Name: Evaluación de la estabilidad del almacenamiento de vesículas extracelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprende a evaluar la estabilidad de vesículas extracelulares usando glucuronidasa como marcador exógeno y AF4 para purificación. Este protocolo permite comparar la capacidad de almacenamiento entre diferentes tipos celulares.

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El programa de investigación NanoMatFutur Junior del Ministerio Federal de educación e investigación, Alemania (Grant Number 13XP5029A) apoyó esta labor. Maximilian Richter fue apoyado por la Studienstiftung des Deutschen Volkes (Fundación alemana de becas académicas) a través de una beca de doctorado.

1. el cultivo celular y la producción de medio acondicionado con celdas
<ol><li>En general, cultivar las células en las condiciones individuales requeridas para la línea celular respectiva.</li>
	<li>Cultivar las células durante 24-72 h en condiciones libres de suero o en un medio que contenga suero bovino fetal empobrecido (FBS). Nota: si se utiliza FBS empobrecido por EV, emplear un método comprobado para agotar eficientemente el suero, para evitar la contaminación con EVs derivados del suero de bovino26.</li>
	<li>Recoja el medio de las matraces. Centrifugar a 300 x g durante 10 min para peletiza las células. Recoja cuidadosamente el medio con condicionado celular (CCM), sin perturbar las células granuladas. Preferiblemente, utilice el CCM directamente, o guárdela durante la noche a 4 ° c. Nota: siempre es preferible utilizar el MCP recién producido. Si no puede eludirse el almacenamiento durante períodos de tiempo más prolongados, todos los parámetros pertinentes deben registrarse de conformidad con las directrices MISEV201826, y es necesario tener en cuenta los posibles sesgos de los resultados adquiridos.</li>
	<li>Protocolo de ejemplo para HUVECs<ol>
<li>Cultivar células HUVEC para 120 h en medio EGM-2 que contiene FBS y otros suplementos.</li>
		<li>Cultivar células HUVEC por 48 h en medio basal de EBM-2 sin suplementos adicionales.</li>
		<li>Recoja el medio de los matraces y realice el paso de centrifugación como se indicó anteriormente (paso 1,3). Típicamente, utilice 100 mL de medio para un aislamiento EV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ultracentrifugación de CCM
<ol><li>Inmediatamente antes de la ultracentrifugación (UC), Centrifugue el MCP durante 15 min a 3.000 x g y 4 ° c para eliminar los desechos celulares y los grandes aglomerados.</li>
	<li>Transfiera con cuidado el sobrenadante a los tubos UC. Si se utiliza un rotor de ángulo fijo, marque la orientación de los tubos en la centrífuga para facilitar la recuperación del pellet de EV después de la UC. Centrifugar por 2 h a 120.000 x g, con un factor k de 259,4.</li>
	<li>Después de la UC, deseche cuidadosamente el sobrenadante utilizando un Pipet serológico, para evitar la perturbación de los EVs pelados. Nota: el pellet puede ser invisible.</li>
	<li>Añadir 200 μL de solución salina filtrada por fosfato de 0,2 μm (PBS) al primer tubo y utilizar PBS y el sobrenadante residual para resuspentar el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión EV resultante al siguiente tubo de la muestra respectiva y utilítila para la resuspensión. Proceda de esta manera para resuspender todos los EVs de la muestra en un volumen final de aproximadamente 300-350 μL.</li>
