Name: Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprende a realizar imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos. Este método permite estudiar la plasticidad neuronal y los mecanismos de formación de la memoria con resolución micrométrica durante varias semanas.

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U. A. F. cuenta con el apoyo de la Fundación Schram; C.-W. T. P. y W. G. cuentan con el apoyo de la Sociedad Max Planck; L.Y. y R.Y. cuentan con el apoyo de la Sociedad Max Planck y el Instituto Nacional de Salud (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. cuenta con el apoyo de una beca del 7PM del Consejo Europeo de Investigación, los programas ERANET e I-CORE, la Oficina Principal de Científicos del Ministerio de Salud de Israel, el Ministerio Federal de Educación e Investigación, Roberto y Renata Ruhman, Bruno y Simone Lich, Nella y Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, el Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging and Genomics, The Israel Science Foundation the Perlman Family, Adelis, Marc Besen, Pratt and Irving I. Moskowitz foundations; A. A. cuenta con el apoyo de la Max Planck Society, la Fundación Schram y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Las imágenes 3P fueron adquiridas durante el Curso Avanzado de Técnicas de Neuroimagen en el Instituto Max Planck Florida de Neurociencia. El Curso Avanzado sobre Técnicas de Neuroimagen es apoyado por la Sociedad Max Planck, el programa de Becas Científicas Max Planck del Estado de Florida y el programa de Asociación de La Corporación del Instituto Max Planck Florida. Nos gustaría agradecer a Thorlabs, Coherent y SpectraPhysics por proporcionar soporte y equipo para el sistema de imágenes 2P / 3P durante el curso. También estamos agradecidos a Henry Haeberle y Melissa Eberle por la ayuda con el sistema durante el curso.

