Name: Estudio de la infección por criptosporidio en sistemas de cultivo organoides humanos derivados del tejido 3D por microinyección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Aprende a purificar esporozoitos de Cryptosporidium parvum y microinyectarlos en organoides intestinales y respiratorios humanos. Este protocolo permite visualizar infecciones mediante inmunotinción y estudiar interacciones huésped-patógeno.

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Estamos agradecidos a Deborah A. Schaefer de la Escuela de Ciencias Biomédicas Animales y Comparadas, Facultad de Agricultura y Ciencias de la Vida, Universidad de Arizona, Tucson, AZ, EE. UU. por ayudarnos con la producción y análisis de ovocitos. También agradecemos a Franceschi Microscopy and Imaging Center y a D.L. Mullendore de la Universidad Estatal de Washington por la preparación de TEM y la toma de imágenes de ovocitos organoides aislados.
D.D. es beneficiario de una subvención VENI de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. es galardonado con una beca VENI de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO-ALW, 863.14.002) y recibió el apoyo de becas Marie Curie de la Comisión Europea (Propuesta 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). La investigación que ha llevado a estos resultados ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación en virtud del Acuerdo Avanzado de Subvenciones DEL ERC no 67013 y del NIH NIAIH en virtud de R21 AT009174 a RMO. Este trabajo es parte del Instituto Oncode, que es financiado en parte por la Sociedad Holandesa contra el Cáncer y fue financiado por una subvención de la Sociedad Holandesa contra el Cáncer.

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<li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li>
<li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Cultivo de parásitos Cryptosporidium en organoides intestinales y de las vías respiratorias proporciona un modelo preciso para estudiar las interacciones huésped-parásito10, pero también tiene muchas otras aplicaciones. Por ejemplo, los métodos actuales de selección y propagación de parásitos Cryptosporidium modificados genéticamente requieren el paso en ratones19 que no permite el aislamiento de parásitos que tienen modificaciones esenciales para la infec...

El desarrollo de fármacos o vacunas para el tratamiento y la prevención de la infección por Cryptosporidium se ha visto obstaculizado por la falta de sistemas in vitro que imitan con precisión la situación in vivo en los seres humanos1,2. Muchos de los sistemas disponibles actualmente sólo permiten la infección a corto plazo (<5 días) o no soportan el ciclo de vida completo del parásito3,4. Otros sistemas que permiten el desarrollo completo del parásito se basan en líneas celulares inmortalizadas o líneas celulares cancerosas que no recapitulan fielmente la situación fisiológica en los seres humanos5,6,7 . Los organoides o 'mini-órganos' son estructuras derivadas de tejido 3D que se cultivan en una matriz extracelular complementada con varios factores de crecimiento específicos del tejido. Los organoides se han desarrollado a partir de diversos órganos y tejidos. Son genéticamente estables y recapitulan la mayoría de las funciones de los órganos de su origen, y pueden mantenerse en cultivo durante largos períodos de tiempo. Hemos desarrollado un método para infectar los organoides intestinales y pulmonares humanos con Cryptosporidium que proporciona un modelo in vitro preciso para el estudio de las interacciones huésped-parásito relevantes para la criptosporidiosis intestinal y respiratoria8 ,9,10,11,12,13. A diferencia de otros modelos de cultivo publicados, el sistema organoide es representativo de las interacciones del parásito huésped de la vida real, permite completar el ciclo de vida para que se puedan estudiar todas las etapas del ciclo de vida del parásito y mantiene la propagación del parásito hasta 28 días10.
Cryptosporidium parvum es un parásito apicomplexiano que infecta el epitelio de las vías respiratorias e intestinales, causando una enfermedad diarreica prolongada. La etapa ambiental resistente es el ovocitos, que se encuentra en los alimentos contaminados y el agua14. Una vez ingeridos o inhalados, el ovocitos y libera cuatro esporozoitos que se unen a las células epiteliales. Los esporozoítos se deslizan sobre las células de los huésped y atraen a los receptores de células huésped, pero el parásito no invade completamente la célula, y parece inducir a la célula huésped a engullirla15. El parásito, que se internaliza dentro de un compartimento intracelular pero extractitoplasma, permanece en la superficie apical de la célula, replicando dentro de una vacuola parasitoforosa. Se somete a dos rondas de reproducción asexual, un proceso llamado merogonía. Durante la merogonía, se desarrollan merontas tipo I que contienen ocho merozoitas que se liberan para invadir nuevas células. Estos merozoítos invaden nuevas células para convertirse en merontas de tipo II que contienen cuatro merozoitas. Estos merozoítos, cuando se liberan, infectan las células y se convierten en macrogamontes y microgamontes. Los microgametos se liberan y fertilizan los macrogametos que producen cigotes que maduran en ovocitos. Los ovocitos maduros se liberan posteriormente en el lumen. Los ovocitos son de paredes delgadas que se exquistan inmediatamente para reinfectar el epitelio, o paredes gruesas que se liberan en el medio ambiente para infectar al siguiente huésped14. Todas las etapas del ciclo de vida de Cryptosporidium han sido identificadas en el sistema de cultivo organoide previamente desarrollado por nuestro grupo10.
Dado que los organoides humanos replican fielmente los tejidos humanos9,11,13, y apoyan todas las etapas replicativas de Cryptosporidium10,son el sistema de cultivo de tejido ideal para estudiar Biología criptosporidio e interacciones huésped-parásito. Aquí describimos los procedimientos para infectar organoides con ovocitos de Cryptosporidium y esporozoitos exquistes, y aislar los nuevos ovocitos producidos en este sistema de cultivo de tejidos.

