Localización de proteínas de SUMO modificado utilizando proteínas de atrapamiento de sumo fluorescente
27 de abril de 2019
El SUMO es una proteína modificadora de ubiquitina, esencial y muy conservada. En este protocolo Describimos el uso de una proteína de captura de SUMO recombinante con tolerancia al estrés (kmUTAG) para visualizar conjugados de SUMO nativos, sin etiquetar y su localización en una variedad de tipos de células.
La importancia de este protocolo es el uso de una nueva proteína UTAG fluorescente que atrapa SUMO para la detección del modificador de proteína SUMO en varias células eucariotas. La principal ventaja de esta técnica es un protocolo sencillo para la detección libre de anticuerpos de SUMO en una variedad de células, incluyendo el cultivo de tejidos de mamíferos y gónadas de nematodos. SUMO desempeña un papel importante en el cáncer y los trastornos neurodegenerativos, y esto subraya la necesidad de herramientas robustas y confiables para la detección y el análisis funcional de proteínas modificadas por SUMO.
Debido a que SUMO está altamente conservado, la proteína UTAG de captura suMO fluorescente se puede utilizar para etiquetar SUMO conjugado en muchos organismos diferentes. Este video demuestra su uso en células de mamíferos. Además, el texto completo describe su uso en ovocitos de nematodos.
La demostración visual de esta técnica proporciona pistas críticas para el tratamiento de las células antes de la tinción y la detección de SUMO. Para empezar, el cultivo de células de cultivo de tejido de elección en la cubierta redonda de 22 milímetros se desliza en placas TC de seis pozos hasta 70 a 80% confluentes. Lave brevemente las células con un mililitro de DPBS.
Para fijar las celdas, agregue dos mililitros de 4%PFA y DPBS frescos a cada pozo. Incubar las células durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave las células fijas tres veces durante cinco minutos en un mililitro de DPBS mientras se nutra la placa.
Para permeabilizar las células, incubar durante 15 minutos con 1%Tritón X-100 en DPBS. Lave las células de nuevo, como antes. Incubar las células con 500 microlitros de 1 pH HCL de glicina molar 2 durante 10 segundos.
A continuación, neutralice el pH inmediatamente con 500 microlitros de 10X SUMO Proteasa buffer, o SPB. Después de lavar las células como antes, retire los resbalones de la cubierta del pozo y colóquelos en una cámara de humedad. Para la tinción UTAG-FL solamente, mezcle un microgramo de UTAG-FL con 100 microlitros de 1X SPB que contengan cinco TCEP mililolares en un tubo.
A continuación, pipetear la mezcla en las celdas de la cubierta y la incubar a temperatura ambiente durante una hora en la cámara de humedad. Para lavar los resbalones de la cubierta, pipetee 200 microlitros de DPBS en cada resbalón de cubierta y déjelo en su lugar durante 10 minutos. Repita el lavado dos veces más.
Retire los resbalones de la cubierta del último lavado e invierta en un portaobjetos pre-limpiado con una gota de medio de montaje. Guarde las muestras durante la noche en un congelador celsius de 20 grados antes de verlos bajo el microscopio. Visualice las celdas utilizando los conjuntos de filtros adecuados para DAPI y Texas Red.
Consulte el texto completo de un protocolo sobre cómo etiquetar las gónadas SUMO y nematodos fijos. Si bien el etiquetado de las células de los mamíferos es bastante sencillo, etiquetar los ovocitos nematodos requiere un entrenamiento previo en las disecciones gónadas. KmUTAG-FL incubado con células PMT2 fijas mostró una tinción nuclear distinta.
Tanto la tinción nuclear difusa como los distintos focos nucleares eran visibles. La localización nuclear se confirmó utilizando la co-tinción con DAPI. De acuerdo con la actividad de captura SUMO de KmUTAG-FL, el patrón de localización nuclear recordaba a la tinción SUMO23.