Todos los métodos descritos han sido aprobados por el Gobierno de Alta Baviera (licencia 2016_ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-16-48) y por el Stanford y Max Planck Florida Institute for Neuroscience Administrative Panels on Laboratory Animal Care.
1. Preparación de la cánula de imagen
<ol><li>Sostenga un taladro de precisión en un soporte de perforación suministrado con una tabla de reglas móvil.</li>
	<li>Sujete un tubo de acero inoxidable de 3,0 mm de diámetro sobre la mesa de la regla móvil.</li>
	<li>Corte el tubo a un anillo metálico de 1,6 mm de largo. Si los bordes del anillo no son contundentes después del corte, presente las irregularidades.</li>
	<li>Enjuague el anillo metálico y un cubredes de vidrio circular de 4 mm de diámetro en acetona 100% y deje secar durante 5 min.</li>
	<li>Coloque el anillo metálico y la cubierta de vidrio en un lugar de trabajo suave, uniforme y limpio, bajo un estereoscopio.</li>
	<li>Coloque una gota de adhesivo óptico de curado UV sobre una superficie lisa, como una placa Petri. Utilice una aguja o una espátula para esparcir el adhesivo para formar una capa delgada (<0,5 mm).</li>
	<li>Utilice fórceps para sumergir un lado del anillo de metal en el adhesivo. Preste especial atención a no sellar el interior del anillo. Si esto sucede, utilice una aguja para romper el adhesivo óptico en el anillo.</li>
	<li>Con el estereoscopio, coloque el anillo metálico en el centro de la cubierta de vidrio con el lado del anillo cubierto por adhesivo que toca el cubreobjetos. Se debe formar un anillo delgado de adhesivo en la interfaz entre el anillo metálico y el cubreobjetos. Evite que el adhesivo se extienda al centro de la cubierta.</li>
	<li>Encienda la unidad del controlador LED de curado UV y brille la luz (365 nm) durante 1 min. ADVERTENCIA: La luz UV provoca quemaduras en la piel y es un agente mutagénico. Use gafas que protejan los rayos UV y cubra las manos y los brazos con guantes y una capa de laboratorio para evitar la exposición a la piel.</li>
	<li>Para curar el adhesivo uniformemente, asegúrese de que todos los lados del anillo estén igualmente iluminados cambiando la dirección de la fuente de luz.</li>
	<li>Deje que el adhesivo se endurezque durante al menos 2 h, preferiblemente durante la noche.</li>
	<li>Sostenga firmemente la cánula desde el extremo abierto del anillo de metal por medio de un hemostat. Usando un taladro dental equipado con un archivo giratorio y trabajando bajo el estereoscopio, archive el exceso de cubrevidrio de vidrio hasta que esté al ras con los lados del anillo (Figura1A).</li>
</ol>2. Implantación de la cánula de imagen sobre el hipocampo dorsal
<ol><li>Preparación del equipo y configuración
	<ol>
<li>Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos estén limpios y estériles. Si utiliza un esterilizador de perlas de vidrio para la esterilización, limpie los instrumentos y colóquelos en el esterilizador (establecido a 250 oC) durante 10 minutos, antes de su uso. Alternativamente, autoclave los instrumentos antes de su uso.</li>
		<li>Preparar todos los materiales necesarios para la cirugía, así como los instrumentos quirúrgicos, para que puedan ser alcanzados fácilmente.</li>
		<li>Asegúrate de que haya suficientes medicamentos recién preparados, como analgésicos o antiinflamatorios.</li>
		<li>Asegúrese de que haya suficiente isoflurano durante toda la duración de la cirugía (aproximadamente 1 h por cirugía).</li>
		<li>Encienda la alfombra de calefacción y establézquela a 37 oC para mantener la temperatura de los animales estable mientras está bajo anestesia.</li>
		<li>Asegúrese de que el sistema de barrido de isoflurano está funcionando.</li>
		<li>Abra la válvula de flujo de oxígeno.</li>
	</ol></li>
	<li>Inducción de anestesia y fijación animal
	<ol>
<li>Coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia en 3% de isoflurano en 1 L/min O2 y espere hasta que pierda el conocimiento. Evalúe la anestesia con la prueba de reflejo de pellizcar del dedo del dedo del dedo del tiempo.</li>
		<li>Pesa el animal.</li>
		<li>Aplicar medicamentos antiinflamatorios (Meloxicam, 1mg/Kg) y analgésicos (Vetalgin, 200mg/kg) por vía subcutánea.</li>
		<li>Coloque el ratón sobre la alfombra de calefacción. Asegúrese de que el animal no esté en contacto directo con la alfombra calefactora para evitar quemaduras térmicas.</li>
		<li>Fije la cabeza al aparato estereotáctico y coloque el cono de la nariz para cubrir el hocico. Para mantener la anestesia, disminuir el isoflurano a 1.5-2%. A lo largo de la cirugía, monitoree el estado del ratón monitoreando visualmente la respiración y probando el reflejo de pellizcar del dedo del dedo del tiempo. Regular el porcentaje de isoflurano si es necesario.</li>
		<li>Aplique pomada oftálmica en los ojos para prevenir la deshidratación y la posible ceguera. NOTA: Para la anestesia y los medicamentos para animales, son posibles métodos alternativos y medicamentos. Por favor, consulte su licencia de animal y la literatura relativa.</li>
	</ol></li>
	<li>Implantación de cánula óptica
	<ol><li>Encienda la fuente de luz de fibra óptica.</li>
		<li>Retire el cabello y desinfecte la piel sobre la cabeza del ratón.</li>
		<li>Con tijeras y fórceps, retire el cuero cabelludo del ratón. Comienza haciendo un pequeño corte en el cuero cabelludo en una posición cercana a la lambda. Continúe abriendo el cuero cabelludo en los dos lados. Primero muévete lateralmente en la dirección de las orejas, luego rostrally, en la dirección de las órbitas oculares, para formar un triángulo en el eje sagital, aproximadamente 4 mm rostral a bregma. Preste atención para no cortar demasiado cerca de los oídos y los ojos, pero exponer bregma y lambda, así como los huesos parietales y la mitad posterior de los huesos frontales.</li>
		<li>Aplique una gota (10 mg) de lidocaína (28,9% v/v en alcohol) en el cráneo.</li>
		<li>Limpiar el periosteum y secar el cráneo con un hisopo de algodón.</li>
		<li>Coloque las barras de los oídos, para fijar la cabeza del ratón.</li>
		<li>Haga una pequeña craneotomía, usando un micro-taladro con una rebaba de 0.5 mm de ancho. Coloque el agujero en el hueso frontal opuesto al hipocampo de la imagen, aproximadamente a 1,5 mm de la sutura sagital y 2 mm distante de la sutura coronal.</li>
		<li>Atornille un tornillo óseo de acero inoxidable de 0,86 mm de ancho en el orificio del cráneo.</li>
		<li>Si es necesario, limpie los escombros y seque el cráneo.</li>
		<li>Preparación de una mezcla de cemento adhesivo rápido
		<ol>
<li>Con una cuchara pequeña (4,5 mm de diámetro), dispensar 1-1,5 cucharadas de l-polvo en un pozo de mezcla.</li>
			<li>Dispensar 3-4 gotas de Quick Base en el pozo.</li>
			<li>Dispensar 1 gota de Catalyst universal en el pozo.</li>
			<li>Revuelva la mezcla durante 5-10 s utilizando un aplicador de precisión. NOTA: Hay cementos alternativos disponibles. Consulte las instrucciones de su fabricante.</li>
		</ol></li>
		<li>Utilice aplicadores de precisión para aplicar cemento adhesivo rápido sobre el cráneo, el tornillo y la piel circundante. Dejar secar durante 30 s a 1 min.</li>
		<li>Utilice un taladro trephine de 3,0 mm de diámetro para hacer una craneotomía en el hueso parietal. Coloque el agujero aproximadamente 1,5 mm de distancia de la sutura sagital y 2 mm de distancia de la sutura lambdoid.</li>
		<li>Retire con cuidado el colgajo óseo.</li>
		<li>Compruebe el tamaño de la craneotomía usando la cánula para asegurarse de que se ajuste. Utilice un micro-taladro de 0,5 mm o 0,9 mm de ancho para agrandar la craneotomía si es necesario.</li>
		<li>Retire las meninges usando fórceps de Dumont.</li>
		<li>Ablate materia cortical, para llegar a la cápsula externa. Utilice una aguja contundente de 0,9 mm de diámetro (calibre 19) conectada a una bomba de vacío. Irrigar con salina para evitar la deshidratación del tejido expuesto y para lavar la sangre residual después de que se resuelva el sangrado. Succionar el tejido cortical lentamente, 50-100 m a la vez, hasta que la corteza se separa de la cápsula, exponiendo las fibras del cingulum o el cuerpo calloso. Cambie la aguja con frecuencia, para evitar obstrucciones.</li>
		<li>Las fibras se extienden principalmente en tres direcciones (Figura1B). Pela cuidadosamente las fibras dorsales hasta que las fibras más profundas(alveus del hipocampo) estén expuestas.</li>
		<li>Enjuague el tejido con salina. Usa fórceps delgados para sumergir la cánula inferior en salina y colocarla sobre el agujero del cráneo. La cánula y el tejido deben sellarse con salina para evitar atrapar burbujas de aire entre la cánula y el tejido.</li>
		<li>Empuje la cánula dentro del cráneo (Figura1C)hasta que el cubreobjetos de vidrio esté en contacto con las fibras.</li>
		<li>Seque bien el cráneo usando triángulos de absorción, hisopos de algodón y/o la bomba de vacío.</li>
		<li>Preparación de una mezcla de cemento adhesivo rápido (consulte el paso 2.3.10).</li>
		<li>Utilice aplicadores de precisión para aplicar cemento adhesivo rápido sobre el cráneo. Aplicar adhesivo también en el borde de la cánula. Tenga cuidado de no dejar que el adhesivo corra hacia la cánula. Dejar secar durante 30 s a 1 min.</li>
		<li>Utilice un brazo estereotaxico para colocar una placa de soporte de cabeza sobre la cánula, en contacto con el cráneo.</li>
		<li>Preparación de una mezcla de acrílico dental
		<ol>
<li>Usando una cuchara (diámetro de 9 mm), dispensar 1 cazo de nivel (1 parte) de polvo en un pozo de mezcla.</li>
			<li>Dispensar 2-3 partes de líquido en el mismo pozo. Cubra todo el polvo con el líquido.</li>
			<li>Revuelva durante 1 min con una espátula. NOTA: Hay acrílicos alternativos disponibles. Consulte las instrucciones de su fabricante.</li>
		</ol></li>
		<li>Utilice una espátula o un aplicador de precisión para aplicar acrílico a través del cráneo. Cubra todo el cráneo expuesto, el tornillo y la piel abierta con acrílico dental. Esto hace que la preparación sea estable. No deje que el acrílico corra por el cuello, las orejas y los ojos.</li>
		<li>Deje que el acrílico se seque y endurezca durante unos 15 minutos.</li>
		<li>Aplique una película adhesiva extraíble en la placa del soporte de la cabeza, para evitar que los residuos entren en la cánula. Se recomienda que el tamaño de la película coincida con el de la placa.</li>
		<li>Apague el flujo de isoflurano, retire al animal del aparato estereotáctico y colóquelo en una placa de calentamiento para mantener la temperatura corporal fisiológica mientras se despierta de la anestesia.</li>
		<li>Monitoree al animal hasta que haya recuperado suficiente conciencia para mantener la recumbencia esternal.</li>
		<li>Devolver el animal que se ha sometido a cirugía a la compañía de otros animales sólo cuando esté completamente recuperado.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Cuidado postoperatorio
<ol><li>Compruebe el estado del ratón durante 2 días después de la cirugía, monitoreando el peso y el comportamiento general.</li>
	<li>Aplicar medicamentos antiinflamatorios (Meloxicam, 1mg/Kg) y analgésicos (Vetalgin, 200mg/kg) por vía subcutánea durante 2 días después de la cirugía NOTA: Los procedimientos alternativos de monitoreo, medicamentos y dosis son posibles para la atención postoperatoria. Por favor, consulte su licencia de animal y la literatura relativa.</li>
