Name: Movimiento de shootward de CFDA Tracer cargado en los tejidos de sumidero inferior de Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprende a cargar CFDA en raíces e hipocótilos de Arabidopsis para estudiar el transporte intercelular y la actividad del floema mediante microscopía de fluorescencia. Este método revela barreras simplásticas en plantas.

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Esta obra fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31671257) y el centro de innovación colaborativa de Hubei para la industria del grano (LXT-16-18).

1. crecimiento vertical de Arabidopsis en media MS
<ol><li>El interior del gabinete de flujo laminar debe tratarse con 30 min de luz UV y 15 minutos de flujo de aire antes de su uso. Asegúrese de cerrar la puerta de cristal cuando la luz UV esté encendida. Pulverizar todas las herramientas y placas con etanol al 70% antes de colocarlas en el gabinete.</li>
	<li>Prepare el medio Murashige y Skoog (MS) en una placa de Petri estándar de 90 mm de diámetro bajo un gabinete de flujo laminar. Nota: el MS Medium contiene los siguientes componentes: 20,6 mM NH4no3, 18,8 mm kno3, 1,25 mm KH2po4, 1,5 mm MgSO4· 7H2o, 3 mm CaCl2· 2H2o, 0,1 mm MnSO4· H2o, 1,03 μm na2Moo4· 2H2o, 0,1 mm H3Bo3, 30 ΜM ZnSO4· 7H2o, 0,1 μm CUSO4· 5h2O, 0,1 μm CoCl2· 6H2o, 1,39 μm Ki, 97 μ M FeSO4 · 7H2O, 114,5 μm ácido ethylenediaminetetraacético (EDTA), 4,07 μm ácido nicotínico, 2,44 μm piridoxina hcl, 0,15 μm tiamina hcl, 2,68 mm glicina, 555 μm myo-inositol, 87,7 mm sacarosa y 10 g/L agar.</li>
	<li>Hidratar las puntas esterilizadas o palillos de dientes tocando la punta o palillos de dientes al medio MS, luego sumergir las semillas esterilizadas una por una en la posición fija de cada placa de Petri indicada por la tarjeta de siembra.</li>
	<li>Selle la placa de Petri con película de parafina y cinta adhesiva y colóquelo verticalmente sobre un soporte transparente en una sala de crecimiento (22 ° c, 70% de humedad) con un ciclo de día de 16 h de luz y 8 h de oscuridad (iluminación de 6 AM a 10 PM). La planta de Arabidopsis está preparada para la carga de CFDA el día 9-13 después de la siembra. Nota: el siguiente procedimiento se realiza por la tarde de 2 pm a 5 pm.</li>
</ol>2. la carga de CFDA con el procedimiento de corte de raíz
<ol><li>Prepare una nueva solución de trabajo de CFDA inmediatamente antes de su uso. Diluir la solución de stock de 1 mM de CFDA almacenada en un congelador de-20 ° c con agua ultrapura estéril a una concentración de trabajo de 5 μM.</li>
	<li>Cortar la película de membrana de parafina microporosa (ver tabla de materiales) en pequeñas piezas de 3 mm x 3 mm de tamaño.</li>
	<li>Descubra las plantas en crecimiento en la habitación a 22 ° c y borre el exceso de humedad con una toalla de papel. Coloque las pequeñas piezas de película debajo de cada raíz. Nota: de esto al paso 2,6, todo el proceso debe completarse dentro de 15 min.</li>
	<li>Levante las plantas en la tapa del plato de Petri. Cortar las raíces en una posición de unos 5-10 mm por debajo de la Unión de la raíz-hipocotilo. Vuelva a colocar la parte de rodaje en la película en el medio.</li>
	<li>Aplicar cuidadosamente 0,25 μL de CFDA en el extremo de corte de cada raíz bajo un microscopio de disección. Evite salpicar a otras partes de la planta.</li>
	<li>Cubra la placa y deje las plantas bajo luz durante 2-3 h (22 ° c) en la sala de crecimiento.</li>
	<li>Enjuague las plantas teñidas tres veces secuencialmente en tres vasos de precipitados separados llenos de agua destilada, luego Observe las plantas bajo un microscopio de fluorescencia estéreo con zoom de 1.4 x a 3.3 x (consulte la tabla de materiales). Para la detección de fluorescencia, utilice un cubo de filtro de alta eficiencia (excitación de 470/20 nm, División de 495 nm y emisión de 525/50 nm) montado para transmitir la señal de fluorescencia.</li>
</ol>3. CFDA carga con procedimiento de hipocotilo-pinching
<ol><li>Prepare una nueva solución de trabajo de CFDA inmediatamente antes de su uso. Diluir la solución de stock de 1 mM de CFDA almacenada en un congelador de-20 ° c con agua ultrapura estéril (consulte la tabla de materiales) a una concentración de trabajo de 5 μm.</li>
	<li>Cortar la película de membrana de parafina microporosa (ver tabla de materiales) en pequeñas piezas de 3 mm x 3 mm de tamaño.</li>
	<li>Descubra las plantas en crecimiento en la habitación a 22 ° c y borre el exceso de humedad con una toalla de papel. Nota: de esto al paso 3,7, todo el proceso debe completarse dentro de 15 min.</li>
	<li>Coloque una pequeña pieza de película bajo el cruce de la raíz-hipocotilo de cada planta.</li>
	<li>Utilice fórceps para pellizcar suavemente el hipocotilo cerca de la Unión raíz-hipocotilo bajo un microscopio diseccionante.</li>
	<li>Aplicar cuidadosamente 0,1 μL de CFDA en el sitio de la herida bajo un microscopio de disección. Evite salpicar a otras partes de la planta.</li>
	<li>Cubrir la placa, y dejar las plantas bajo la luz (22 ° c) para 2-3 h.</li>
	<li>Enjuague las plantas teñidas tres veces secuencialmente en tres vasos de precipitados separados llenos de agua destilada, luego Observe las plantas bajo un microscopio de fluorescencia estéreo con zoom de 1.4 x a 3.3 x (consulte la tabla de materiales). Para la detección de fluorescencia, Monte un cubo de filtro de alta eficiencia (excitación de 470/20 nm, División de 495 nm y emisión de 525/50 nm) para transmitir la señal de fluorescencia.</li>
</ol>

