Determinación de la densidad del conducto biliar en el hígado del ratón
30 de abril de 2019
Presentamos un método bastante simple y sensible para la cuantificación precisa de la densidad de las vías biliares en el hígado del ratón. Este método puede ayudar a determinar los efectos de los modificadores genéticos y ambientales y la eficacia de las terapias potenciales en modelos de ratón de enfermedades biliares.
Este protocolo permite al investigador cuantificar el desarrollo de conductos biliares en modelos de ratón de enfermedad hepática. También permite evaluar los efectos de los modificadores genéticos en el desarrollo de conductos biliares. La ventaja de esta técnica es que es un método sencillo, sensible y cuantitativo para la evaluación directa del desarrollo de conductos biliares.
Para empezar, con la piel tensa por fórceps, utilice tijeras pequeñas para hacer una incisión transversal aproximadamente una pulgada por debajo de la caja torácica de un ratón eutanizado. Exponga toda la superficie ventral del hígado. Usa tijeras pequeñas para cortar cuidadosamente los ligamentos que conectan el hígado con los otros órganos del abdomen.
Luego, corta el conducto biliar común para separar el hígado del intestino. Agárrate a la vesícula biliar y retira cuidadosamente el hígado. Colóquelo inmediatamente en un tubo de 50 mililitros lleno de tres cuartos con 4%paraformaldehído.
Para fijar el tejido hepático, incubarlo en 4%PFA a cuatro grados Celsius durante 48 horas. Después de una serie de lavados de etanol, lave el hígado con agente limpiador tres veces durante 30 minutos cada uno a temperatura ambiente. Para comenzar a incrustar, lave un cassette de tejido en un molde de tejido tres veces durante 30 minutos en cera de parafina precalentada a 60 grados Centígrados.
Luego, llene el molde de tejido con cera de parafina a tres cuartos de altura y manténgalo en un bloque de calentamiento a 60 grados Centígrados. Coloque el hígado en el molde con el lado ventral hacia arriba. Después de retirar cuidadosamente el molde del bloque de calefacción, coloque la parte superior del cassette en el molde.
Rescinda con parafina líquida caliente y dé la calma a temperatura ambiente durante la noche. Después de retirar el bloqueo hepático del molde, utilice un microtoma para comenzar a seccionar a través del lado dorsal superficial del hígado, haciendo secciones de cinco micrómetros. Compruebe las secciones superficiales bajo un microscopio de disección para asegurarse de que las secciones no estén cortadas o dobladas.
Para procesar diapositivas para inmunohistoquímica, seleccione una diapositiva por genotipo que se analizará y lávela durante 15 minutos en xileno, 100% etanol, 95% etanol y, finalmente, 70% etanol. Después de lavar el tobogán en el agua ionizada, sumerja en la solución de recuperación de antígeno de alto pH basada en Tris. Luego, calienta bajo presión en una olla a presión durante tres minutos a 10 libras por pulgada cuadrada.
Después de dejar que la diapositiva se enfríe a temperatura ambiente, utilice un lápiz PAP para delinear las secciones de la diapositiva. Después de lavar con PBS Tween, bloquee las secciones de tejido añadiendo 100 microlitros de solución de bloqueo por sección e incubar cubierto a cuatro grados Centígrados durante una hora. Aplicar 100 microlitros de la solución de anticuerpos diluidos que contengan los tres anticuerpos primarios en cada sección e incubarlos a cuatro grados centígrados durante la noche.
Después de lavar los portaobjetos, añadir 100 microlitros de la solución secundaria de anticuerpos que contengan anticuerpos secundarios e incubar durante una hora a temperatura ambiente. Por último, aplique el medio de montaje y un cubreobjetos a las diapositivas. Utilice un microscopio fluorescente para tomar imágenes de 20x con zoom 1x de cada sección.
Asegúrese de que todas las venas porta a través del hígado estén imágenes. Cree una hoja de cálculo con las siguientes columnas: Número de animal/muestra, número de imagen, número de venas porta y número de conductos biliares. Identifique y registre el número de venas porta por imagen para cada imagen.
