Uso de Microtiter Dish Radiolabeling para mediciones múltiples in Vivo de Escherichia coli (p)ppGpp seguido de cromatografía de capa fina

Este método mide los niveles del regulador global ppGpp dentro de diferentes condiciones de crecimiento y situaciones de estrés. PpGpp se puede encontrar en bacterias gram positivas y negativas, así como en cloroplasto. PpGpp tiene un inicio rápido en segundos, lo que conduce a una segunda relación rápida una vez que se produce tensión.

Simultáneamente, tiene una vida media corta, hasta 30 segundos. Por lo tanto, es necesario supervisar muchas referencias culturales en intervalos de tiempo que pueden variar de 10 segundos a horas, incluidas las transiciones estresadas. También los cultivos bacterianos de la radioetiqueta en los platos de microtíteres facilitan los muestreos de alto rendimiento que permiten múltiples réplicas técnicas y biológicas.

Asegúrese de seguir las medidas de seguridad adecuadas cuando trabaje con materiales radiactivos. Para comenzar este procedimiento, prepare todos los medios como se describe en el protocolo de texto. Cultivar cultivos nocturnos en medios MOPS con tres fosfatos sódicos militrolares.

Añadir 550 microlitros de medios MOPS, continando 0,2 portadores de fosfato sódico micromolar y 30 microlitros de cada inóculo bacteriano a los pozos de una placa de 24 pozos. Esto dará lugar a un inóculo inicial con un OD600 de 0.1. Agregue medios frescos a uno bien como un control de esterilidad.

Coloque la placa en una incubadora de agitación a 37 grados centígrados, agitando a 900 RPM durante 30 minutos. El crecimiento se puede monitorear usando un lector de placas con una placa de réplica en paralelo en medios que carecen de p32 usando un lector de placas mientras se incuba en las mismas condiciones. A continuación, añada 100 microcuries de p32 orthfosfato a cada pozo de la placa.

Cultivar los cultivos en una incubadora de temblores durante una o dos duplicaciones para permitir que la etiqueta externa se equilibre en gran medida con piscinas de nucleótidos intercelulares. Para una visualización adecuada, no se utilizó ningún material activo en este vídeo. En un experimento real, se requiere un blindaje adecuado, así como un monitoreo constante de la contaminación con un medidor de topografía.

En primer lugar, inducir el estrés utilizando un método adecuado para el tipo de estrés estudiado. A continuación, añada 20 microlitros de cada muestra de célula etiquetada a un tubo PCR separado de 0,2 mililitros, que contenga 20 microlitros de ácido fórmico de seis molares helados. Coloque inmediatamente las muestras sobre hielo seco.

Mejorar la eficiencia de extracción celular mediante tres ciclos de congelación y descongelación. Justo antes de detectar cromatogramas de capa fina de celulosa PEI, centrifugar las muestras durante un minuto a la máxima velocidad a los desechos de células de pellet. En primer lugar, establecer una placa TLC de celulosa PEI de 20 por 20 centímetros.

Use tijeras para quitar los cinco centímetros superiores. Y usa un lápiz suave para marcar una línea de origen a un centímetro del borde. Aplique una gota de cinco microlitros de cada muestra en la superficie peinosa.

Antes de que el punto pueda secarse, transfiera la placa a un tanque que contenga una capa de 1,5 fosfato monopotásico molar que sea lo suficientemente superficial como para no tocar el punto de la muestra de origen. Cubra el tanque con un sello hermético y deje el ascenso de líquido a la parte superior de la hoja recortada de 15 centímetros. Después de esto, retire el cromatograma completamente desarrollado y séquelo al aire a temperatura ambiente.

Corte y deseche la parte superior del cromatograma que contiene el P32 libre en residuos radiactivos. Utilice una pantalla de fósforo para exponer las películas audiorradográficas durante la noche. Al día siguiente, desarrollar la película y utilizar un fósforoimager para capturar y cuantificar la señal verde del fósforo.

A continuación, utilice el software ImageJ para cuantificar las manchas radiactivas. Después de provocar estrés o hambre durante el tiempo suficiente para permitir la acumulación de ppGpp, utilice un método adecuado para revertir el estrés. Tome muestras cada 20 a 30 segundos durante un máximo de dos minutos y procese las muestras como se describió anteriormente.

Una vez que se desarrolla el TLC, y los niveles de ppGpp se obtienen durante el curso de tiempo, trazar el contenido residual de ppGpp en una gráfica semilogarítmica versus tiempo. En este estudio, las células cultivadas en MOPS que contienen todos los aminoácidos excepto ILV se etiquetan con P32. Una vez etiquetado, L valina se añade para producir inanición de isoleucina.

Después de cinco minutos, se produjo un aumento de dos y dos años y medio en los niveles de tetra y pentafosfato de guanosina. Un control negativo de una muestra etiquetada libre de células se utiliza para detectar posibles compuestos que no son ortofosfato en la fuente P32. La reversión de la inanición de isoleucina se puede lograr mediante el cloramphenicol, un inhibidor de la síntesis de proteínas, que reduce el consumo de ARNdo de isoleucina cargada, y a su vez, restaura altas proporciones de ARNm cargado.

Se suprime la activación de la fuerte sintetasa ppGpp mediada, lo que permite una medida de degradación de ppGpp no perturbada por la síntesis residual. En este caso, ppGpp se descompone con una vida media de aproximadamente 64 segundos. Es importante dejar que las células crezcan durante un par de generaciones para lograr un etiquetado uniforme antes de inducir cualquier estrés o hambre.

Debido a que ppGpp está ampliamente extendido entre las bacterias, este método se puede aplicar a otros organismos. La modificación del método de desarrollo TLC podría permitir la separación adecuada de todos los nucleótidos reglamentarios, como ppApp. P52 es un mejor isótopo emisor, por lo que es importante utilizar un blindaje adecuado y descartar correctamente cualquier residuo.