	<li>Después de la resuspensión, confirme la presencia de partículas por análisis de rastreo de nanopartículas (NTA). Utilice los ajustes optimizados para el tipo de EV determinado, como los ajustes siguientes (paso 2.5.1). Nota: los documentos de Gardiner et al.27 y vestad et al.28 contienen información valiosa sobre cómo optimizar los parámetros para medir los EVS.<ol>
<li>Para reproducir los resultados descritos a continuación, utilice instrumentos (p. ej., NanoSight LM14) equipados con un láser verde. Graba tres videos de 30 s con una ganancia de pantalla de 1,0 y un nivel de cámara de 13. Para el análisis, utilice una ganancia de pantalla de 1,0 y un umbral de detección de 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilice el pellet inmediatamente, si es posible; de lo contrario, guárdelo a 4 ° c durante la noche.</li>
</ol>3. encapsulado de glucuronidasa en EVs
<ol><li>Para el pellet resuspendido, añadir beta-glucuronidasa (10 mg/mL en PBS) a una concentración final de 1,5 mg/mL y saponina (10 mg/mL en H2O) a una concentración final de 0,1 mg/ml. Mezclar bien por vórtex para 3 s.</li>
	<li>Incubar durante 10 min a temperatura ambiente con mezcla intermitida deslizando suavemente el tubo. Después de la incubación, purificar directamente por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) (ver sección 5). Nota: no recongelar las muestras de glucuronidasa una vez descongeladas, para evitar la degradación enzimática debida a la congelación.</li>
</ol>4. la producción de liposome
<ol><li>Para preparar liposomas para la comparación con EVs, disolver 1, 2-Dimyristoyl-SN-glycero-3-fosfocholine (DMPC) y 1, 2-Dipalmitoyl-SN-glycero-3-FOSFOCHOLINE (DPPC) en una ración de 2:3 molar en cloroformo a una concentración final de 5 mm. Prepare alícullitas de 1 mL en viales de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y déjelos secar durante la noche para formar una película lipídica. PRECAUCIÓN: el cloroformo es tóxico y se sospecha que es cancerógeno. Tome las precauciones adecuadas al manipularlo.</li>
	<li>Rehidratar la película lipídica con 1 mL de PBS que contiene 1,5 mg/mL de glucuronidasa. Calentar a 42 ° c y vórtice durante 1 min. calentar el ensamblaje del extrusor a 42 ° c y Extruir la suspensión lipídica 11x a través de una membrana de policarbonato de 200 nm. Purificar directamente por SEC (ver sección 5).</li>
</ol>5. purificación por SEC
<ol><li>Prepare la columna SEC con el siguiente protocolo.<ol>
<li>Utilice únicamente agua purificada fresca y amortiguadores recién preparados. Filtre todos los buffers a través de un filtro de membrana de 0,2 μm y desgaseelos para evitar la formación de burbujas de aire en la columna.</li>
		<li>Para la preparación de una columna SEC, utilice una matriz basada en filtración de gel de agarosa (p. ej., Sepharose CL-2B) u otro medio SEC adecuado para separar EVs y liposomas de impurezas de proteínas y exceso de enzimas. En primer lugar, retire la solución de 20% EtOH en la que se almacena el medio, para evitar la formación de burbujas de aire en la columna. Con este fin, Centrifugue el medio SEC a 3.000 x g durante 10 min, extraiga el EtOH y reemplácelo por agua desgasizada.</li>
		<li>Llenar una columna de vidrio (con un diámetro interior de 10 mm) con el medio SEC a la marca de 15 mL. Nota: los volúmenes variarán para las columnas con diferentes dimensiones. Asegúrese de dejar que el gel se asientan completamente.</li>