A continuación, identificar los conductos biliares patentados en cada imagen, por la presencia de colangiocitos que rodean un lumen definible. Estas estructuras deben ser distintas y separadas por mesenquimo de otras células citoqueratina-positivas de amplio espectro. Uno de los principales desafíos de esta técnica es identificar los conductos biliares patentados.
Determinar qué es un conducto de patente requiere un análisis de la forma del conducto y las células que rodean el lumen. Cuente cada conducto biliar patentado y colóquelo en la misma columna que el número de imagen y repita para cada imagen de vena porta. Por último, calcule la suma de todas las venas porta y todos los conductos biliares en la muestra hepática y calcule la relación entre el conducto biliar y la vena porta para la muestra hepática.
Los hígados de ratón P30 fueron seccionados y co-manchados para CK8 y CK19 junto con el marcador vascular, alfa-SMA, para determinar la relación BD a PV. Cuando se visualizan todas las venas porta en cada lóbulo hepático, las venas porta se definieron como vasos manchados de alfa-SMA que tienen manchas adyacentes de citoqueracina de amplio espectro. Las estructuras de tinción alfa-SMA sin citoqueracina de amplio espectro eran venas centrales que fueron excluidas del análisis.
Los conductos de patente tienen un lumen claramente definible que está rodeado por colangioctyes citoqueratina-positivas de amplio espectro y generalmente están separados de los conductos cercanos o colangiocitos por mesenquima. Las células citoqueratina-positivas de amplio espectro que no tienen un lumen definible, no se cuentan para el número total de conductos biliares. La sección hepática de un animal de tipo salvaje muestra una vena porta asociada con un conducto completamente patentado junto con varias células no incorporadas.
La sección hepática representativa de un animal heterocigoto JAG1 muestra que no hay conductos biliares patentados alrededor de las tres venas porta. Todas las células citoqueratina-positivas de amplio espectro aquí no están incorporadas y, por lo tanto, no deben ser contadas. El análisis de la relación BD a PV para tres animales heterocigotos JAG1 y de tipo salvaje muestra cómo los dos genotipos se pueden distinguir fácilmente en función del recuento de conductos biliares.
Es importante evaluar todos los vasos del portal en busca de conductos biliares. Es especialmente crítico para determinar la densidad de los conductos biliares si hay variabilidad fenotípica en todo el hígado. Esta técnica se utilizó para identificar un supresor genético del fenotipo biliar en un modelo de ratón de Helgason.
Por lo tanto, puede ser útil en la evaluación de las modalidades de tratamiento de modelos animales de enfermedad biliar.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este protocolo permite la cuantificación del desarrollo del conducto biliar en modelos murinos de enfermedad hepática. Es un método sencillo, sensible y cuantitativo para evaluar la densidad del conducto biliar, que puede ayudar a valorar los efectos genéticos y ambientales sobre las enfermedades biliares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Investigación sobre enfermedades hepáticas
Antecedentes
- La densidad de los conductos biliares es fundamental para comprender la función hepática.
- Los modelos de ratón se utilizan comúnmente para estudiar enfermedades hepáticas.
- Los modificadores genéticos pueden influir en el desarrollo de los conductos biliares.
- Se necesitan métodos de cuantificación precisos para una investigación efectiva.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para cuantificar la densidad de los conductos biliares.
- Evaluar el impacto de factores genéticos y ambientales.
- Evaluar terapias potenciales en modelos de ratón.
Métodos Utilizados
- Incisión transversal realizada por debajo de la caja torácica de un ratón sacrificado.
- Exposición de la superficie ventral del hígado.
- Diseción cuidadosa de los ligamentos que conectan el hígado con otros órganos.
- Evaluación cuantitativa de la densidad de los conductos biliares.
Resultados principales
- Cuantificación exitosa de la densidad de los conductos biliares lograda.