<table><tbody><tr><td>Extracto de membrana basal (matriz extracelular)</td><td>amsbio</td><td>3533-010-02</td><td>&nbsp; </fuerte></td></tr><tr><td>Anticuerpo Crypt-a-Glo (anticuerpo específico de ooquiste)</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLR-1X</td><td>Concentración final = Use 2-3 gotas/diapositiva</td></tr><tr><td>Crypto-Grab IgM recubierta de perlas magnéticas</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bastidor Dynamag 15</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12301D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynamag 2 bastidor</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12321D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EMD Millipore&nbsp; Filtros de membrana de policarbonato isopore- 3&micro; m</td><td>EMD-Millipore</td><td>TSTP02500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tinte verde rápido</td><td>SIGMA</td><td>F7252-5G&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microinyector Femtojet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de 1 mm de diámetro</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel (matriz extracelular)</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de microfuga 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>T9661-1000EA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Puntas de microcargador</td><td>Eppendorf</td><td>612-7933</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas P-97</td><td>Instrumento de obturación</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hipoclorito de sodio (usar 5%)</td><td>Clorox</td><td>50371478</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Correderas Super stick</td><td>Waterborne, Inc</td><td>S100-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Swinnex-25 47 mm Portafiltros de policarbonato</td><td>EMD-Millipore</td><td>SX0002500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido taurocólico sodio sal hidrato</td><td>SIGMA</td><td>T4009-5G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>8221840500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agente de montaje Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Industrias científicas, Inc</td><td>SI0236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td><fuerte>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>Cantidad final</fuerte></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 mL de stock en 500 mL DMEM</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL de stock en 500 mL DMEM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td>5 mL de stock en 500 mL DMEM</td></tr><tr><td><fuerte> ORGANOIDE INTESTINAL MEDIA-OME (Medios de expansión)</fuerte><</td><td>fuerte>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte><</td><td>fuerte>Concentración final</fuerte></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>0.5 y micro; M</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>Preparación de hasta 100 mL</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006-1mg</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>NIC</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin CM</td><td>En casa*</td><td>&nbsp;</td><td>10%</td></tr><tr><td>Inhibidor de P38 (SB202190)</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>10 y micro; M</td></tr><tr><td>PGE2</td><td>Tocris</td><td>2296/10</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1 mL/500 mL medios</td></tr><tr><td>RSpoI CM</td><td>En casa*</td><td>&nbsp;</td><td>20%</td></tr><tr><td>Wnt3a CM</td><td>En casa*</td><td>&nbsp;</td><td>50%</td></tr><tr><td>En la casa* - se proporcionarán líneas celulares a pedido</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td><MEDIOS ORGANOIDES INTESTINALES FUERTES>-OMD (Medios de diferenciación)</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>Para diferenciar los organoides, los organoides del intestino delgado en expansión se cultivaron en un medio rico en Wnt durante seis a siete días después de la división, y luego se cultivaron en un medio de diferenciación (retiro de Wnt, nicotinamida, SB202190, en un medio de diferenciación (retiro de Wnt, nicotinamida, SB202190, prostaglandina E2 de un medio rico en Wnt u OME)</td></tr><tr><td><fuerte>MEDIOS ORGANOIDES PULMONARES- LOM (Medios de diferenciación)</fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>Concentración final</fuerte></td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>Preparación de hasta 100 mL</td></tr><tr><td>ALK-I A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>0.07638888889</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>25 ng/mL</td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>Contactar con la empresa directamente</td><td>10%</td></tr><tr><td>p38 MAPK-I</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>1 y micro; M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1:500</td></tr><tr><td>RhoKI Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817_100 mg</td><td>2.5 &micro; m</td></tr><tr><td>Rspo UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>Contactar directamente</td> con la empresa <td>10%</td></tr><tr><td><fuerte>tampón reductor (para la resuspensión de ooquistes y esporozoítos para inyección)</fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>Concentración final</fuerte></td></tr><tr><td>L-Glutatión reducido</td><td>Sigma</td><td>G4251-10MG</td><td>0.5 &mu; g/&mu; L de OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Betaína</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td>0,5 &mu; g/&mu; L de OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma</td><td>168149-2.5G</td><td>0.5 &mu; g/&mu; L de ácido linoleico OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>L1376-10MG</td><td>6.8 &mu; g/mL de OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T0625-10MG</td><td>0.5 &mu; g/&mu; L de tampón bloqueante < OME/OMD/LOMfuerte</td></tr><tr><td>> (para la tinción por inmunofluorescencia)</fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>Concentración final</fuerte></td></tr><tr><td>Burro/Suero de cabra</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>2%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>70011044</td><td>Fabricación de hasta 100 mL</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>P1379</td><td>0.1%</td></tr><tr><td><fuerte>Lista de anticuerpos utilizados </fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </td></tr><tr><td>Alexa 568 cabra anti-conejo</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>Dilución-1:500; RRID: AB_143157</td></tr><tr><td>Kit completo Crypt-a-Glo- Anticuerpo marcado con fluoresceína Crypto-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLK</td><td>Dilución- 1:200</td></tr><tr><td>Crypta-Grab IMS Beads- Perlas magnéticas recubiertas de anticuerpo monoclonal reactivo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>Dilución-1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Dilución-1:1,000; RRID : AB_2629482</td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa 674</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>Dilución-1:1.000; RRID: AB_2620155</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-gp15 de conejo generado por R. M. O' Connor (coautor).</td><td>A petición</td><td>A petición</td><td>Dilución-1:500</td></tr><tr><td>Sporo-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A600FLR-1X</td><td>Dilución- 1:200</td></tr></tbody></table>