		<li>Antes de una carrera, equilibrar la columna con al menos dos volúmenes de columna de PBS. Para almacenar la columna, primero lávela con un volumen de agua de columna, seguida de al menos dos volúmenes de columna del 20% de EtOH. Después del almacenamiento, lave la columna primero con un volumen de agua de columna antes de equilibrar con PBS.</li>
		<li>Utilice hasta 400 μL de suspensión de EV o liposoma en una separación. Recoger fracciones de 1 mL. Después de la SEC, almacene los EVs purificados (ver sección 7) o someta a un ensayo glucuronidasa (ver sección 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confirme la separación de EVs y liposomas de proteínas contaminantes y glucuronidasa libre. Con este fin, correlacionar las concentraciones de partículas de las fracciones recogidas con la concentración proteica y la actividad glucuronidasa.<ol>
<li>Evaluar la concentración de partículas por NTA (ver 2,5)</li>
		<li>Evaluar el contenido de proteína por el ensayo de ácido bicinchonínico (BCA) u otro ensayo de cuantificación de proteínas adecuado. Realice el ensayo de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
		<li>Evaluar la actividad de la glucuronidasa mediante ensayo glucuronidasa (ver sección 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opcionalmente, evalúe la morfología del EV mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido (SEM).<ol>
<li>Para la preparación de muestras TEM, añadir 10 μL de suspensión EV a una rejilla TEM, incubar durante 10 min, y luego borrar cualquier exceso de líquido utilizando un papel de filtro. Realizar la fijación durante 10 min con 10 μL de 4% de paraformaldehído y borrar cualquier exceso. Lavar 3x con agua. Manchar las vesículas por 20 s de incubación con 30 μL de 1% de ácido fosforoso-tungstico hidratado. Después de haber borrado el exceso, seque las vesículas durante la noche. Visualizar por TEM. PRECAUCIÓN: el ácido fosfo-tungstico es altamente cáustico; así, proteger la piel y los ojos.</li>
		<li>Para SEM, fije las muestras TEM previamente preparadas en discos de carbono y tartamudo va con una capa de oro de 50 nm de espesor. Visualizar por SEM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ensayo glucuronidasa
<ol><li>Para permitir una comparación entre diferentes muestras y condiciones de almacenamiento correlacionando el número de partículas y la actividad enzimática, mida primero la concentración de partículas de la muestra por NTA (ver paso 2,5).</li>
	<li>Preparar una solución de trabajo de fluoresceina di-β-D-glucurótida añadiendo 1 μL del compuesto (10 mg/mL en H2O) a 199 ΜL de PBS. Añadir 25 μL de esta solución a 125 μL de EVs purificados para obtener una concentración final de 8,3 μg/mL. Pipet la muestra en una placa de pozo negro de 96. Mida el punto de tiempo 0 h con un lector de placas, utilizando 480 nm como excitación y 516 nm como longitud de onda de emisión.</li>
	<li>Cubra la placa firmemente (por ejemplo, con una lámina de plástico transparente utilizada para las placas de PCR) para minimizar la evaporación e incubar en la oscuridad durante 18 h a 37 ° c. Mida la producción de fluoresceína utilizando los parámetros del lector de placas enumerados en el paso 6,2.</li>
</ol>7. almacenamiento de EVs y liposomas
Nota: para todos los fines de almacenamiento, es aconsejable utilizar tubos de baja unión para reducir la pérdida de EV debido a la adsorción.
