Name: Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprende a cuantificar la unión de proteínas de unión a ARN en células bacterianas vivas mediante un ensayo de represión de gen reportero. Este método permite medir afinidades específicas y comprender interacciones proteína-ARN in vivo.

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Este proyecto recibió financiación del Programa I-CORE del Comité de Planificación y Presupuesto y de la Fundación Científica de Israel (Grant No 152/11), Marie Curie Reintegration Grant No. PCIG11-GA- 2012-321675, y del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención no 664918 - MRG-Grammar.

1. Preparación del sistema
<ol><li>Diseño de plásmidos de sitio de encuadernación
	<ol>
<li>Diseñe el cassette del sitio de enlace como se muestra en la Figura1. Cada minigen contiene las siguientes partes (5' a 3'): sitio de restricción de Eagl, 40 bases del extremo de 5' del gen de resistencia de kanamicina (Kan), promotor pLac-Ara, sitio de unión ribosoma (RBS), AUG del gen mCherry, un espaciador ( ) , un sitio de unión RBP, 80 bases del extremo 5' del gen mCherry, y un sitio de restricción de ApaLI. NOTA: Para aumentar la tasa de éxito del ensayo, diseñe tres casetes de sitio de enlace para cada sitio de enlace, con espaciadores que consisten en al menos una, dos y tres bases. Consulte la sección Resultados representativos para obtener más directrices.</li>
	</ol></li>
	<li>Clonación de plásmidos de sitios de encuadernación
	<ol>
<li>Ordene los casetes del sitio de unión como minigenes de ADN de doble cadena (dsDNA). Cada minigene tiene 500 bp de largo y contiene un sitio de restricción de Eagl y un sitio de restricción ApaLI en los extremos de 5' y 3', respectivamente (ver paso 1.1.1). NOTA: En este experimento, se ordenaron minigenes con la mitad del gen kanamicina para facilitar la detección de colonias positivas. Sin embargo, Gibson ensamblaje17 también es adecuado aquí, en cuyo caso el sitio de unión se puede pedir como dos oligos de ADN complementarios más cortos de una sola cadena.</li>
		<li>Digerir dos veces tanto los minigenes como el vector de destino con Eagl-HF y ApaLI mediante el protocolo de restricción18,y purificar la columna19.</li>
		<li>Ligar los minigenes digeridos a la columna vertebral del sitio de unión que contiene el resto del gen reportero mCherry, terminador, y un gen de resistencia a la kanamicina20.</li>
		<li>Transformar la solución de ligación en Escherichia coli TOP10 células21.</li>
		<li>Identifique transformadores positivos a través de la secuenciación de Sanger.<ol>
<li>Diseñe una imprimación de 100 bases aguas arriba de la región de interés (véase el Cuadro 1 para las secuencias de imprimación).</li>
			<li>Miniprep algunas colonias bacterianas22.</li>
			<li>Preparar 5 ml de una solución de 5 mM de la imprimación y 10 ml del ADN a una concentración de 80 ng/L.</li>
			<li>Envíe las dos soluciones a una instalación conveniente para la secuenciación de Sanger23.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Almacene los plásmidos purificados a -20 oC, y las cepas bacterianas como las existencias de glicerol24,ambas en el formato de 96 oC. El ADN se utilizará para la transformación en células De. coli TOP10 que contienen uno de los cuatro plásmidos de fusión-RBP (ver paso 1.3.5).</li>
	</ol></li>
	<li>Diseño y construcción del plásmido RBP NOTA: Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de las proteínas de capa utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla2.<ol>
<li>Ordene la secuencia RBP requerida que carezca de un codón de parada como un minigénmino dsDNA ordenado a medida que carece de un codón de parada con sitios de restricción en los extremos (Figura1).</li>
		<li>Clonar la RBP probada que carece de un codón de parada inmediatamente aguas abajo de un promotor inducible y aguas arriba de una proteína fluorescente que carece de un codón de inicio (Figura1), similar a los pasos 1.2.2-1.2.4. Asegúrese de que el plásmido RBP contiene un gen de resistencia a los antibióticos diferente del plásmido del sitio de unión.</li>