</ol>4. Preparación de la sesión de imágenes
<ol><li>Encienda la configuración de imágenes por adelantado y deje que el láser se caliente y se estabilice, si es necesario.</li>
	<li>Anestetizar el ratón (consulte el paso 2.2.1).</li>
	<li>Utilice fórceps para retirar cuidadosamente la película adhesiva de la placa del soporte de la cabeza. Sostenga el ratón en una mano y la placa del soporte de la cabeza con los dedos. Retire la película suavemente, para evitar dañar la preparación.</li>
	<li>Coloque el ratón debajo del microscopio, sobre la alfombra calefactora y fije la placa de la cabeza al soporte (Figura1D).</li>
	<li>Coloque el cono nasal para cubrir el hocico y disminuya el isoflurano a 1,5-2%.</li>
	<li>Aplique pomada oftálmica a los ojos del ratón.</li>
	<li>Limpie la cánula de imágenes encerrando con agua desionizada. Utilice una jeringa y una aguja delgada para soltar agua en la cánula y una bomba de vacío para extraerla.</li>
</ol>5. Sesión de imágenes
<ol><li>Utilice objetivos de bajo aumento y larga distancia de trabajo para comprobar visualmente la cánula en busca de agua residual, suciedad, integridad y presencia de fluorescencia.</li>
	<li>Alinee la cánula con el eje óptico ajustando los ángulos de los brazos del soporte de la cabeza.</li>
	<li>Cambie a los objetivos de inmersión en agua 25X 1.0 NA, 4 mm WD o 40X 0.8 NA, 3 mm WD. Agregue suficiente agua desionizada para llenar la cánula y mantener el exceso de agua enlaparte de la cánula. Evitar la formación de burbujas de aire.</li>
	<li>Utilice señales fluorescentes de imagen y excitación 2P. NOTA: El protocolo de imágenes depende en gran medida del tiempo y las escalas espaciales que se van a crear imágenes. Consulte los resultados representativos de las secciones y la discusión para obtener más información sobre la configuración de imágenes que hemos utilizado para producir las imágenes que se muestran en este artículo.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, se describe un procedimiento para imágenes 2P repetidas del CA1 dorsal en ratones vivos. Después de la cirugía, el ratón generalmente se recupera dentro de 2 días. El procedimiento induce astrogliosis mínima26,43. La hemorragia y el edema que podrían seguir la cirugía generalmente se reabsorben dentro de 10 a 14 días. Generalmente, a partir de los 14 días después de la implantación, la preparación es lo suficientemente clara como para realizar imágenes intravitales. El éxito de la cirugía no depende de trabajar en un ambiente estéril. Sin embargo, es crucial mantener un alto nivel de higiene, para evitar complicaciones debido a infecciones asociadas a la cirugía. Esto se obtiene limpiando meticulosamente los instrumentos quirúrgicos antes y después de la cirugía y esterilizando con calor inmediatamente antes de cada uso (paso 2.1.1). La cánula óptica se mantiene en un recipiente limpio y esterilizado y se enjuaga con solución salina estéril justo antes de la implantación. La realización de prácticas quirúrgicas comunes de desinfección de manos y limpieza de la estación quirúrgica también es muy importante. La preparación se mantiene estable y permite la toma de imágenes de resolución celular y subcelular durante varias semanas26,35.
Pasos críticos, modificaciones y solución de problemas.
Es importante pelar la cápsula externa hasta que las fibras más profundas estén expuestas. Si no se expone el alveus, la incapacidad de centrarse en el soma de los PN, o en espinas dendríticas por imágenes de resolución reducida, cuando se utilizan objetivos comerciales con WD de 3 o 4 mm. Para ello, es útil ablar el neocórtex muy lentamente usando una aguja de 0,9 mm de diámetro y luego cambiar a una aguja de 0,3-0,5 mm de diámetro (calibre 24-29) para un control más fino de la succión al retirar la mayoría de las fibras dorsales. Alternativamente, los fórceps finos se pueden utilizar para eliminar la corteza restante después de la exposición a la fibra36.
El sangrado durante la cirugía puede ser problemático, ya que la sangre obstruye la vista. Se recomienda esperar a que se forme el coágulo y luego encerrarse con salina para lavar la sangre residual. Repita según sea necesario.
Un ajuste ceñido entre la cánula y la craneotomía ayuda a aumentar la estabilidad de la preparación manteniendo la cánula en su lugar antes de la aplicación del cemento, especialmente si el borde exterior de la cánula está al ras con el cráneo. Dado que los tamaños del taladro trephine y la cánula están emparejados, puede surgir un ajuste suelto debido a irregularidades en el lado de la cánula - que requieren craneotomías ligeramente más grandes para caber (ver paso 2.3.14) - o de una craneotomía irregular. Cualquier irregularidad de cánula debe ser archivada (pasos 1.3 y 1.12) y la trefina debe mantenerse perpendicular al cráneo hasta que se complete la craneotomía (paso 2.3.12). La eliminación de la trephina del cráneo antes de que se complete la craneotomía puede dar lugar a craneotomias irregulares.
Limitaciones- Invasividad y estabilidad de la preparación.
Es difícil evaluar el efecto de la ablación cortical, ya que es arduo definir con precisión las zonas afectadas directa e indirectamente. En general, la cirugía extirpa parte de la corteza parietal y parte de la corteza sensorial visual y de las extremidades posteriores21. La corteza ablada no se proyecta directamente al hipocampo y el tejido del hipocampo no se toca ni se lesiona. Es importante destacar que se ha demostrado que la implantación de una cánula de imagen no altera gravemente la función del hipocampo y específicamente el aprendizaje dependiente del hipocampo21,36,37,38, 39. Aún así, sería importante cuantificar en qué medida tanto la cánula como la parte externa del implante (placa de soporte de cabeza y tapa de acrílico dental) son estresores crónicos mediante la evaluación de los niveles de la sangre de corticosterona y el peso de la glándula suprarrenal en comparación con ratones no implantados.
La preparación generalmente se mantiene estable de semanas a meses26. A largo plazo, el crecimiento de la piel y los huesos tiende a desplazar la tapa de acrílico y a aumentar la inestabilidad de la preparación por imágenes.
Limitaciones ópticas.
La microscopía 2P convencional permite tomar imágenes de hasta 1 mm de profundidad en el tejido neocortical40,41. De acuerdo con esto, es posible tomar imágenes dendritas y espinas dendríticas ubicadas en el SR (Figura 2D-F) o SLM36. Sin embargo, la toma de imágenes a través de una cánula presenta limitaciones a la NA efectiva. Para lograr la máxima resolución, el diámetro y la profundidad de las cánulas de imagen deben coincidir con la nA de imagen, ya que los diámetros más pequeños y las profundidades más largas recortarán la luz de los objetivos de nA altos. Por ejemplo, cuando se toma imágenes con un objetivo de inmersión en agua de 1,0 NA a través de una cánula de 1,6 mm de largo, se necesita un diámetro interior de 3,65 mm para mantener el NA completo. Sin embargo, el uso de una cánula de este diámetro aumentará la compresión en el hipocampo y podría afectar a la salud del tejido, por esta razón, utilizamos una cánula con un diámetro más pequeño. Cuando se toma imágenes con un objetivo de inmersión en agua de 0,8 NA a través de una cánula de 1,6 mm de largo, un diámetro interior de 2,5 mm sería suficiente para mantener el NA completo. Sin embargo, los objetivos de inmersión en agua de 0,8 NA tienen un WD más corto (3 mm en nuestro caso), lo que puede evitar que se enfoque en el SP.
Estos cálculos se aplican al centro del campo de visión en la parte inferior de la cánula. Sin embargo, mover el campo de visión de imágenes de lado - más cerca de los bordes de la cánula - o enfocar más profundamente en el tejido - más lejos de la superficie de vidrio de la cánula - disminuye aún más el NA efectivo en el plano focal y, por lo tanto, reduce la resolución. Esto conducirá a una resolución no homogénea en los diferentes volúmenes de tejido con imágenes y puede ser una preocupación por las imágenes cuantitativas a resolución subcelular, especialmente cuando se utilizan técnicas de superresolución como la microscopía 2P-STED42. Estos problemas son menos importantes cuando se toma imágenes a la resolución celular.
Movimiento de tejido.
El movimiento dentro del tejido, que se origina en la respiración y los latidos del corazón en animales anestesiados, tiende a ser más grave con una mayor distancia desde la cánula de imágenes. Esto es posiblemente porque la cánula de imagen aplica presión mecánica al cerebro, lo que contrarresta parte del movimiento en las proximidades de la cánula (de forma similar a las preparaciones neocorticales). Por lo tanto, aunque la toma de imágenes de espinas dendríticas es posible en SR y SLM, en nuestras manos, es más robusto dorsal a la SO hasta 200 m de la superficie de la cánula. Para compensar el movimiento, utilizamos escáneres resonantes y promediación fuera de línea. Se adquieren varias imágenes (de 4 a 6 repeticiones) por plano de imagen de una pila z a la velocidad máxima disponible (30 fotogramas/s). Todas las repeticiones para cada plano z se desconvolved (utilizando el software comercial, AutoQuant), registrado (usando ImageJ) y promediado en una sola imagen26. Para las imágenes de somata, el movimiento a menudo es insignificante con la anestesia35 y dos promedios a menudo son suficientes para compensar los artefactos de movimiento.
Futuras aplicaciones o direcciones del método . 
La preparación se puede combinar con microendoscopios26,43. Los microendoscopios son sondas ópticas rígidas que utilizan microlentes de índice de refracción de gradiente (GRIN) para guiar la luz hacia y desde el tejido profundo18. El uso de microendoscopios permite cánulas de diámetros más pequeños o incluso no cánulas en absoluto. Sin embargo, los microendoscopios comerciales están menos bien corregidos para las aberraciones ópticas y tienen nA más bajo que los objetivos comerciales. Las sondas de corriente alcanzan resoluciones laterales y axiales de 0,6-1 m, 10-12 m, respectivamente17,18,44. El uso de microendoscopios también permite la combinación de esta preparación con microscopios de campo ancho integrados montados en la cabeza45,46,47.
El método se presta también para su uso en ratones no anestesiados, y se ha utilizado para investigar la actividad celular utilizando sensores Ca2+ en ratones fijos en la cabeza despiertos21,37,48,49. En estos casos, debido a las rápidas escalas de tiempo de los cambios de fluorescencia, es aconsejable implementar el registro de línea50. También es posible adaptar la preparación para la toma de imágenes de otras subregiones hipocampales como el gyrus dentate (DG)39,51,52. Combinando esta preparación con la excitación 3P53,54 con 1 MHz frecuencia pulsada láser sintonizado a 1400 nm, pudimos imagen más profunda en la formación del hipocampo llegando a la capa molecular, capa de células gránulo y la capa de células del gránulo y la hilus de la DG (Figura 4) sin quitar la superposición CA1.
En conclusión, presentamos un método que proporciona acceso óptico al hipocampo dorsal y permite estudios longitudinales y correlativos de la dinámica de la estructura y actividad del hipocampo. Esta técnica amplía las posibilidades de análisis de la función del hipocampo en condiciones fisiológicas y patológicas.