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<li>Wright, K. M., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+probe+HPTS+as+a+phloem-mobile%2C+symplastic+tracer%3A+an+evaluation+using+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy.</a> Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).</li>
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<li>Knoblauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+Phloem-Mobile+Probes%3A+Properties+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications.</a> Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).</li>
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<li>Erwee, M. G., Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplast+domains+in+extrastelar+tissues+of+Egeria+densa+Planch%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch.</a> Planta. 163 (1), 9-19 (1985).</li>
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<li>Radford, J. E., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tissue-preparation-induced+callose+synthesis+on+estimates+of+plasmodesma+size+exclusion+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits.</a> Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).</li>
<li>Kollist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Responses+to+Abiotic+Stress%3A+Priming+the+Landscape+for+the+Signal+Transduction+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network.</a> Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).</li>
<li>Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Symplastic+Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley.</a> Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).</li>
<li>Botha, C. E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xylem+sap+retrieval+pathway+in+rice+leaf+blades%3A+evidence+of+a+role+for+endocytosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?</a> Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los estudios emergentes han demostrado que las plantas pueden responder rápidamente a los estímulos externos23, incluida la manipulación introducida en los procedimientos experimentales22. En nuestro experimento inicial, nuestra supervisión de este conocimiento a menudo conduce a la falta de manchas. Con estas lecciones, sugerimos que se tengan en cuenta las siguientes precauciones al realizar este experimento: (1) las semillas después de la cosecha deben mantenerse en un g...