<ol><li>Siga los parámetros de esta sección para reproducir los resultados representativos que se indican a continuación. Utilice muestras compuestas por 400 μL de suspensión EV.<ol>
<li>Conservar a 4 ° c o-80 ° c o proceder a los pasos indicados a continuación.</li>
		<li>Liofilizar los EVs.<ol>
<li>Añadir trehalosa (40 mg/mL en H2O) hasta una concentración final de 4 mg/ml a los EVS purificados. Congelar las muestras a-80 ° c durante al menos 1 h.</li>
			<li>Liofilizar las muestras utilizando los siguientes parámetros. Para el secado principal, fije la temperatura del estante a 15 ° c y la presión a 0,180 mbar y deje las muestras secar por 46 h. Para el secado final, fije la temperatura del estante a 25 ° c y la presión a 0,0035 mbar y deje las muestras secar durante 2 h. Almacene las muestras liofilizadas a 4 ° c.</li>
			<li>Para rehidratar las muestras, Añadir H2O, igual a la cantidad de suspensión EV presente al principio (típicamente, 400 μL). No utilice ningún tampón para la rehidratación.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. análisis después del almacenamiento
<ol><li>Para evaluar la actividad enzimática, primero quite la glucuronidasa libre, que puede haberse filtrado de los EVs durante el almacenamiento. Lograr esto mediante un paso adicional de purificación que se lleva a cabo ya sea por SEC (véase el paso 5) o fraccionamiento del flujo de campo asimétrico (AF4) (ver paso 8.1.2). Nota: tenga en cuenta que ambos métodos conducen a una dilución de la muestra EV; por lo tanto, utilice suficientes concentraciones de EV antes del almacenamiento para evitar moverse por debajo del límite de cuantificación de NTA. Esperar una dilución de 1:10 de las partículas debido a la SEC o AF4.<ol>
<li>Para la purificación de la SEC, siga el protocolo descrito anteriormente (ver sección 5).</li>
		<li>Realizar purificación AF4.<ol>
<li>Configure el instrumento utilizando un canal pequeño con un espaciador de 350 μm y una membrana de celulosa de corte de peso molecular de 30 kD. Coloque un filtro de tamaño de poro de 0,1 μm entre la bomba HPLC y el canal AF4. Utilice PBS recién preparado con filtro de 0,1 μm como la fase móvil para reducir la carga de partículas y el ruido en los detectores de dispersión de luz.</li>
			<li>Detecte proteínas utilizando un detector UV establecido en 280 nm. Para detectar partículas, utilice dispersión de luz multiángulo con el láser establecido en 658 nm.</li>
			<li>Utilice el siguiente método de ejecución. Pre-enfoque durante 1 min con un flujo de enfoque de 1 mL/min; a continuación, inyectar 300 μL de la muestra a una velocidad de 0,2 mL/min y mantener el flujo de enfoque durante 10 min. Después de la inyección, eluyen la muestra a 1 ml/min mientras se aplica un flujo cruzado que disminuye de 2 ml/min a 0,1 ml/min en el transcurso de 8 min. eluyen durante otros 10 minutos sin flujo cruzado. Recoger fracciones de 1 mL, comenzando después de 12,5 min y continuando hasta 27 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realizar el ensayo glucuronidasa como se describió anteriormente (ver sección 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para evaluar el tamaño y la concentración, utilice el NTA como se describió anteriormente (véase el paso 2,5).</li>
	<li>Opcionalmente, realice TEM y SEM para evaluar la morfología de los EVs después del almacenamiento (véase 5,3).</li>
</ol>