En los mamíferos, el hipocampo es una región cerebral clave para la codificación y recuperación de recuerdos episódicos, así como para la navegación espacial1,2,3,4. Por esta razón, el hipocampo ha sido -y sigue siendo- un modelo muy importante para estudiar los mecanismos básicos que permiten al cerebro codificar y recordar recuerdos5,6,7 o navegar en un entorno8 ,9 recogiendo recompensas y evitando peligros. Además, la formación del hipocampo es una de las regiones cerebrales donde se generan nuevas neuronas a lo largo de la vida de los roedores10,11 y, posiblemente, de los seres humanos12,13. Finalmente, la degeneración o deterioro de la formación del hipocampo se asocian con trastornos neurológicos y psiquiátricos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer14.
En ratones, el hipocampo se encuentra aproximadamente 1 mm por debajo de la superficie cerebral15. Su posición ha impedido el acceso óptico en el cerebro intacto y, en consecuencia, los estudios longitudinales de la dinámica del hipocampo se han basado principalmente en imágenes de resonancia magnética (RM), electrofisiología y análisis de imágenes ex vivos. Los métodos de diagnóstico por rmn permiten el seguimiento de los procesos biológicos (por ejemplo, cambios en la expresión génica16) en el mismo animal durante varios días, pero carecen de la resolución espacial para discriminar las neuronas individuales. Las técnicas electrofisiológicas clásicas in vivo ofrecen una resolución temporal muy alta y una sensibilidad exquisita a los cambios en el potencial de la membrana. Sin embargo, tienen una resolución espacial limitada y carecen de la capacidad de rastrear de forma fiable las mismas celdas durante períodos de tiempo más largos. Las imágenes ópticas permiten estudiar procesos más diversos en virtud de sus altas resoluciones temporales y espaciales. Sin embargo, las imágenes ex vivo sólo proporcionan instantáneas de los procesos en curso, por lo que no es adecuada para estudios longitudinales durante los cuales los animales aprenden y recuerdan información.
La imagen óptica in vivo combina algunas ventajas de la imagen por RMN y la electrofisiología con las de las imágenes ópticas. Por lo tanto, es muy adecuado para análisis longitudinales y correlativos de la dinámica y el comportamiento del cerebro del ratón. Esto es relevante en estudios de procesos biológicos con escalas de tiempo muy rápidas (milisegundos a segundos) o muy lentas (días a semanas). Ejemplos de tales procesos que son relevantes para la neurociencia son la dinámica de voltaje de membrana, Ca2+ transitorios, plasticidad celular y cambios estructurales, que se cree que son muy importantes para la formación de la memoria y la memoria. Diferentes métodos han extendido la imagen in vivo al hipocampo dorsal18,19,20,21,22. Las preparaciones agudas han permitido el seguimiento de la actividad de la neurona piramidal (PN), así como sus dendritas y espinas dendríticas durante varias horas20,22. Este marco temporal, sin embargo, no permite estudiar los cambios estructurales a largo plazo, que podrían subyacen al aprendizaje incremental. Las preparaciones crónicas - en combinación con microendoscopios23,24 o con objetivos estándar de microscopio de larga distancia de trabajo (WD)21 - han permitido la toma repetida de imágenes del hipocampo dorsal en varios Semanas.
Aquí, describimos una preparación crónica que proporciona acceso óptico recurrente al subcampo CA1 del hipocampo dorsal de ratones vivos utilizando una cánula de imagen insertada permanentemente. Esta preparación permite el acceso repetido al CA1 sin perturbaciones funcionales y es adecuada para imágenes intravitales de dos fotones (2P) o epifluorescencia de campo ancho. Se detallan dos ejemplos de imágenes crónicas del cerebro profundo 2P en la CA1 dorsal de ratones vivos: imágenes longitudinales de la estructura dendrítica y dinámica delatrítica de la columna vertebral e imágenes longitudinales de plasticidad evocada por la actividad. Se discuten las ventajas y limitaciones más destacadas de la técnica.