La comanteta con anticuerpo anti-SUMO23 8A2 confirmó la co-localización de KmUTAG-FL con la señal SUMO23. Esto valida la eficacia de KmUTAG-FL para detectar SUMO23 en células de mamíferos. Gónadas aisladas de hermafrodita adulta productora de ovocitos c.
los nematodos de elegans fueron etiquetados con anticuerpos anti-SUMO. De acuerdo con informes anteriores, anticuerpos anti-SUMO inicialmente localizados en el plasmo nuclear de los oocitos de profosa miótica tardía. Luego se redistribuyó al complejo de anillos centrales de los homólogos emparejados a medida que la envolvente nuclear se rompía y los cromosomas se congresoban hacia la placa metafásica.
En preparaciones paralelas, las gónadas etiquetadas con KmUTAG-FL revelaron patrones similares. KmUTAG-FL cambió de etiquetar el nucleoplasmo a concentrarse en el complejo de anillos a medida que los ovocitos comenzaron y completaron el proceso de descomposición de la envolvente nuclear. Estos resultados validan KmUTAG-FL como una herramienta útil para el análisis de la miosis y los procesos relacionados con SUMO en c.
elegans y posiblemente otros nematodos. Al realizar la fijación, es fundamental utilizar paraformaldehído fresco y un corto tiempo de fijación para mantener suMO plegado de forma nativa para que pueda ser reconocido por el KmUTAG. Dado que la estructura terciaria de SUMO está altamente conservada, es muy probable que las variantes SUMO de sistemas adicionales de modelos y no modelos puedan ser analizadas con el reactivo KmUTAG-FL.
Actualmente, estamos utilizando esta nueva proteína UTAG fluorescente que atrapa SUMO para estudiar la función de SUMO durante el estrés celular. Por último, tenga en cuenta que todos los pasos que utilizan el paraformaldehído fijado deben realizarse en una campana de seguridad de laboratorio y este reactivo debe eliminarse correctamente.
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Resumen
Este protocolo describe el uso de una nueva proteína fluorescente captora de SUMO (kmUTAG) para la detección de conjugados de SUMO en diversas células eucariotas. La técnica permite la visualización de SUMO sin necesidad de anticuerpos, lo cual es fundamental para comprender su papel en el cáncer y los trastornos neurodegenerativos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Modificación de proteínas
Antecedentes
- SUMO es una proteína modificadora similar a la ubiquitina que está altamente conservada entre especies.
- Desempeña funciones importantes en diversos procesos celulares, incluyendo la respuesta al estrés y la localización de proteínas.
- Los métodos confiables de detección de proteínas modificadas por SUMO son esenciales para el análisis funcional.
- Este protocolo utiliza una proteína recombinante capturadora de SUMO para visualizar SUMO en diferentes tipos celulares.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método sencillo para detectar conjugados de SUMO sin el uso de anticuerpos.
- Mostrar la aplicación de kmUTAG en células de mamíferos y ovocitos de nematodos.
- Mejorar la comprensión del papel de SUMO en la salud y la enfermedad.
Métodos Utilizados
- Etiquetado fluorescente de SUMO utilizando la proteína kmUTAG.
- Visualización de conjugados de SUMO en cultivo celular de tejido mamífero.
- Aplicación de la técnica en gónadas de nematodos.
- Análisis de la localización de SUMO en diversas células eucariotas.
Resultados principales
- Visualización exitosa de conjugados de SUMO en diferentes tipos celulares.
- Demuestra la eficacia de kmUTAG para la detección sin anticuerpos.
- Información sobre la localización y función de las proteínas modificadas por SUMO.
- Aplicaciones potenciales en el estudio del papel de SUMO en el cáncer y trastornos neurodegenerativos.
Conclusiones
- La proteína kmUTAG es una herramienta valiosa para la detección de SUMO en diversos organismos.
- Este método simplifica el estudio de las funciones biológicas de SUMO.