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<li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLS+and+zeta+potential+-+What+they+are+and+what+they+are+not%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">DLS and zeta potential - What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li>
<li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858(2014).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Patel, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cell+culture+parameters+on+production+and+vascularization+bioactivity+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%26+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles.</a> Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).</li>
<li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+results+of+a+worldwide+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li>
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<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este manuscrito, presentamos un protocolo integral para estudiar la estabilidad de los EVs en diferentes condiciones de almacenamiento. Con la combinación de la glucuronidasa encapsulada como una lectura funcional y la evaluación de los parámetros fisicoquímicos de los EVs, el protocolo permite una evaluación directa de la estabilidad del almacenamiento de EVs y la comparación de EVs de diferentes células Líneas. SEM y TEM como métodos complementarios permiten una visión de los cambios de los EVs en el nivel de una so...

Los EVs son nanopartículas ligadas a membranas producidas por casi todos los tipos de células. Para las células de mamíferos, los EVS se pueden subdividir en dos grupos principales con distintas vías de producción1,2. Las vesículas de membrana, con un rango de tamaño de aproximadamente 100-1000 nm, se producen por el brote directo de la membrana celular. Los exosomas, de tamaño 30-200 nm, se derivan de cuerpos multivesiculares formados por la entrada interna en endosomas que posteriormente se fusionan con la membrana celular para liberar múltiples exosomas a la vez. La función principal de estas vesículas es el transporte de información entre las células3. Para este propósito, cargas como el ARN, el ADN y las proteínas se clasifican activamente en ellos. Los EVs pueden transmitir una variedad de efectos sobre sus objetivos, con implicaciones tanto para la salud como para el estado de la enfermedad. En un lado, median efectos positivos como la regeneración de tejido, presentación de antígeno, o efectos antibióticos, lo que los convierte en objetivos auspiciosos para su desarrollo como terapéutica4,5. Por otro lado, los EVs pueden promover la vascularización tumoral6, inducir efectos de transeúnte en las respuestas de estrés7, y podrían desempeñar un papel en las enfermedades autoinmunes8 y enfermedades inflamatorias9. Por lo tanto, pueden ser un componente clave para una mejor comprensión de muchos efectos patológicos. Sin embargo, la presencia de EVS alterados en enfermedades múltiples, como el cáncer10,11,12 y los trastornos cardiovasculares13, y su fácil accesibilidad en la sangre y la orina los hace ideales Biomarcadores. Finalmente, su buena biocompatibilidad14 y su capacidad inherente de focalización hacen que los EVS también sean interesantes para la entrega de fármacos15. En este manuscrito, describimos un protocolo para la evaluación de la estabilidad del almacenamiento de EVs derivado de células de mamíferos, una propiedad importante que todavía es poco investigada.
Para el desarrollo clínico de EVs, todavía hay muchos obstáculos para superar16, incluyendo la evaluación de sus efectos terapéuticos, producción, purificación y almacenamiento17. Mientras que-80 ° c es ampliamente visto como el estándar de oro para el almacenamiento EV18, los congeladores requeridos son caros, y el mantenimiento de la cadena de frío requerida de la producción al paciente puede ser desafiante. Por otra parte, algunos informes indican que el almacenamiento a-80 ° c todavía no preserva de manera óptima el EVS e induce una pérdida en la funcionalidad de EV19,20. Otros métodos, como el liofilizado21,22 o el secado por pulverización23, se han propuesto como posibles alternativas al almacenamiento congelado de EVS.
La forma óptima de evaluar la estabilidad del almacenamiento sería probar los EVs en ensayos funcionales o mediante la evaluación de un marcador específico, por ejemplo, su actividad antibacteriana19. Esto es posible cuando se conoce el efecto deseado de las vesículas y cuando se estudia un grupo diferenciado de EVs. Si se comparan los EVs de diferentes fuentes celulares (p. ej., para la encapsulación de fármacos) o si no hay ninguna lectura funcional conocida, ya no es posible evaluar los cambios debidos al almacenamiento de forma directa.
Por otro lado, simplemente evaluar los cambios en sus parámetros fisicoquímicos, como el tamaño, la recuperación de partículas y la concentración de proteínas, no siempre predice los cambios en la actividad del EV, como se ha demostrado en una patente reciente20.
Aquí, proporcionamos un protocolo fácilmente aplicable para medir la estabilidad del almacenamiento de EVs mediante la evaluación de sus parámetros fisicoquímicos combinados con la actividad de una enzima beta-glucuronidasa encapsulada como sustituto de la carga de los EVs. La carga de la enzima se realiza por incubación de saponina, un método suave establecido con EVS de diferentes fuentes21,24,25. La Saponin forma poros transitorios en la membrana EV, lo que permite la captación de enzimas en la vesícula. Como las enzimas son propensas a perder su actividad si se someten a condiciones de almacenamiento desfavorables, son un sustituto ideal para la evaluación de la preservación de las cargas funcionales de los EVs.
Hemos demostrado que la aplicación de este protocolo a los EVs derivados de las células madre mesenquimales humanas (MSCs), las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) y el adenocarcinoma humano alveolar (A549) de hecho resultan en grandes diferencias en estabilidad de almacenamiento entre diferentes líneas celulares, que deben tenerse en cuenta al elegir la fuente EV21.