Muchos trazadores fluorescentes con una gama de propiedades espectrales, tales como 5 (6)-carboxifluoresceina (CF)1, 8-hidroxiypyrene-1, 3, 6-ácido trisulfónico2, Lucifer Yellow CH (lych)3, Esculin y cter4, se han desarrollado y aplica en plantas para monitorear el movimiento simplásico y la actividad del floema. Generalmente, un tinte simplástica se carga en un corte en el tejido objetivo y la dispersión secuencial del reportero en otras partes de la planta demostrará la comunicación intercelular. Aunque el mecanismo de absorción del tinte no se entiende completamente, el principio subyacente del movimiento CF dentro de las células vivas ha sido ampliamente reconocido. La forma de éster de CF (Diacetato de CF, CFDA) es no fluorescente, pero permeable a la membrana. Esta propiedad permite la rápida difusión de la membrana del tinte en las células. Una vez dentro de las células vivas, las esterasas intracelulares eliminan los grupos de acetato en la posición 3 ' y 6 ' de CFDA, liberando el CF fluorescente y impermeable a la membrana (figura 1, alternativamente referir a Wright et al.2); El CF puede entonces desplazarse a través de los plasmodesmata a otras partes de las plantas.
Un procedimiento bien establecido con CFDA es que se puede cargar en hojas de origen y se utiliza para monitorear la transmisión de floema y la descarga de floema en los tejidos de fregadero de muchas especies, por ejemplo, como descarga de CF en la raíz de Arabidopsis 5, floema descarga durante la tuberización de patata6, descarga de floema en el fregadero Nicotiana hojas7, y así sucesivamente. Mediante enfoques de carga similares, otros estudios han adoptado este tinte para demostrar la conexión simplástica entre el huésped y el parásito8,9, o para revelar las relaciones simbióticas10,11.
Otra forma de hacer uso de este tinte es cargarlo en celdas específicas o una sola célula por microinyección para determinar su patrón de distribución. Estas técnicas sofisticadas han facilitado en gran medida nuestra comprensión más profunda de la comunicación intercelular mediada por plasmodesmata, particularmente en el desarrollo del concepto de dominio simplástica12,13. Por ejemplo, la microinyección de CFDA en células de cotiledón de Arabidopsis dio como resultado el patrón de acoplamiento de tinte en la epidermis de hipocotilo pero no acoplamiento en las células subyacentes o en la epidermis de la raíz, por lo tanto, la epidermis hipocotilo forma un dominio simplástica14. Dominios similares, tales como las células de la Guardia estomas15, elemento de tamiz-células acompañantes16, células de pelo raíz14 y casquillo de raíz17,18 han sido identificados por la técnica de microinyección. Sorprendentemente, algunos dominios permiten que las moléculas trazadoras se muevan en una dirección determinada. Por ejemplo, tomar el dominio de tricomas, la microinyección de una sonda fluorescente en la célula epidérmica de soporte conduce al flujo de trazador en el dominio de tripeme, sin embargo, la inyección inversa no es verdadera19. Un informe reciente también ha encontrado situaciones similares en los dominios symplásicos del embrión20de Sedum . Por lo tanto, todos los casos anteriores implican que el intercambio de sitios de carga puede conducir a nuevas perspectivas en la comunicación simplástica. Nuestro experimento anterior con el objetivo de diseccionar la ruta del silenciamiento móvil de raíz a disparo identificó un nuevo dominio simplástica, o la zona Hej (Unión hipocotil-epicotilo), que se verificó aún más a través de la carga de la raíz (carga de sumidero no canónico) CFDA experimento21. Aquí, elaboramos aún más el movimiento CF de raíz a disparo usando un método simple y recuperando un potencial dominio simplástica desplazando los sitios de carga. Además, este procedimiento puede ser adaptado para diferenciar los antecedentes genéticos que han alterado el transporte de larga distancia de raíz a brote.