estudio de la infección por criptosporidio en sistemas de cultivo organoides humanos derivados del tejido 3d por microinyección

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Cryptosporidium parvum es una de las principales causas de la enfermedad diarreica humana. Para entender la patología del parásito y desarrollar fármacos eficientes, se necesita un sistema de cultivo in vitro que recapitula las condiciones en el huésped. Los organoides, que se asemejan mucho a los tejidos de su origen, son ideales para estudiar las interacciones huésped-parásito. Los organoides son estructuras tridimensionales (3D) derivadas del tejido que se derivan de células madre adultas y crecen en cultivo durante largos períodos de tiempo sin someterse a ninguna aberración o transformación genética. Tienen una polaridad bien definida con superficies apicales y basolaterales. Los organoides tienen varias aplicaciones en pruebas de drogas, biobanca, y modelado de enfermedades y estudios de interacción huésped-microbio. Aquí presentamos un protocolo paso a paso de cómo preparar los ovocitos y esporozoítos de Cryptosporidium para infectar los organoides intestinales y de las vías respiratorias humanas. A continuación, demostramos cómo se puede utilizar la microinyección para inyectar los microbios en el lumen organoide. Existen tres métodos principales por los que los organoides se pueden utilizar para los estudios de interacción huésped-microbio: microinyección, cizallamiento mecánico y chapado, y mediante la fabricación de monocapas. La microinyección permite el mantenimiento de la estructura 3D y permite un control preciso de los volúmenes del parásito y el contacto lateral apical directo para los microbios. Proporcionamos detalles para el crecimiento óptimo de organoides para la creación de imágenes u ovocitos. Por último, también demostramos cómo los ovocitos recién generados se pueden aislar del organoide para un mayor procesamiento y análisis aguas abajo.

Los protocolos presentados aquí dan como resultado la purificación eficiente de ovocitos y esporozoitos(Figura 1A)listos para la microinyección. El protocolo de excystation da como resultado la liberación de esporozoitos de aproximadamente el 70-80% de los ovocitos, por lo tanto, es esencial filtrar los ovocitos y conchas restantes a través de un filtro de 3 m. La filtración da como resultado una purificación de casi 100% esporozoita(Figura 1B). Además, la adici...