<table><tbody><tr><td>1,2 dimyristoyl-sn glicero-3-fosfocolina (DMPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2663-25MG</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4329-25MG</td><td></td></tr><tr><td>225 cm&sup2; matraces de cultivo celular</td><td>Corning</td><td>431082</td><td>Utilizado con 25 ml de membrana de</td></tr><tr><td>celulosa regenerada de 30 kDa</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td>1854</td><td></td></tr><tr><td>350 y micro; espaciador</td><td>m Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colector de fracciones automatizado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-glucuronidasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7646-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher scientific</td><td>C/4966/17</td><td></td></tr><tr><td>Horno de columna</td><td>Hitachi High-Technologies Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalosa dihidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531-10G</td><td></td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II, Detector de dispersión de luz multiángulo</td><td>&nbsp; Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de membrana Durapore, PVDF,&nbsp; 0,1&nbsp; y micro; m, 47 y nbsp; mm</td><td>Merck</td><td>VVLP04700</td><td>Se utiliza para la preparación de tampones para AF4</td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>CC-3156</td><td>Medio basal de crecimiento de células endoteliales, utilizado para el cultivo libre de suero de células HUVEC</td></tr><tr><td>Eclipse dualtec</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>CC-3162 Medio de</td><td>crecimiento de células endoteliales, utilizado para el cultivo normal de células HUVEC</td></tr><tr><td>Selladores de placas ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY992</td><td>utilizado para el sellado de placas de 96 pocillos para el ensayo de glucuronidasa</td></tr><tr><td></td><td>Etanol Fisher scientific</td><td>E/0665DF/17</td><td></td></tr><tr><td>Juego de extrusoras con soporte/bloque calefactor</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de filtro</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014-1EA</td><td>utilizado para la preparación de</td></tr><tr><td>liposomas Fluoresceína di-&beta;-D-glucoronida</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F2915</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS-tablets+CA10:F36</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Universal 320 R</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co.KG</td><td></td><td>Se utiliza para la peletización de células de 300 g</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 420 R</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co.KG</td><td></td><td>Se utiliza para la granulación de residuos más grandes de 3000 g</td></tr><tr><td>Celdas HUVEC</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>Kimble&nbsp; FlexColumn 1X30CM</td><td>Kimble</td><td>420401-1030</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador ALPHA 2-4 LSC</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, Polipropileno</td><td>VWR international</td><td>525-0255</td><td>los tubos utilizados para toda la manipulación de vehículos eléctricos, resultaron ser más favorables que los productos comparables de otros proveedores en lo que respecta a la recuperación de partículas</td></tr><tr><td>Nanosight LM14 equipado con un láser verde</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosight-software versión 3.1</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleopore 200 nm membranas de policarbonato de grabado en pista</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td></td><td>110406 utiliza para la preparación de liposomas</td></tr><tr><td>PEEK Portafiltros en línea</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de ácido fosfotúngstico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25G</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de policarbonato para ultracentrifugación</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>QuantiPro BCA Kit</td><td>de ensayo Sigma-Aldrich</td><td>QPBCA-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía electrónica de barrido Zeiss EVO HD 15</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sepharose Cl-2b</td><td>GE Healthcare</td><td>17014001</td><td></td></tr><tr><td>SEM de cobre rejillas con película de carbono</td><td>Plano</td><td>S160-4</td><td></td></tr><tr><td>Canal AF4 pequeño</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de recubrimiento por pulverización catódica Q150R ES</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopía electrónica de transmisión JEOL JEM 2011</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tipo 45 Ti rotor de ultracentrifugación</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 muestreador automático Dionex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionex bomba isocrática</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionex desgasificador de vacío en línea</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga OptimaTM L-90 K</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detector UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 y micro; m tamaño de poro filtro de celulosa mixta</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>10401712</td><td>Se utiliza para la filtración de todos los tampones utilizados con los EV y en SEC</td></tr></tbody></table>