<table><tbody><tr><td>KNO3&nbsp; &nbsp;</td><td>Reactivo químico Sinopharm</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>Reactivo químico Sinopharm</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Reactivo químico Sinopharm</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Reactivo químico Sinopharm</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&middot; H2O&nbsp;</td><td>Reactivo químico Sinopharm</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>Reactivo químico Sinopharm</td><td>10019818</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Reactivo químico Sinopharm</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>Reactivo químico Sinopharm</td><td>10024018</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H2O</td><td>Reactivo químico Sinopharm</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Reactivo Químico Sinopharm</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>Reactivo Químico Sinopharm</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>FeSO4&middot; 7H2O</td><td>Reactivo Químico Sinopharm</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Reactivo Químico Sinopharm</td><td>10009717</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Reactivo Químico Sinopharm</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Reactivo Químico Sinopharm</td><td>10017018</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Reactivo Químico Sinopharm</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol&nbsp; &nbsp;</td><td>MACKLIN</td><td>I811835</td><td></td></tr><tr><td>Ácido nicotínico&nbsp;</td><td>MACKLIN</td><td>N814565</td><td></td></tr><tr><td>Piridoxina HCl</td><td>MACKLIN</td><td>V820447</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina HCl</td><td>MACKLIN T818865</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>MACKLIN</td><td>G800880</td><td></td></tr><tr><td>Agar en polvo</td><td></td> Microscopio de fluorescencia <td>Novon</td> ZZ14022 <td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom V16</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>SDPTOP</td><td>SRE-1030</td><td></td></tr><tr><td>200&mu; l pipeta</td><td>Dragon Laboratory Instruments</td><td>713111110000-20-200ul</td><td></td></tr><tr><td>2.5&mu; l pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000011</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas&nbsp;</td><td>PINZAS</td><td>ST-15</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de doble cara de acero inoxidable</td><td>Gillette</td><td>Platinum-Plus Cuchilla</td><td></td> de doble filo</tr></tbody></table>

movimiento de shootward de cfda tracer cargado en los tejidos de sumidero inferior de arabidopsis

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

El marcador simplástica 5 (6)-carboxyfluorescein diacetato (CFDA) se ha aplicado ampliamente en plantas vivas para demostrar la conexión intercelular, el transporte de floema y los patrones vasculares. Este protocolo muestra el movimiento carboxyfluorescein (CF) de abajo a arriba en la Arabidopsis utilizando el procedimiento de corte de la raíz y del hipocotilo-pinching respectivamente. Estos dos procedimientos diferentes resultan en diferentes eficiencias del movimiento CF: alrededor del 91% de aparición de CF en los brotes con el procedimiento hipocotilo-pinching, mientras que sólo alrededor del 70% de la aparición de la CF con el procedimiento de corte de la raíz. El simple cambio de los sitios de carga, lo que resulta en cambios significativos en la eficiencia móvil de este tinte simplástica, sugiere movimiento CF podría estar sujeto a la regulación simplástica, muy probablemente por la Unión raíz-hipocotilo.

El movimiento symplastic a menudo está sujeto a fluctuaciones ambientales. La perturbación del estado de cultivo de la planta, e incluso el proceso de preparación de tejido afectará el límite de exclusión de tamaño de plasmodesmata, afectando así el transporte simplástica22. Para mejorar la eficiencia de la tinción, limitamos nuestra operación en la sala de crecimiento, donde la temperatura y la humedad están estrechamente controladas, y también realizar todo el pr...

El objetivo de este protocolo es mostrar cómo cargar el CFDA en diferentes sitios de las partes inferiores de Arabidopsis. A continuación, presentamos el patrón de distribución resultante de CF en los brotes.

Movimiento de shootward de CFDA Tracer cargado en los tejidos de sumidero inferior de Arabidopsis

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, ...