Describimos protocolos para preparar ovocitos y purificar esporozoitos para el estudio de la infección de organoides intestinales y de las vías respiratorias humanas por Cryptosporidium parvum. Demostramos los procedimientos para la microinyección de parásitos en el lumen organoide intestinal y la inmunomancha ción de organoides. Por último, describimos el aislamiento de los ovocitos generados de los organoides.

Estudio de la infección por criptosporidio en sistemas de cultivo organoides humanos derivados del tejido 3D por microinyección

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

Usando este procedimiento de purificación y microinyección de esporozoíto, esencialmente cualquier microbio huésped puede ser estudiado en cualquier sistema de órganos derivados del tejido. Usando esta técnica, podemos controlar la cantidad de esporozoítos puros inyectados en el lumen organoide o en el lado apical del organoide. Para purificar los esporozoitos de C.parvum, transfiera el ócicle a un tubo de 15 mililitros y resuspendir las células a una multiplicación por 10 al séptimo ócicle por mililitro de concentración media.Después de 60 a 90 minutos a 37 grados Celsius, mezcle 14 mililitros de una solución de lavado adecuada con los ovocitos, y sedimente las células por centrifugación. Aspirar el sobrenadante cuidadosamente para evitar la pérdida de ovocitos y resuspender el pellet esporoico a tres veces 10 al séptimo ovocitos por uno a dos mililitros de concentración DMEM. Para eliminar los ovocitos y conchas restantes, coloque un barril de jeringa de 10 mililitros equipado con un aparato portafiltros de 47 mililitros equipado con un filtro de policarbonato de tres micrómetros de tamaño de poro en un tubo de 15 mililitros a cuatro grados centígrados.Añadir 7,5 mililitros de la suspensión de esporozoito al conjunto del filtro. Cuando todo el volumen haya pasado a través del colador por gravedad, lave las células restantes a través del colador con otros 7,5 mililitros de DMEM. Cuando todo el lavado haya pasado por el colador, recoja la suspensión de esporozoita filtrada por centrifugación durante 10 minutos y etiquete el pellet en 50 a 100 microlitros de un medio de cultivo organoide apropiado, complementado con un tinte verde 0.05% rápido, y L-glututeno, betaína, L-cisteína, ácido linoleico y tamina que contienenPara microinjecupar los parásitos en el lado apical de un organoide 3D, utilice primero un tirador de micropipetas para preparar capilares de inyección de vidrio. Utilice fórceps para cortar la punta del capilar a un diámetro de nueve a 12 micrómetros para permitir un flujo fácil de esporozoitos u ovocitos, si decide inyectar ovocitos directamente, y utilice puntas de micro-cargador para llenar cada capilar con un tinte verde rápido etiquetado como ovocitos o suspensión de espozoito. A continuación, cargue el primer capilar lleno de esporozoío en un microinyector y utilice un microscopio invertido con un aumento de 5x y una presión constante a microinyecyject 100 a 200 nanolitros de la suspensión en cada organoide.El protocolo de excilción da lugar a la liberación de esporozoítos de aproximadamente 70 a 80% de los ovocitos. Por lo tanto, es esencial filtrar las cáscaras de ovocitos restantes a través de una filtración de tres micrómetros. Retire casi el 100% de los ovocitos sin escudrencia.Además, la adición de un tinte verde ayuda a asegurar la inyección de todos los organoides, y permite la visualización de los organoides inyectados durante al menos 24 horas después de la inyección. Aunque se trata de un método bien practicado, la microscopía electrónica de barrido se puede utilizar para garantizar que el proceso de excistation no dañe a los esporozoítos o a los ovocitos. La inyección de cantidades iguales de ovocitos en el lumen organoide se puede confirmar visualmente mediante imágenes microscópicas simples.Los ensayos de inmunofluorescencia también se pueden utilizar para explorar los tipos de células infectadas por Cryptosporidium. Después de que los organoides diferenciados se hayan infectado durante cinco días, la presencia de esporozoítos dentro de los ovocitos puede confirmarse secando una porción de los ovocitos en un portaobjetos adhesivo, fijando los ovocitos con metanol y combinando la tinción DAPI con un anticuerpo específico para ovocitos adecuado. Para obtener los máximos resultados, utilice ovocitos frescos, utilice el mismo capilar para todas las inyecciones y cambie los medios todos los días después de la inyección.Usando esta técnica, varios laboratorios están empezando a usar organoides para estudiar las interacciones huésped-microbio. Estamos estudiando los commensales, así como otros patógenos en entornos de microcultivo organoides similares. Como Cryptosporidium es un parásito humano, es importante realizar estos experimentos de acuerdo con las regulaciones de seguridad de nivel 2.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, demostramos un método in vitro para purificar esporozoítos de ooquistes de paredes gruesas del parásito patógeno Cryptosporidium parvum. Los esporozoítos aislados se pueden utilizar para estudios de infección.

