabadas.

En este experimento, la reconstitución de partículas HDL se realizó a través de la delipidación de partículas HDL, seguida de relipidación y diálisis. Se puede lograr un rendimiento del 50% de las partículas DE HDL reconstituidos. Sin embargo, el mismo etiquetado con microARN no era factible para el etiquetado de partículas LDL, debido a la hidrofobicidad de la proteína Apolipoproteína B100.

Por lo tanto, DMSO se utilizó para la penetración de la monocapa lipídica de las partículas LDL, con un rendimiento cercano al 100%Durante el control de calidad, la dilución es crítica para el análisis. La imagen superior muestra una densidad de partículas demasiado alta. La imagen inferior es adecuada para el análisis.

Las funciones de densidad de probabilidad de las alturas de las partículas se calcularon para comparar las distribuciones de tamaño de las partículas de lipoproteínas de control nativas, etiquetadas y etiquetadas. El cambio relativo antes y después del procedimiento de etiquetado es descuidado. Cuando manipule oligonucleótidos de ARN, trabaje sin RNAse.

Use consumibles de plástico desechables frescos y use siempre guantes. Utilice únicamente soluciones libres de nucleasas. AFM de alta velocidad es sólo un método para determinar la forma general de las lipoproteínas.

Un método alternativo sería la microscopía electrónica. Use un equipo de protección personal adecuado y trabaje en una campana de humos mientras manipula el éter dietílico.