evaluación de la estabilidad del almacenamiento de vesículas extracelulares

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Las vesículas extracelulares (EVs) son objetivos prometedores en la investigación actual, que se utilizarán como fármacos, portadores de fármacos y biomarcadores. Para su desarrollo clínico, no sólo su actividad farmacéutica es importante, sino también su producción necesita ser evaluada. En este contexto, la investigación se centra en el aislamiento de los EVs, su caracterización y su almacenamiento. El presente manuscrito tiene como objetivo proporcionar un procedimiento fácil para la evaluación del efecto de las diferentes condiciones de almacenamiento en los EVs, sin manipulación genética o ensayos funcionales específicos. Esto hace posible obtener rápidamente una primera impresión de la estabilidad de los EVs bajo una condición de almacenamiento determinada, y los EVs derivados de diferentes fuentes celulares se pueden comparar fácilmente. La medición de la estabilidad se basa en los parámetros fisicoquímicos de los EVs (tamaño, concentración de partículas y morfología) y en la preservación de la actividad de su carga. Este último es evaluado por la encapsulación mediada por saponina de la enzima beta-glucuronidasa en el EVs. La glucuronidasa actúa como sustituto y permite una fácil cuantificación a través de la hendiedad de una molécula reportera fluorescente. El presente Protocolo podría ser una herramienta para los investigadores en la búsqueda de condiciones de almacenamiento que conserven de forma óptima las propiedades de EV para avanzar la investigación de EV hacia la aplicación clínica.

La figura 1 muestra las características de almacenamiento de EVS aislados de HUVECs. Los EVs fueron aislados por la UC, la glucuronidasa fue encapsulada, y después de la SEC, los EVs purificados fueron evaluados por sus propiedades fisicoquímicas por NTA. Una muestra de las vesículas fue sometida posteriormente a la purificación de AF4 y se midió la actividad de la glucuronidasa.
Las vesículas se almacenaron entonces para 7 d a 4 ° c o-80 ° c y a 4 ° c en forma liofilizada, en...

Aquí presentamos un protocolo fácilmente aplicable para evaluar la estabilidad del almacenamiento de las vesículas extracelulares, un grupo de nanopartículas naturales producidas por las células. Las vesículas se cargan con glucuronidasa como una enzima modelo y se almacenan en diferentes condiciones. Después del almacenamiento, se evalúan sus parámetros fisicoquímicos y la actividad de la enzima encapsulada.

Evaluación de la estabilidad del almacenamiento de vesículas extracelulares

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

La estabilidad de almacenamiento de vesículas celulares adicionales es un parámetro importante para su uso terapéutico prospectivo. Nuestro protocolo proporciona una herramienta fácilmente aplicable para evaluar cómo el almacenamiento afecta a las vesículas. La principal ventaja de nuestra técnica es que al introducir la glucuronidasa como un marcador exógeno, vesículas extracelulares derivadas de diferentes células madre y fácilmente comparadas con respecto a su capacidad de almacenamiento.La fraccionamiento del flujo de flujo asimétrico, o AF4, es una alternativa suave a la purificación de cromatografía de exclusión de tamaño para compuestos muy sensibles. Porque los compuestos encuentran menos estrés en el canal. Como la glucuronidasa es una enzima sensible, la calidad de la reside reside se beneficia de una planificación exhaustiva y la realización de los pasos para la purificación y el análisis espalda con espalda.Después de cultivar la línea celular de interés de acuerdo con las condiciones estándar para esas células, reemplace el sobrenadante con el medio de vesícula celular extra o libre de suero y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 24 a 72 hora

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este es un protocolo para aislar las vesículas extracelulares del tejido (EV) del hígado. El protocolo describe un proceso de dos pasos que implica perfusión de colagenasa seguido de ultracentrifugación diferencial para aislar los vehículos eléctricos de tejido hepático.