<table><tbody><tr><td>Taladro/amoladora profesional IBS/E</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28481</td><td>Taladro de especiación</td></tr><tr><td>MICROMOT soporte de taladro MB 200</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28600</td><td>Mesa de regla móvil</td></tr><tr><td>MICRO mesa compuesta KT 70</td><td>Proxxon GmbH</td><td>27100</td><td>Mesa de regla móvil</td></tr><tr><td>Mordaza de máquina MS 4</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28132</td><td>Mesa</td></tr> <tr><td>de regla móvilTubo de acero inoxidable &Oslash; 3,0 x 0,25 mm (Inner &Oslash; 2,5 mm ) L = 500 mm</td><td>Sawade</td><td>R00303</td><td>Tubo de acero inoxidable para el anillo metálico de la cánula</td></tr><tr><td>Microscopio Cubreobjetos (redondo de 4 mm)</td><td>Engelbrecht Medizin y Labortechnik</td><td></td><td>Cubreobjetos de vidrio para el cristal de la cánula</td></tr><tr><td>Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui</td><td>Hoffmann Group</td><td>713750 160</td><td>Archivos manuales</td></tr><tr><td>Pr&auml; zisions-nadelfeile gesamtl&auml; nge 140 mm 4</td><td>Hoffmann Group</td><td>527230 4</td><td>Archivos manuales</td></tr><tr><td>Adhesivos ópticos de curado UV</td><td>Thorlabs</td><td>NOA81</td><td>Adhesivo</td></tr><tr><td>de curado UV Sistema LED de curado UV, 365 nm</td><td>Thorlabs</td><td>CS2010</td><td>Unidad de controlador LED de curado UV</td></tr><tr><td>Stemi 305</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Estereoscopio</td></tr><tr><td>Presto II</td><td>NSK-Nakanishi Alemania</td><td>Z307015</td><td>Taladro dental</td></tr><tr><td>Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein</td><td>MF Dental</td><td>F837.014.FG</td><td>Limas para el taladro dental</td></tr><tr><td>Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob</td><td>MF Dental</td><td>G837.014.FG</td><td>Limas para el taladro dental</td></tr><tr><td>Graefe Filetes - Rectos / Dentados</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Pinzas para la cirugía</td></tr><tr><td>Fresas para Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-05</td><td>Fresa de 0,5 mm de ancho para el microtaladro</td></tr><tr><td>Fresas para Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-09 Fresa de</td><td>0,9 mm de ancho para el microtaladro</td></tr><tr><td>MicroMotor mit Handst&uuml; ck</td><td>DentaTec</td><td>MM11</td><td>Microtaladro para la craneotomía</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #3 Fine</td><td>Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Pinzas Dumont para el quirófano</td></tr><tr><td>Tijeras finas - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Tijeras para la cirugía</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>MW Dental</td><td>229-020</td><td>Broca Trephine - 3,0 mm de diámetro; para el microtaladro</td></tr><tr><td>Hueso autorroscante de acero inoxidable Tornillos</td><td>Fine Science Tools</td><td>19010-10</td><td>Tornillos óseos de 0,86 mm de ancho</td></tr><tr><td>Aparato estereotáxico</td><td>Kopf</td><td></td><td>Aparato estereotáxico</td></tr><tr><td>3-D-Gelenkarm</td><td>Hoffmann Group</td><td>442114</td><td>Brazo estereotáxico y soporte de placa</td></tr><tr><td>Aufnahme 2SM</td><td>Hoffmann Group</td><td>442100 2SM</td><td>Brazo estereotáxico y soporte de placa</td></tr><tr><td>Esterilizadores de perlas calientes</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td>Esterilizador de perlas de vidrio</td></tr><tr><td>Isofluran CP, Flasche 250 ml</td><td>Henry Schein VET GmbH</td><td>798932</td><td>Isoflurano líquido para anestesia</td></tr><tr><td>Harvard Apparatus Vaporizador de llenado de embudo de isoflurano</td><td>Harvard Apparatus GmbH</td><td>34-1040</td><td>Vaporizador de isoflurano</td></tr><tr><td>Lab Active Scavenger</td><td>Gropper Medizintechnik</td><td>UV17014</td><td>Sistema</td></tr> <tr><td>de eliminación de isofluranoMetacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml</td><td>Henry Schein VET GmbH</td><td>798566</td><td>Meloxicam, antiinflamatorio</td></tr><tr><td>Vetalgin 500 mg/ml</td><td>MSD Tiergesundheit</td><td></td><td>Vetalgin, analgésico</td></tr><tr><td>CMA 450 Controlador de temperatura</td><td>Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH</td><td>8003770</td><td>Manta calefactora</td></tr><tr><td>Bepanthen Augen- und Nasensalbe</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>Pomada oftálmica</td></tr><tr><td>KL 1500 LCD</td><td>Schott</td><td></td><td>Fuente de luz de fibra óptica</td></tr><tr><td>Xylocain Pumpspray</td><td>AstraZeneca GmbH</td><td></td><td>Lidocain, anestésico local</td></tr><tr><td>Triángulos de absorción - Desmontados</td><td>Fine Science Tools</td><td>18105-03</td><td>Triángulos de absorción para el quirófano</td></tr><tr><td>Parkell C& B Metabond polvo transparente L</td><td>Hofmeester dental</td><td>013622</td><td>Cemento adhesivo rápido</td></tr><tr><td>Parkell C& B Metabond Quick Base B</td><td>Hofmeester dental</td><td>013621</td><td>Cemento adhesivo rápido</td></tr><tr><td>Parkell C& B Metabond Catalizador Universal C</td><td>Hofmeester dental</td><td>013620</td><td>Cemento adhesivo rápido</td></tr><tr><td>Aplicador de precisión ajustable Cepillos</td><td>Parkell</td><td>S379</td><td>Aplicadores de precisión para la cirugía</td></tr><tr><td>Agujas romas 0,9x23 mm</td><td>Dentina</td><td>0441324</td><td>Agujas romas</td></tr><tr><td>Agujas romas 0,5x42 mm</td><td>Dentina</td><td>0452155</td><td>Agujas romas</td></tr><tr><td>Agujas romas 0,3x23 mm</td><td>Dentina</td><td>0553532</td><td>Agujas romas</td></tr><tr><td>Kallocryl A/C</td><td>Speiko</td><td>1615</td><td>Componente líquido acrílico</td></tr><tr><td>Kallocryl</td><td>Speiko</td><td>1609</td><td>Polvo acrílico</td></tr><tr><td>Rollo transparente de hidrofilm Hartmann</td><td></td><td></td><td>Película adhesiva</td></tr><tr><td>Placas de cabeza Hecho</td><td>a</td><td></td> medida <td>Tamaño de 30 mm x 10 mm; Orificio de 8 mm de diámetro, titanio</td></tr><tr><td>Abrazadera de placa de cabeza Custom</td><td> hecho Soporte</td><td></td> de <td>la placa de la cabeza</td></tr><tr><td>Soportes de poste de pedestal</td><td>Thorlabs</td><td>PH20E/M Soporte</td> de <td>la placa de la cabeza</td></tr><tr><td>Poste de acero inoxidable</td><td>Thorlabs</td><td>TR30/M Soporte</td> de <td>la placa</td></tr> de <tr><td>la cabeza Poste de acero inoxidable</td><td>Thorlabs</td><td>TR75/M Soporte</td> de <td>la placa de la cabeza</td></tr><tr><td>Poste de acero inoxidable</td><td>Thorlabs</td><td>TR150/M Soporte</td> de <td>la placa de la cabeza</td></tr><tr><td>Abrazaderas de conector de poste</td><td>Soporte de placa de cabeza</td> <td>hecho a</td><td></td> medida</tr><tr><td>Placa de pruebas de aluminio, 300 mm x 450 mm x 12,7 mm, grifos M6</td><td>Thorlabs</td><td>MB3045/M</td><td>Platina de microscopio</td></tr><tr><td>7" x 4" Lab Jack</td><td>Thorlabs</td><td>L490/M Platina</td> de <td>microscopio</td></tr><tr><td>Mascarilla de perfil bajo Ratones pequeños</td><td>Emka Technologies</td><td>VetFlo-0801</td><td>Soporte para mascarilla de anestesia</td></tr><tr><td>RS4000 Tuned Damped Mesa óptica de alto rendimiento</td><td>Newport</td><td></td><td>Mesa flotante</td></tr><tr><td>S-2000A Aisladores neumáticos de vibraciones de alto rendimiento con renivelación automática Newport</td><td></td><td></td> Medidor de potencia de <td>mesa flotante</td></tr><tr><td>modelo 1918-R</td><td>Medidor de potencia</td><td>Newport</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120Q</td><td>Excelitas Technologies</td><td></td><td>Lámpara de fluorescencia</td></tr><tr><td>Microscopio de dos fotones</td><td>Bruker</td><td>Ultima IV</td><td>Dos fotones microscopios</td></tr><tr><td>Microscopio de dos fotones</td><td>Thorlabs</td><td>Bergamo</td><td>Microscopios de dos fotones</td></tr><tr><td>Plan N 4x/0.10 &infin;/-/FN22</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objectives</td></tr><tr><td>Plan N 10x/0.25 &infin;/-/FN22</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objectives</td></tr><tr><td>LMPlan FLN 20x/0.40 &infin;/-/FN26.5</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objectives</td></tr><tr><td>XLPlan N 25x/1.00 SVMP &infin;/ 0-0.23/FN18</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objetivos</td></tr><tr><td>Láser sintonizable Ultafast para excitación 2P</td><td>Spectraphysics</td><td>Mai Tai Deep See</td><td>Láseres Excitaiton</td></tr><tr><td>Láser sintonizable Ultafast para excitación 2P</td><td>Spectraphysics</td><td>InSight DS+</td><td>Láseres Excitaiton de</td>doble haz</tr><tr><td>Láser sintonizable Ultafast para excitación</td><td>3P Láseres Excitaiton</td> <td>Mónaco</td><td>coherentes</td></tr></tbody></table>

imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal ca1 en ratones vivos

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

La microscopía de dos fotones es una herramienta fundamental para la neurociencia, ya que permite la investigación del cerebro de animales vivos a escalas espaciales que van desde los niveles subcelulares a los niveles de red y a escalas temporales de milisegundos a semanas. Además, las imágenes de dos fotones se pueden combinar con una variedad de tareas conductuales para explorar las relaciones causales entre la función cerebral y el comportamiento. Sin embargo, en los mamíferos, la penetración limitada y la dispersión de la luz han limitado las imágenes intravitales de dos fotones principalmente a las regiones cerebrales superficiales, lo que excluye la investigación longitudinal de áreas del cerebro profundo como el hipocampo. El hipocampo participa en la navegación espacial y la memoria episódica y es un modelo de larga data utilizado para estudiar procesos celulares y cognitivos importantes para el aprendizaje y la memoria, tanto en salud como en enfermedades. Aquí, se detalla una preparación que permite el acceso óptico crónico al hipocampo dorsal en ratones vivos. Esta preparación se puede combinar con imágenes ópticas de dos fotones a resolución celular y subcelular en ratones vivos fijos y anestesiados durante varias semanas. Estas técnicas permiten tomar imágenes repetidas de la estructura neuronal o la plasticidad evocada por la actividad en decenas a cientos de neuronas en el hipocampo dorsal CA1. Además, esta preparación crónica se puede utilizar en combinación con otras técnicas como la microendoscopia, la microscopía de campo ancho montada en la cabeza o la microscopía de tres fotones, ampliando así en gran medida la caja de herramientas para estudiar los procesos celulares y de red involucrados en el aprendizaje y la memoria.

Dado que la cánula se coloca simplemente dorsal a CA1, el aspecto dorsal del CA1 es más proximal al microscopio si se compara con el ventral. El alveus es la estructura más proximal seguida en orden por el estrato oriens (SO), el estrato piramidal (SP), el estrato radiatum (SR) y el estrato lacunos moleculare (SLM), la capa más distal (Figuras 1B), la capa más distal (Figuras1B , C). Las imágenes longitudinales 2P de la estructura neuronal con resolución subcelular y de plasticidad evocada por la actividad con resolución celular se presentan como resultados representativos. Para excitar la proteína fluorescente verde (GFP), d2Venus y TurboFP635, se utiliza un láser Ti:Sapphire pulsado por femtosegundo sintonizado a 920 nm y la potencia media del láser se ajusta a 5-25 mW en la muestra. Las diferentes longitudes de onda de emisión se separan utilizando filtros de emisión y diferentes tubos fotomultiplicadores.
Imagen longitudinal de la estructura dendrítica y la dinámica de las espinas dendríticas.
Para etiquetar escasamente los PN hipocampales y visualizar su estructura, se utiliza una línea de ratón transgénica Thy1-GFP (línea M). Los ratones Thy1-GFP expresan un GFP mejorado citóflámicos bajo el control del promotor Thy1 en una población escasa y aleatoria de PNs25. Generalmente, el eje principal de los PN CA1 es aproximadamente perpendicular al plano de imagen XY (Figuras1B, Figura 2A y Película Suplementaria 1). Las dendritas basales se extienden en el SO, desde el soma hacia la cánula, mientras que las dendritas apicales y apicales se extienden distalmente a la cánula, en la dirección opuesta (Películasuplementaria 1). Dado que la preparación deja intactas las fibras más profundas del alveus, algunas fibras fluorescentes que atraviesan el campo de visión, justo debajo de la cánula, deben ser visibles (Figura2A y Película 1). La preparación permite la toma de imágenes de dendritas PN con resolución de columna vertebral (Figura2 A-C). Para la imagen de dendritas y espinas dendríticas, se utiliza una lente objetivo comercial de inmersión en agua de 25X 1.0 NA, 4 mm WD.
Para el seguimiento longitudinal, varias regiones cerebrales dentro del campo de visión de la cánula se definen durante la primera sesión de imágenes. Cada región corresponde a un área de aproximadamente 240 x 240 m y contiene entre 1 y 7 segmentos dendríticos (Figura2B). Estas regiones se asignan manualmente a una pila tridimensional de bajo aumento que muestra el patrón de expresión GFP en el volumen por debajo de la cánula de imagen (Figura2A). A continuación, se adquieren 1 m de dendritas basales CA1 PN en diferentes intervalos de tiempo (de 24 h a 3 días) durante un máximo de 14 días (Figura2C). Las duraciones e intervalos de imágenes más largos son posibles26. Cada sesión de diagnóstico por imágenes dura aproximadamente de 60 a 90 min. Aunque la mayoría de las imágenes son de espinas dendríticas en el SO, también es posible imágenes de espinas dendríticas en las dendritas oblicuas de SR (Figuras 2D-F). Además de la densidad de la columna vertebral, este método permite el estudio de la dinámica de la columna vertebral mediante la cuantificación de sus tasas de supervivencia, ganancia y pérdida26,27,28,29,30, 31 , 32. Para puntuar y realizar un seguimiento de las espinas dendríticas a lo largo del tiempo (figura2C),se utiliza una interfaz MATLAB personalizada. Esto permite la alineación de las pilas de imágenes adquiridas en diferentes puntos de tiempo y admite el etiquetado manual de dendritas y espinas mientras se realiza un seguimiento de longitudes dendríticas y posiciones de columna vertebral a lo largo del tiempo26. Es importante destacar que este método se puede utilizar para distinguir (por cada punto de tiempo, excluyendo el primero) entre las espinas dendríticas preexistentes y recién nacidas. Esto es importante ya que se cree que las diferentes clases de espinas dendríticas tienen diferentes roles en la adquisición y retención de memoria33.
Imagen longitudinal de la plasticidad evocada porla actividad.
Para la plásticaidad evocada por la actividad en los PN CA1, el área del hipocampo CA1 dorsal se inyecta con un vector viral que expresa d2Venus fluorescente verde desestabilizado a través de una forma mejorada del elemento sensible a la actividad sináptica (E-SARE) dentro del Arco potenciador/promotor y fluorescente rojo TurboFP635 a través del promotor ePGK 34. Esto permite obtener niveles de imagen de plasticidad evocada por la actividad de cientos de PN CA1 en cada animal35. Dado el etiquetado muy denso de los PN, generalmente no es posible resolver las dendritas de los PN CA1 (PelículaSuplementaria 2).
Para tomar imágenes de los somatas de los PN CA1, se utiliza una lente objetivo de inmersión en agua de 40X 0.8 NA, 3 mm WD. Para el seguimiento longitudinal, se definen de 1 a 9 regiones cerebrales por ratón durante la primera sesión de imágenes. Cada región corresponde a un área de aproximadamente 300 x 300 m y contiene entre 50 y 150 celdas (Figura3A). Estas regiones se asignan manualmente a puntos de referencia de tejido locales visibles con un aumento menor. A continuación, se adquieren pilas de imágenes de paso z de 3 m, que abarcan el SP de pN CA1 (figura3A y película suplementaria 2) en diferentes intervalos de tiempo (de 24 h a 6 días) durante un máximo de 30 días. Cada sesión de diagnóstico por imágenes dura aproximadamente 60 a 90 min. La activación de E-SARE alcanza los picos de 6 a 8 h después de una exposición a un entorno nuevo o enriquecido (EE, Figura 3B)y decae en el transcurso de unos pocos días. Por lo tanto, generalmente imagen de 6 a 8 h después de la experiencia y permitir 5 días entre las sesiones de imágenes35.
Para cuantificar los valores de fluorescencia d2Venus y TurboFP635, se dibuja una región circular de interés de 4,64 m de diámetro, que es más pequeña que un cuerpo de células neurales, centrada en el soma celular. Luego progresamos al siguiente punto de tiempo, puntuamos el soma de la misma célula de la misma manera, e iteramos este procedimiento para todos los puntos de tiempo y todas las celdas visibles en el dataset longitudinal. El valor medio de la emisión d2Venus de cada neurona (dependiente de la actividad) se normaliza por su emisión media (independiente de la actividad) de TurboFP635. Este método permite la investigación de la dinámica a largo plazo de la plasticidad del conjunto de CA1 PNs35 (Figura3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig1.jpg"> Figura 1: Preparación para imágenes ópticas cerebrales profundas in vivo. (A). Vistas superior (izquierda) y lateral (derecha) de ejemplo de imágenes cannuals. Las cánulas de imagen tienen un fondo de vidrio transparente para permitir el acceso óptico al hipocampo. (B). Descripción esquemática de la preparación que resalta la posición relativa de la cánula de imagen, un CA1 PN y las tres capas de fibras de dorsal a ventral. (C, D). Descripción esquemática de la configuración de imágenes (C) y de la fijación animal (D) durante una sesión de imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig2.jpg"> Figura 2: Imagen longitudinal de la estructura dendrítica y la dinámica de las espinas dendríticas. (A). Pila de imágenes 2P (Proyección de Intensidad Máxima (MIP) de 59 planos de imagen, 2 m z-espaciado) de neuronas y dendritas etiquetadas por GFP en un ratón Thy1-GFP vivo. (B). Mayor aumento (MIP de 53 planos de imagen, 1 m de espaciado z) que detallan las dendritas basales ubicadas en SO. (C). Secuencia de imágenes de lapso de tiempo de un segmento dendrítico que se ha generado durante 14 días. Las puntas de flecha indican espinas dendríticas rastreadas durante 14 días. (D, E). Pila de imágenes 2P de neuronas y dendritas etiquetadas por GFP en un ratón Thy1-GFP vivo; (D) Proyección ZY (31 planos de imagen, 3 m de espaciado z) y (E) proyecciones XY (17 planos de imagen, 3 m de espaciado z). (F). Mayor ampliación (plano de imagen única) que detalla dendritas apicales y espinas dendríticas ubicadas en SR. Las puntas de flecha indican espinas dendríticas. Excitación: 920 nm; pico de emisión: 510 nm. Barras de escala: A, 50 m; B, 10 m; C, 2 m; D y E, 15 m; F, 4 m. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig3.jpg"> Figura 3: Imagen longitudinal de la plasticidad evocada por la actividad. (A). imágenes 2P (planos de imagen única) de un ratón activo, mostrando las mismas celdas en el Día de línea base 0 y después de EE en el Día 1. (B). pilas de imágenes 2P (MIPs de 4-6 planos de imagen, 3 m de espaciado z) que muestran patrones de activación E-SARE específicos para el entorno A (días 1, 19 y 25) y el entorno B (días 7 y 13). Verde: fluorescencia d2Venus. Rojo: Fluorescencia TurboFP635. Excitación: 920 nm; d2Venus pico de emisión: 530 nm; TurboFP635 pico de emisión: 635nm. Barras de escala: A, 20 m; B, 10 m. Esta cifra ha sido modificada de Attardo et al., 201835. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig4.jpg"> Figura 4: Imagen de la estructura neuronal en la DG del hipocampo mediante microscopía de tres fotones (3P). (A-H). Imágenes 3P (planos de imagen única) de neuronas y dendritas etiquetadas por GFP en un ratón Thy1-GFP vivo que detalla (A-E) PNs en las células de gránulo CA1 y (F-H) en la DG. Excitación: 1400 nm; pico de emisión: 510 nm. Barra de escala: 40 m. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Película suplementaria 1: Campo de visión de imágenes en un ratón Thy1-GFP en vivo. Pila de imágenes 2P (83 planos de imagen, 7 m z-espaciado) de neuronas y dendritas etiquetadas por GFP (blanco) en un ratón Thy1-GFP vivo que se extiende desde la parte inferior de la cánula hasta SLM. Para tener en cuenta la descomposición de la señal de fluorescencia con una profundidad creciente, utilizamos un gradiente no lineal de ganancia de tubos fotomultiplicadores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/Movie_1_FINAL.avi">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Película complementaria 2: Imagen de la plasticidad evocada por la actividad. Pila de imágenes 2P (28 planos de imagen, 3 m z-spacing) de neuronas que expresan a e-SARE reportero de expresión IEG en un ratón en vivo que abarca SP. Verde: fluorescencia d2Venus. Rojo: Fluorescencia TurboFP635. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/Movie_2_FINAL.avi">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este método describe una preparación crónica que permite el acceso óptico al hipocampo de ratones vivos. Esta preparación se puede utilizar para realizar imágenes ópticas longitudinales de plasticidad estructural neuronal y plasticidad celular evocada por la actividad durante un período de varias semanas.

Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Este procedimiento proporciona acceso óptico repetido al hipocampo dorsal de ratones vivos para estudiar los mecanismos de formación de la memoria y la memoria mientras realizan tareas de aprendizaje. Esta técnica permite el uso de microscopía de luz para estudiar el hipocampo dorsal de ratones vivos a nivel de micrómetro de resolución espacial longitudinalmente durante varias semanas. La pérdida de memoria es un sello general de algunas enfermedades cerebrales como la enfermedad de Alzheimer.Comprender el mecanismo de formación de la memoria y la memoria podría ayudar en última instancia a los pacientes que sufren de estas enfermedades. Este método podría aplicarse a otros sistemas animales con un cráneo como pequeños mamíferos. Monitorear los signos vitales durante una cirugía de supervivencia puede ser tanto distraído como estresante.Podría ser útil realizar primero el procedimiento en un animal muerto con el fin de centrarse en los aspectos más cruciales del procedimiento. Para preparar la cánula de imagen, primero corte un tubo de acero inoxidable de tres milímetros de diámetro en un anillo metálico de 1,6 milímetros de largo. Si los bordes del anillo no son contundentes después del corte, archiva las irregularidades.A continuación, utilice un par de fórceps para sumergir un lado del anillo metálico en un adhesivo óptico de curado UV. A continuación, coloque el anillo de metal en el centro de un cubreobjetos de vidrio con el lado del anillo cubierto por adhesivo que toca el cubreobjetos. Encienda la unidad controladora LED de curado UV y brille la luz de longitud de onda de 365 nanómetros sobre el adhesivo durante un minuto para curar el adhesivo.Asegúrese de que todos los lados del anillo estén igualmente iluminados cambiando la dirección de la fuente de luz. Después de que el adhesivo se haya endurecido durante al menos dos horas, sostenga firmemente la cánula desde el extremo abierto del anillo metálico por medio de un estado. Usando un taladro dental equipado con un archivo giratorio, archiva el exceso de tapa de vidrio hasta que se enjuague con los lados del anillo.Prepare los instrumentos necesarios y anestesice el ratón como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, retire el cabello y desinfecte la piel sobre la cabeza del ratón. A continuación, usa tijeras y fórceps para hacer un pequeño corte en el cuero cabelludo en la posición cercana a lambda.Moverse lateralmente en la dirección de las orejas y luego rostralmente en la dirección de las órbitas oculares para formar un triángulo en el eje sagital aproximadamente cuatro milímetros rostral a bregma. Aplicar una sola gota de lidocaína en el cráneo. Después de dos minutos, despeja el periosteo y seque el cráneo con un hisopo de algodón.A continuación, coloque las barras de las orejas para fijar la cabeza del ratón. Usando un micro taladro con una rebaba de 0,5 milímetros de ancho, haz un pequeño agujero en el hueso frontal frente al hipocampo imageado aproximadamente a 1,5 milímetros de la sutura sagital y dos milímetros distales de la sutura coronal. A continuación, atornille un tornillo de hueso de acero inoxidable de 0,86 milímetros de ancho en el orificio del cráneo.Asegúrelo en su lugar con cemento adhesivo. Deje que el cemento se seque durante 30 segundos a un minuto. A continuación, utilice un taladro de tretina de tres milímetros de diámetro para hacer un pequeño agujero en el hueso parietal.Coloque el orificio aproximadamente 1,5 milímetros distal de la sutura sagital y dos milímetros distale de la sutura lambdoid. Retire con cuidado el colgajo óseo. A continuación, retire las meninges usando fórceps Dumont.Ablate materia cortical para llegar a la cápsula externa. Utilice una aguja contundente de calibre 19 conectada a una bomba de vacío e irrigar con solución salina para evitar la deshidratación del tejido expuesto y lavar cualquier sangre residual después de que se resuelva el sangrado. Succionar el tejido cortical lentamente alrededor de 50 a 100 micras a la vez hasta que la corteza se separe de la cápsula exponiendo las fibras del cingulum o el cuerpo calloso.Luego pela cuidadosamente las fibras dorsales hasta que las fibras más profundas, el alveus del hipocampo se exponen. Cuando haya terminado, enjuague el tejido con solución salina. A continuación, usa fórceps delgados para sumergir la cánula inferior en solución salina y colocarla sobre el orificio del cráneo.A continuación, empuje la cánula en el cráneo hasta que el cubreobjetos de vidrio esté en contacto con las fibras. Seque el cráneo y aplique un cemento adhesivo rápido sobre el cráneo para mantener la cánula en su lugar. Asegúrese de aplicar también adhesivo en el borde de la cánula, pero tenga cuidado de no dejar que el adhesivo corra en la cánula.Una vez seco, utilice un brazo estereotaxico para colocar una placa del soporte de la cabeza sobre la cánula en contacto con el cráneo. Preparar una mezcla de acrílico dental y luego aplicarlo a través de todo el cráneo. Cubrir todo el cráneo expuesto, el tornillo y la piel abierta con acrílico dental para estabilizar la preparación.Después de 15 minutos, aplique una película adhesiva extraíble sobre la placa del soporte de la cabeza para evitar que los residuos entren en la cánula. Cuando esté listo para crear una imagen del cerebro, siga de nuevo el protocolo de texto que lo acompaña para obtener más información sobre la anestesia. Una vez suficientemente sedado, utilice fórceps para retirar cuidadosamente la película adhesiva de la placa del soporte de la cabeza.Retire la película suavemente para evitar dañar la preparación. A continuación, coloque el ratón debajo del microscopio sobre la alfombra de calentamiento y fije la placa de la cabeza al soporte. Aplique pomada en los ojos del animal.A continuación, limpie la cánula de imagen utilizando una jeringa y una aguja delgada para dejar caer agua desionizada en la cánula seguida de la extracción con una bomba de vacío. Utilice objetivos de baja ampliación de larga distancia de trabajo para comprobar visualmente la cánula en busca de agua residual, suciedad, integridad y presencia de fluorescencia. A continuación, alinee la cánula con el eje óptico ajustando los ángulos de los brazos del soporte de la cabeza.Cambia a un objetivo 25X con una apertura numérica de 1.0 y una distancia de trabajo de cuatro milímetros. A continuación, agregue suficiente agua desionizada a la cánula para llenarla y mantener el exceso de agua en la parte superior de la cánula. Por último, utilice dos fotones de excitación e imagine las señales de fluorescencia.Aquí se muestra una pila de imágenes 2P de un cerebro de ratón transgénico de thy1-GFP. Los ratones Thy1-GFP expresan GFP mejorada citoplasmático bajo el control del promotor Thy1 en una población aleatoria escasa de neuronas piramidales. Generalmente, el eje principal de las neuronas piramidales en el hipocampo dorsal CA1 es aproximadamente perpendicular al plano de imagen XY.Estas regiones se asignan manualmente a una pila tridimensional de bajo aumento que muestra el patrón de expresión GFP en el volumen debajo de la cánula de imágenes. Para el seguimiento longitudinal, se definen varias regiones cerebrales dentro del campo de visión de la cánula. Cada región corresponde a un área de aproximadamente 240 por 240 micrómetros y contiene entre uno y siete segmentos dendríticos.La serie de imágenes aquí muestra un micrómetro de pilas de imágenes de paso z de neuronas piramidales CA1 y dendritas basales adquiridas en diferentes intervalos de tiempo durante 14 días. Sin embargo, es posible realizar intervalos y duraciones de imagen más largos. Aunque la mayoría de las imágenes son de espinas dendríticas en el estrato oriens, también es posible tomar imágenes de espinas dendríticas en las dendritas oblicuas del estrato radiatum.Otra extensión de esta técnica es la imagen de la plasticidad evocada por la actividad en las neuronas piramidales CA1 inyectando el área dorsal del hipocampo CA1 con un vector viral. Esto permite medir la plasticidad de cientos de neuronas piramidales CA1 en cada animal que se muestran aquí como una pila de imágenes 2P. Es crucial para prevenir el daño al hipocampo al extraer el tejido superpuesto.Además, se debe colocar la cánula correctamente para garantizar una preparación estable. La preparación descrita permite el uso de diferentes tipos de imágenes ópticas como microscopios en miniatura que se pueden implantar en la cabeza del animal. Esto permite al investigador seguir la actividad neuronal en animales que se mueven libremente.Originalmente, la técnica se utilizó para estudiar la plasticidad estructural en las neuronas del hipocampo. Hoy en día, se implementa en el estudio de la actividad neuronal también en otras áreas del cerebro.