La sonda ampliamente utilizada CFDA, o abreviatura de diacetato de carboxicfluoresceína, no es fluorescente. Los dos grupos H3 y la posición de 3'6' en este compuesto lo hacen permeante de membrana. Donde una vez dentro de las células, los acetatos celulares internos eliminarán los grupos de acetato y liberarán la nueva forma de CFDA.Eso es una carboxifluoresceína, o el CF, que es fluorescente. Y debido a que esta nueva forma es menos permeante de membrana, el peso, todas las células son para moverse a través de los poros intercelulares, o los plasmodesmatas en las plantas, que está haciendo de este diacetato la sonda ideal para estudiar el transporte intercelular en la actividad phloem. En el video de hoy, vamos a demostrar la carga cfD en la raíz y el hipocotilo de las plantas de Arabidopsis, respectivamente, y vamos a mostrar cómo los dos procedimientos ligeramente diferentes afectarán el movimiento de abajo a arriba de esta sonda fluorescente.Logramos resultados de tinción consistentemente, almacenamos las semillas de Arabidopsis cosechadas en cuatro grados Celsius, 40% gabinete de humedad. Las semillas recién cosechadas almacenadas en esta condición durante más de siete días se utilizan fácilmente para la siembra. Para garantizar que cada planta se cultiva en un espacio relativamente similar en el plato Petri, estamos usando una tarjeta de calidad de zona de semillas.Ahora, mojando la punta esterilizada, sumérgete en las semillas esterilizadas y siembra las semillas una por una en la posición designada. Después de terminar de sembrar, sellar el plato de Petri con parafilm y una cinta adhesiva, ponerlos en un soporte de petri para dejarlo crecer verticalmente. Estas son las herramientas que vamos a usar en este experimento.Tenga en cuenta que será mejor que carguemos el tinte lo más rápido que podamos. Normalmente, termina todo el proceso en 10 a 15 minutos. Antes de realizar el experimento de carga CFDA, siempre preparamos una solución CFDA fresca.Aquí, diluir el CFDA de un milimolar en cinco concentraciones micromolares con agua antes de su uso inmediato. Corta el parafilm en trozos pequeños en tres por tres milímetros de tamaño. Debido a que hay condensación en la tapa y la parte inferior de la placa Petri, tenemos que limpiarlos con una toalla de papel para evitar que el tinte fluya alrededor.Una pequeña pieza de parafilm se coloca bajo la raíz. Levante las plantas y colóquelas en la tapa. Corta las raíces de cinco a 10 milímetros por debajo del hipocotilo.Tome los brotes de nuevo en los pequeños trozos de parafilm. Ahora aplique cuidadosamente un microlitro CFDA en el extremo de corte de la raíz. Trate de evitar contaminar todas las protoplantas.Luego cubra la tapa y luego déjelas en la sala de crecimiento durante dos horas. El método de hipocotilo-pinching. La pequeña pieza de parafilm, como se preparó previamente, se coloca debajo de la unión raíz-hipocotilo.Usamos un forecep para pellizcar suavemente el hipocotilo cerca del tejido radicular, y aplicamos cuidadosamente 0.1 microlitr CFDA en el lado pellizcado y dejar la planta durante dos horas. Las fotos de nueve a 12 días después de la zona de tinción de plantas. Todos muestran el patrón de tinción vascular tanto en los cotiledones como en las hojas verdaderas.Sólo en un caso muy raro, la hoja de cotiledones mostró un patrón de tinción de media hoja. Así que básicamente, los dos métodos no hicieron una diferencia en el patrón de tinción DE CF, sin embargo, si realizamos la carga de tinte en más y más plantas, encontramos que los dos procedimientos dan un acuerdo de diferencia significativa en eficiencia. Con el método de corte de raíz, alrededor del 70% de las plantas muestran la señal fluorescente en el brote.Pero la eficiencia se puede aumentar al 91%utilizando el método de hipocotilo-pinching. También probamos el método de pellizcar la raíz, pero este método resulta en la eficiencia aún menor, es alrededor de 30%Por lo tanto, parece que la manera de cargar el tinte no tiene en cuenta la diferencia de tinción. La diferencia probablemente radica en los sitios de carga, que podrían estar separados por una barrera simplástica.Mostramos cómo cargamos el CFDA en las raíces de Arabidopsis y el hipocotilo. Usamos dos procedimientos ligeramente diferentes, y estos dos procedimientos ligeramente diferentes resultan en una diferencia significativa en este movimiento de la sonda de abajo a la parte superior. Sugerimos que este método podría ayudarnos a identificar una posible barrera silásica para las señales de disparo derivadas de la raíz.

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