Aislamiento de las vesículas extracelulares de tejido del hígado

El protocolo describe un método reproducible diseñado para uso con sobrenadantes de cultivo celular para detectar epítopos superficiales en pequeñas vesículas extracelulares (EV). Utiliza específica inmunoprecipitación EV usando granos juntados con los anticuerpos que reconocen antígenos de superficie CD9, CD63 y CD81. El método está optimizado para el análisis de citometría de flujo aguas abajo.

Análisis Cytometric del vesículas extracelulares de medios acondicionado de célula de flujo

El presente informe destaca los requisitos cronológicos para el aislamiento de vesículas extracelulares (EV) de la microglia o de los macrófagos sanguíneos. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia se evaluaron como reguladores del crecimiento de la neurita, mientras que los vehículos eléctricos derivados de macrófagos sanguíneos se estudiaron en el control de la invasión de células de glioma C6 en ensayos in vitro. El objetivo es comprender mejor estas funciones EV como mediadores...

Caracterización de vesículas extracelulares derivadas de células inmunes y estudio del impacto funcional en el entorno celular

Aquí, presentamos un protocolo para etiquetar las vesículas extracelulares derivadas del lisado plaquetario para monitorear su migración y absorción en los explantes de cartílago utilizados como modelo para la osteoartritis.

Etiquetado de vesículas extracelulares para monitorear la migración y absorción en explantes de cartílago

El presente protocolo proporciona descripciones detalladas para el aislamiento, la concentración y la caracterización de vesículas extracelulares de cultivos de cianobacterias. También se discuten los enfoques para purificar vesículas de cultivos a diferentes escalas, las compensaciones entre metodologías y las consideraciones para trabajar con muestras de campo.

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares cianobacterianas

Presentamos un protocolo para el aislamiento y la fracturación por congelación de vesículas extracelulares (EV) originadas a partir de células uroteliales cancerosas. La técnica de congelación-fractura reveló el diámetro y la forma de los EV y, como característica única, la organización interna de las membranas EV. Estos son de inmensa importancia para comprender cómo los EV interactúan con las membranas receptoras.

Microscopía electrónica de fractura por congelación para el análisis de vesículas extracelulares

El presente protocolo describe un método para extraer vesículas extracelulares de la sangre periférica y tejidos sólidos con el posterior perfil de antígenos de superficie y cargas de proteínas.

Aislamiento y análisis de vesículas extracelulares trazables y funcionalizadas a partir del plasma y tejidos sólidos

Este protocolo proporciona una descripción detallada de la clasificación de las vesículas extracelulares (VE) liberadas por las células estromales mesenquimales. En particular, se centra en el ajuste del instrumento y la optimización de las condiciones de clasificación. El objetivo es clasificar las vesículas extracelulares preservando sus características.

Establecer una clasificación exitosa para el aislamiento de vesículas extracelulares

Aquí, describimos las condiciones de cultivo in vitro , el aislamiento y el aumento de la generación de vesículas extracelulares (EV) de Echinococcus granulosus. Los pequeños vehículos eléctricos se caracterizaron mediante dispersión dinámica de la luz y microscopía electrónica de transmisión. La captación por las células dendríticas derivadas de la médula ósea y su modulación fenotípica se estudiaron mediante microscopía confocal y citometría de flujo.

Aislamiento y absorción de células dendríticas de pequeñas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Aquí, demostramos el método de caracterización de vesículas extracelulares (EV) recolectadas de fluidos biológicos, como lágrimas y saliva, de sujetos humanos. El escáner utilizado en este método es capaz de detectar el fenotipo, el tamaño y el recuento total de partículas de los EV a partir de 1 μL de la muestra.

Caracterización de vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos

Aprende a evaluar la estabilidad de vesículas extracelulares usando glucuronidasa como marcador exógeno y AF4 para purificación. Este protocolo permite comparar la capacidad de almacenamiento entre diferentes tipos celulares.

Evaluación de la estabilidad del almacenamiento de vesículas extracelulares

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