Aislamiento in vitro de esporozoítos de ooquistes de Cryptosporidium parvum

Este video muestra una técnica de microinyección para desarrollar un modelo de infección de organoides intestinales humanos. La etapa infecciosa de esporozoíto del parásito Cryptosporidium parvum se microinyecta en la luz del organoide. Al invadir las células epiteliales del organoide, se reproduce asexual y sexualmente para completar su ciclo de vida y propagar la infección.

Una técnica para desarrollar una infección parasitaria en organoides intestinales mediante microinyección

Este protocolo explica cultura organoid-Lgr5 positve primaria y la posterior ejecución de la transducción retroviral. Esto permite la sobreexpresión Cre-inducible o caída del transgén entregado y permite estudios funcionales que se llevarán a cabo en la novela en organotípico vitro   sistema modelo.

Un Protocolo de vídeo de la infección retroviral en Primaria Intestinal organoide Cultura

En este protocolo de vídeo damos una explicación paso a paso de la transducción lentiviral en organoides del epitelio intestinal primario y del procesamiento y análisis posterior de estos cultivos mediante RT-PCR cuantitativo, microarrays de ARN e inmunohistoquímica.

Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides

Los cultivos derivados de células madre albergan un tremendo potencial para modelar enfermedades infecciosas. Aquí se describe el cultivo de organoides gástricos de ratón y humanos derivados de células madre adultas. Los organoides se microinyectan con el patógeno gástrico Helicobacter pylori.

Organoides como Modelo para Enfermedades Infecciosas: Cultura de Derechos Humanos y organoides estomacales murinos y microinyección de Helicobacter Pylori

Este protocolo describe la medición de la permeabilidad de la barrera epitelial en el tratamiento farmacológico siguiente en tiempo real en humanos organitas intestinal mediante microscopía fluorescente y vivo microscopia celular.

Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides Intestinal humano

Los organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) ofrecen oportunidades emocionantes para modelar enfermedades entérica in vitro. Demostramos la diferenciación de los hiPSCs en los organoides intestinales (iHOs), la estimulación de estos iHOs con citoquinas, y la microinyección de Salmonella typhimurium en el lumen IHO, permitiendo el estudio de una invasión epitelial por este Patógeno.

Usando organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos para estudiar y modificar la protección de células epiteliales contra Salmonella y otros patógenos

Aquí presentamos dos protocolos que permiten el modelado de interacciones intestinales apical-específicas. las monocapas intestinales Organoide-derivadas y las culturas de la interfaz aire-líquido (ALI) facilitan la generación de epitelios bien diferenciados accesibles de lados luminales y basolaterales, mientras que los organoids intestinales polaridad-invertidos exponen su lado apical y son susceptibles a los análisis de alto rendimiento.

Métodos de cultivo para estudiar las interacciones apicales específicas utilizando modelos organoides intestinales

El presente protocolo describe el establecimiento de un sistema organoide colónico murino para estudiar la actividad y el funcionamiento de las células madre colónicas en un modelo knockout de claudina-7.

Cultivo tridimensional de criptas colónicas murinas para estudiar la función de las células madre intestinales ex vivo

Describimos un protocolo para aislar criptas murinas del intestino delgado y cultivar organoides 3D intestinales de las criptas. Además, describimos un método para generar organoides a partir de una sola célula madre intestinal en ausencia de un nicho celular subepitelial.

El cultivo 3D de organoides a partir de criptas intestinales murinas y una sola célula madre para la investigación de organoides

El estudio presenta un método para la investigación in vitro de infecciones bacterianas utilizando organoides intestinales derivados de células madre tisulares. El protocolo describe cómo cultivar y diferenciar organoides en dos dimensiones, infectarlos con Escherichia coli invasiva adherente y evaluar indicadores clave, incluyendo la ruptura de la barrera epitelial, la imagen de infecciones y la respuesta del ARN epitelial.

Un cultivo de organoides bidimensional sobre una invasina o extracto de membrana basal para estudiar las interacciones huésped-bacteria

Aprende a purificar esporozoitos de Cryptosporidium parvum y microinyectarlos en organoides intestinales y respiratorios humanos. Este protocolo permite visualizar infecciones mediante inmunotinción y estudiar interacciones huésped-patógeno.

Estudio de la infección por criptosporidio en sistemas de cultivo organoides humanos derivados del tejido 3D por microinyección

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