- El método demostró sensibilidad y precisión.
- Aplicaciones potenciales en la evaluación de terapias para enfermedades biliares.
- Información sobre los modificadores genéticos que afectan el desarrollo de los conductos biliares.
Conclusiones
- El método proporciona un enfoque confiable para estudiar la densidad de los conductos biliares.
- Puede facilitar la investigación sobre las influencias genéticas y ambientales.
- Herramienta prometedora para evaluar intervenciones terapéuticas en enfermedades hepáticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación cuantitativa del desarrollo del conducto biliar permite la reducción de riesgos mecanicistas en modelos preclínicos de enfermedad hepática colestásica. Este método apoya la validación de objetivos al proporcionar una lectura reproducible e independiente del genotipo de los fenotipos biliares. Facilita la selección de carteras al distinguir entre modelos de tipo silvestre y modelos de enfermedad basándose en las relaciones entre conductos biliares y venas portales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de la densidad de conductos biliares como indicador funcional de la maduración de los colangiocitos.
- Valor operativo: Proporciona un ensayo estandarizado basado en microscopía para comparar el desarrollo biliar entre diferentes genotipos y condiciones experimentales.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al correlacionar modificaciones genéticas con fenotipos biliares en sistemas relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera relaciones cuantitativas entre conductos biliares y venas porta que permiten la comparación objetiva de la formación de reacción ductular.
- Valor operativo: Utiliza inmunotinción para citokeratina y microscopía óptica, ofreciendo un flujo de trabajo escalable y reproducible para el análisis hepático multi-lobular.
- Preparación del ensayo: Produce resultados numéricos adecuados para cribado de alto contenido y para el intercambio de datos entre diferentes funciones.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con sistemas relevantes para enfermedades al modelar defectos biliares humanos en hígados de ratón, como el síndrome de Alagille.
- Valor operativo: Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante protocolos consistentes de corte e imagen.
- Avance ajustado al riesgo: Apoya las decisiones de continuar o no continuar al cuantificar la gravedad fenotípica y los efectos supresores en modelos genéticos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de biología de descubrimiento al proporcionar un punto final cuantitativo para la evaluación del desarrollo biliar antes de la identificación del compuesto líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al medir la densidad de conductos biliares como un resultado fenotípico de manipulaciones genéticas.
- Selección: Permite la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante la obtención sistemática de imágenes de todas las venas portales a través de los lóbulos hepáticos.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (número de conductos biliares por vena portal) que permiten comparaciones estadísticas entre condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la modelización de fenotipos de enfermedades biliares humanas en ratones.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para evaluar la toxicidad biliar o la reparación en múltiples modelos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad en la evaluación del fenotipo biliar.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante procedimientos definidos de seccionado, tinción y conteo.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en objetivos implicados en vías de desarrollo biliar.
- Impacto en la cartera: Informa la priorización ajustada al riesgo mediante la cuantificación de la fidelidad del modelo de enfermedad y la respuesta terapéutica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histología, inmunohistoquímica y microscopía óptica para la identificación precisa de los conductos biliares.
- Depende de la inclusión en parafina, el corte con micrótomo y la infraestructura para la recuperación de antígenos.
- Necesita una estandarización entre equipos en la adquisición de imágenes y el registro de datos para garantizar la comparabilidad.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la validación de anticuerpos y la consistencia en la definición del lumen a través de diferentes sistemas modelo.
- Limitación práctica: no puede visualizar la estructura tridimensional del árbol biliar, lo que limita la evaluación a la densidad de conductos en dos dimensiones.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
0:36
Mouse Liver Tissue Collection
1:19
Fixation, Paraffin Embedding, and Liver Block Sectioning
2:35
Immunohistochemistry for Wide-spectrum Cytokeratin (wsCK) and αSMA
4:08
Imaging and Quantification of Bile Ducts (BDs)
5:27
Results: Determining BD to PV Ratio
7:00
Conclusion