- Investigaciones futuras pueden aprovechar esta técnica para explorar las vías relacionadas con SUMO en la salud y la enfermedad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección sin anticuerpos de las modificaciones SUMO permite una validación robusta de dianas en sistemas relevantes para enfermedades, especialmente en programas de oncología y neurodegeneración donde la SUMOilación afecta la estabilidad y función de las proteínas. El reactivo kmUTAG proporciona una herramienta recombinante y transespecífica que reduce la variabilidad del ensayo y apoya la eliminación de riesgos mecanicistas mediante la visualización directa de conjugados SUMO endógenos en células vivas o fijadas. Este enfoque mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al eliminar artefactos dependientes de anticuerpos y permitir la interrogación estandarizada de la vía SUMO en diversos sistemas modelo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación directa de la regulación de proteínas dependiente de SUMO sin interferencia de anticuerpos, apoyando la comprobación de hipótesis en modelos de cáncer y enfermedades neurodegenerativas.
- Valor operativo: La producción recombinante garantiza consistencia entre lotes y escalabilidad para campañas de cribado de alto rendimiento que requieran lecturas de actividad SUMO.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de fluorescencia del estado de conjugación de SUMO, lo que permite la estandarización del ensayo para evaluar cambios en la SUMOilación inducidos por compuestos.
- Valor operativo: Compatible con microscopía estándar y protocolos de fijación, lo que permite su integración en plataformas de ensayos celulares existentes sin necesidad de equipo especializado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita estudios comparativos de localización de SUMO desde células de mamíferos hasta ovocitos de nematodos, apoyando la alineación de biomarcadores traducibles en vías conservadas de respuesta al estrés.
- Valor operativo: Funciona en preparaciones de tejido fijado, permitiendo el análisis retrospectivo de la dinámica de SUMO en modelos preclínicos de enfermedad.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en flujos de trabajo de descubrimiento temprano en los que la modulación de la vía SUMO constituye un mecanismo de acción, proporcionando una validación ortogonal para estudios bioquímicos o genéticos de perturbación de SUMO antes de la optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la selección basada en hipótesis al confirmar la conjugación dirigida a SUMO en respuesta a moduladores de la vía o a la reducción genética.
- Selección: Permite la detección reproducible de la formación de focos de SUMO como lectura fenotípica en ensayos de selección de alto contenido.
- Análisis: Proporciona datos cuantitativos sobre la localización subcelular (nuclear frente a citoplasmática, difusa frente a focal) que pueden correlacionarse con el tratamiento con compuestos o con el fondo genético.
- Investigación Traducional: Demuestra la conservación de los patrones de tráfico de SUMO entre especies, lo que facilita la extrapolación desde modelos de nematodos a sistemas mamíferos.
- Reutilización Empresarial: El kmUTAG-FL recombinante puede almacenarse y compartirse entre departamentos como reactivo estandarizado para el monitoreo de la vía de SUMO.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce los falsos positivos en la detección de SUMO al minimizar la unión al SUMO libre, aumentando la confianza en las señales específicas de los conjugados.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de adquirir, validar y titular anticuerpos, reduciendo los plazos y costos del desarrollo del ensayo.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones de avance o interrupción basadas en la visualización directa del acoplamiento del objetivo con la maquinaria de SUMO, reduciendo la ambigüedad mecanicista en proyectos iniciales.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de compuestos que modulan la SUMOilación, al proporcionar evidencia funcional basada en la localización de la actividad de la vía.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, fijación y microscopía de fluorescencia para la preparación y visualización adecuadas de muestras.
- Depende del acceso a microscopía de fluorescencia con conjuntos de filtros adecuados para los canales DAPI y Texas Red.
- La marcación de ovocitos de nematodos requiere entrenamiento previo en disección de gonadas, lo que limita la escalabilidad inmediata en laboratorios no especializados.
- La fijación con paraformaldehído fresco es fundamental para preservar la estructura terciaria de SUMO, lo que exige un manejo estandarizado de reactivos entre diferentes sitios.
- Aunque es eficaz en células de mamíferos y en C. elegans, puede ser necesario realizar una validación empírica en nuevos sistemas modelo para confirmar la compatibilidad con kmUTAG-FL.
