Expresión y purificación de la distribución de oxígeno libre de nucleasa Protocatechuato 3,4-Dioxigenasa

Nuestro protocolo produce PCD altamente activo libre de nucleasa detectable, que se puede utilizar en cualquier solución donde el oxígeno acuoso es un contaminante. Las técnicas que utilizamos son fáciles de replicar y aseguran que no haya contaminantes nuclesos presentes en el producto. Para empezar, combine un microlitros del plásmido de expresión PCD pVP91A-pcaHG y 20 microlitros de E.coli BL21 disponibles comercialmente en un tubo.

Deslice el tubo para mezclar y coloque el tubo sobre hielo durante cinco minutos. Para continuar con la reacción de transformación, coloque el tubo en un baño de agua a 42 grados centígrados durante 30 segundos y luego sobre hielo durante dos minutos. Agregue 80 microlitros de medios SOC y agite a 225 rpm y 37 grados Celsius durante una hora.

A continuación, vierta la mezcla de reacción de transformación en un agar LB-ampicilina, y utilice un esparcidor de placas para esparcir la mezcla. Cubra el plato con una tapa e incubar la placa a 37 grados Centígrados durante 16 a 18 horas. Después de eso, escoge una colonia de la placa, e inocular en 50 microlitros de LB-ampicilina en un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros.

Coloque el matraz en una coctelera a 225 rpm para incubar a 37 grados centígrados durante 16 a 18 horas. A continuación, transfiera 20 mililitros del cultivo incubado a un matraz de cuatro litros lleno de un litro de LB-ampicilina. Agitar a 225 rpm a 37 grados centígrados.

Cada hora, dibuje un mililitro del cultivo en una cubeta para medir la densidad óptica a 600 nanómetros en un fotómetro. A medida que la densidad óptica del cultivo aumenta cerca de 0,5, aumente la frecuencia de las mediciones a cada 15 minutos, hasta que el OD600 alcance 0,5. Luego, transfiera el matraz de cuatro litros a un recipiente de hielo.

Gire el matraz en el baño de hielo para reducir la temperatura de cultivo. Transfiera el matraz de cuatro litros a una incubadora a 17 grados centígrados y 180 rpm. Continúe monitoreando el OD600 cada 20 minutos.

A 0,7 OD600, añada soluciones de stock de hexahidrato de sulfato de hierro IPTG y amonio para alcanzar una concentración final de 0,5 milimolares y 10 miligramos por litro, respectivamente. Agitar el cultivo a 180 rpm y 17 grados centígrados durante 18 horas. Después de la incubación, coloque el matraz de cultivo en hielo durante dos minutos.

Cosecha un mililitro de las células inducidas en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mililitros para el análisis SDS-PAGE. A continuación, verter el cultivo bacteriano en botellas, 500 mililitros por botella, para centrifugación. Pele el cultivo a cuatro grados centígrados y 3.000 g durante 20 minutos.

Decantar a los sobrenadantes. Pipetear para resuspender los pellets, cada uno en 12,5 mililitros de PBS frío, y combinar cada dos resuspensiones en un tubo cónico de 50 mililitros. Pele las células de nuevo como antes.

Luego, deseche los sobrenadantes y use una pipeta para agregar 10 mililitros de tampón de lysis en cada tubo para resuspender las células. Después de sonicar los tubos con células inducidas, verter el izado bacteriano en una botella de policarbonato pre-refrigerado. Centrifugar durante 60 minutos a 120.000 veces g y cuatro grados Celsius, y vierta el sobrenadante en un tubo cónico frío de 50 mililitros.

Después de preparar el instrumento FPLC con la columna de resina cargada de níquel, cargue la muestra en la columna a 0,15 mililitros por minuto. Lave la columna con 20 mililitros de tampón de níquel a 20 mililitrolares de imidazol. Conservar el lavado en un tubo de 50 mililitros para su análisis.

A continuación, lave la columna con 15 mililitros de tampón de níquel a 125 mililitrolares de imidazol. Recoger la elución en 19 fracciones de 0,8 mililitros cada uno. Lave la columna de nuevo con 15 mililitros de 100% tampón de níquel B, y recoja 75 fracciones adicionales de 0,2 mililitros cada uno.

Continuar con el análisis de las fracciones recogidas en geles 12%SDS-PAGE para confirmar la presencia de PCD. En primer lugar, añada 35 microlitros de tampón de reacción a un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mililitros. En el tubo, combine cinco microlitros de las fracciones de cromatografía pico y 500 nanogramos de tres kilobases par plásmido supercoilado pXba.

Coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante una hora. Después de preparar el gel de agarosa según el manuscrito, añadir 30 microlitros de cada reacción en los pozos en el gel. Electroforoso a 10 voltios por centímetro a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora.

Ahora, el tinte naranja G ha llegado al final del gel. Inmediatamente, utilice un escáner de fluorescencia para tomar imágenes de la señal de bromuro de etidio del gel. Con la función de la intensidad y el tamaño de píxel de la imagen, determine el volumen de píxeles de las distintas especies de ADN, como círculos superbobinados, lineales y nicked.

Para determinar el porcentaje de cada especie de ADN, divida el volumen de píxeles de una sola especie de ADN por el volumen total de píxeles para todas las especies individuales. El análisis SDS-PAGE muestra que el segundo pico de elución contiene una contaminación proteica mínima, que representa heterodímero de PCD casi puro y una actividad de nucleasa mínima a indetectable. Por lo tanto, combine estas 10 fracciones de la segunda elución PCD en un tubo cónico de cinco mililitros para su posterior análisis.

Después de la purificación de la cromatografía de exclusión de tamaño de PCD, en una sala fría de cuatro grados Celsius, se combinan en un tubo de microcentrífuga volumen adecuado de cloruro de sodio, clorhidrato de Tris, cloruro de magnesio, ditiothreitol, PCA y plásmido supercoilado pXba para hacer un stock de 5X. Coloque una placa plana de 96 pozos sobre hielo y transfiera 10 microlitros de la solución combinada 5X a los pozos. Inmediatamente antes del análisis, añadir a cada pozo 10 microlitros de las fracciones individuales de PCD SEC.

Ajuste el lector de placas a una temperatura interna de 37 grados Celsius y transfiera la placa de 96 pozos al soporte de la placa. Retirar el soporte de la placa en el instrumento y medir la absorbancia a 290 nanómetros a intervalos de 20 segundos durante una hora. Ajuste el instrumento para agitar la placa cinco segundos antes de cada lectura.

Después de una hora, añadir 10 microlitros de solución de parada a cada pozo para terminar las reacciones. Realizar electroforesis de gel para las fracciones PCD SEC. Seleccione fracciones con la mayor actividad de oxidación de PCA, indicada por disminución de la absorbancia y sin contaminación de nucleasa observada.

Mida la absorbancia a 280 nanómetros y calcule la concentración total de PCD en función de la absorbancia y el coeficiente de extinción. Almacene las fracciones seleccionadas para almacenamiento a largo plazo en menos 80 grados centígrados. En este experimento, se encontró que la PCD recombinante, un heterodista de hexahistidina etiquetado pcaH y pcaG, se expresó en E.coli.

El heterodímero fue purificado por primera vez por cromatografía de afinidad de níquel. La absorbancia se muestra en azul, y la concentración porcentual del búfer de níquel B se muestra en rojo. El flujo a través muestra las proteínas bacterianas solubles que no se unieron a la resina de níquel.

Algunos PCD eluieron en presencia de imidazol de 125 mililitrolares, pero la mayoría de la proteína eluía en imidazol 250-mililolar. El análisis representativo SDS-PAGE indica que las fracciones de la etapa de elución estaban libres de contaminantes. El gel de agarosa del ensayo de nucleasa revela contaminación comparando con el control negativo sin proteína agregada y un control positivo contaminado con una nucleasa del ADN.

La cuantificación de las diversas especies de ADN observadas en el ensayo de nucleasa de gel de agarosa muestra que las fracciones 29 a 38 tuvieron poca actividad de nucleasa, que fueron elegidas para ser combinadas, concentradas y purificadas por sec. Siguiendo este procedimiento, el PCD purificado se puede utilizar y optimizar en el sistema de barrido de oxígeno deseado.

Esto determinará la cantidad exacta de PCD necesaria para el sistema. Esta técnica se ha utilizado para prolongar la vida útil del fluoróforo en experimentos de microscopía de molécula única, lo que ha permitido períodos más largos de recolección de datos. La ultracentrífuga utilizada es peligrosa.

Asegúrese de que las centrífugas estén correctamente equilibradas antes de girar. El bromuro de etidio es un reactivo peligroso. Evite el contacto usando equipo de protección personal y deséchelo adecuadamente.