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Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Para comprender la dinámica de la red de microcircuitos de la neocorteza, que es esencial para grabar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. En vivo de dos fotones de imágenes de calcio es el único método que permite grabar la actividad de una densa población neuronal con una sola célula de resolución.

En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

Fuente: Maruoka, H., et. al. Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos. J. Vis. Exp.  (2022) Este video muestra un procedimiento de microscopía de dos fotones para obtener imágenes de la actividad neuronal y la dinámica microglial en un ratón despierto durante la estimulación visual, destacando los transitorios de calcio y las interacciones celulares.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en un ratón despierto

Fuente: Ulivi, A. F., et. al. Imagen longitudinal de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos. J. Vis. Exp. (2019) Este video muestra imágenes longitudinales de dos fotones de neuronas piramidales marcadas fluorescentemente en un ratón vivo,  mostrando la preparación, la alineación de las cánulas y la obtención de imágenes de dendritas y espinas dendríticas para estudiar la estructura neuronal en la región CA1 del hipocampo.

Imágenes longitudinales de dos fotones de neuronas marcadas con fluorescencia en un hipocampo de ratón vivo 

Fuente: Kamei, R., et. al., Imágenes crónicas de dos fotones in vivo de la microglía en el hipocampo del ratón. J. Vis. Exp. (2022)El video demuestra la configuración y el proceso de obtención de imágenes para la microscopía de dos fotones in vivo de la dinámica microglial en el hipocampo CA1 (Cornu ammonis 1) y la circunvolución dentada, lo que garantiza una alineación óptica óptima y una evaluación de la integridad estructural.

Imágenes in vivo de dos fotones de la dinámica microglial en el hipocampo del ratón

La experiencia-dependientes cambios moleculares en las neuronas son esenciales para la capacidad del cerebro para adaptarse en respuesta a problemas de comportamiento.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

Aquí se describen los procedimientos experimentales que participan en dos fotones de imágenes de la corteza del ratón durante comportamiento en un entorno de realidad virtual.

Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual

Las imágenes de lapso de tiempo en el animal vivo proporcionan información valiosa sobre la reorganización estructural en el cerebro intacto. Aquí, presentamos una preparación de cráneo adelgazado que permite la obtención de imágenes transcraneales de estructuras sinápticas marcadas con fluorescencia en la corteza del ratón vivo mediante microscopía de dos fotones.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

Este artículo demuestra la preparación de una ventana de encargo de la proyección de imagen complementada con la cánula de la infusión y su implantación sobre la región CA1 del hipocampo en ratones.

Procedimiento De Craneotomía Para La Visualización De Las Actividades Neuronales En El Hipocampo De Comportarse Ratones

Este artículo describe un método para la observación crónica in vivo de la microglía en reposo en el hipocampo de ratón CA1 utilizando cirugía controlada con precisión y microscopía de dos fotones.

In vivo Imágenes crónicas de dos fotones de microglia en el hipocampo del ratón

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Aprende a realizar imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos. Este método permite estudiar la plasticidad neuronal y los mecanismos de formación de la memoria con resolución micrométrica durante varias semanas.

Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

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