		<li>Identifique transformadores positivos mediante la secuenciación de Sanger, similar al paso 1.2.5 (consulte la Tabla 1 para las secuencias de imprimación).</li>
		<li>Elija un transformador positivo y hacerlo químicamente competente25. Conservar como plásmidos purificados de glicerol a -20 oC y reservas de glicerol de cepas bacterianas24 a -80 oC en placas de 96 pocillos.</li>
		<li>Transformar los plásmidos del sitio de unión (del paso 1.2.6) almacenados en placas de 96 pocillos en células bacterianas químicamente competentes que ya contienen un plásmido RBP-mCerulean21. Para ahorrar tiempo, en lugar de enchapar las células en los platos de Petri, placarlos usando un pipeteador de 8 canales en placas de 8 carriles que contienen Luria-Bertani (LB)26 agar con antibióticos relevantes (Kan y Amp). Las colonias deben aparecer en 16 h.</li>
		<li>Seleccione una sola colonia para cada doble transformador y crezca durante la noche en medio LB con los antibióticos relevantes (Kan y Amp) y almacene como reservas de glicerol24 a -80 oC en placas de 96 pocillos.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Configuración del experimento
NOTA: El protocolo presentado aquí se realizó utilizando un sistema robótico de manipulación de líquidos en combinación con una incubadora y un lector de placas. Cada medición se llevó a cabo para 24 concentraciones de inductores, con dos duplicados para cada cepa + combinación de inductor. Usando este sistema robótico, se recogieron datos de 16 cepas por día con 24 concentraciones de inductores. Sin embargo, si un dispositivo de este tipo no está disponible, o si se realizan menos experimentos, estos se pueden hacer fácilmente a mano utilizando una multipipe de 8 canales y adaptando el protocolo en consecuencia. Por ejemplo, se adquirieron resultados preliminares para cuatro cepas al día con 12 concentraciones de inductores y cuatro puntos de tiempo de esta manera.
<ol><li>Preparar, de antemano, 1 L de tampón de bioensayo (BA) mezclando 0,5 g de tripatona, 0,3 ml de glicerol, 5,8 g de NaCl, 50 ml de 1 M MgSO4, 1 ml de 10x de tampón de solución salina con fosfato (PBS) pH 7,4 y 950 ml de agua destilada doble (DDW). Autoclave o filtro estéril del búfer BA.</li>
	<li>Cultivar las cepas de doble transformación a 37 oC y 250 rpm agitando en 1,5 ml de LB con antibióticos adecuados (kanamicina a una concentración final de 25 g/ml y ampicilina a una concentración final de 100 ég/ml), en placas de 48 pocillos, durante un período de 18 h (durante la noche).</li>
	<li>
Por la mañana, haga los siguientes preparativos.
	<ol>
<li>Placa de inductor. En una placa limpia de 96 pocillos, prepare los pozos con un medio semi-pobre (SPM) que consta de 95% BA y 5% LB26 en la incubadora a 37oC. El número de pozos corresponde al número deseado de concentraciones de inductores. Añadir C4-HSL a los pocillos de la placa inductora que contendrá la mayor concentración de inductor (218 nM).</li>
		<li>Programe el robot para diluir en serie el medio de cada uno de los pozos de mayor concentración en 23 concentraciones más bajas que van de 0 a 218 nM. El volumen de cada dilución del inductor debe ser suficiente para todas las cepas (incluidos los duplicados).</li>
		<li>Mientras se preparan las diluciones del inductor, caliente 180 s de SPM en la incubadora a 37 oC, en placas de 96 pocillos.</li>
		<li>Diluir las cepas durante la noche del paso 2.2 por un factor de 100 por diluciones en serie: primero diluir por un factor de 10 mezclando 100 s de bacterias con 900 sL de SPM en placas de 48 pocillos, y luego diluir de nuevo por un factor de 10 tomando 20 s de la solución diluida en 180 l de SPM precalentado, en placas de 96 pocillos adecuadas para mediciones fluorescentes.</li>
		<li>Agregue el inductor diluido de la placa del inductor a las placas de 96 pocillos con las cepas diluidas de acuerdo con las concentraciones finales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agitar las placas de 96 pocillos a 37oC durante 6 h, mientras se toman medidas de densidad óptica a 595 nm (OD595),mCherry (560 nm/612 nm) y fluorescencia mCerulean (460 nm/510 nm) a través de un lector de placas cada 30 minutos. Para fines de normalización, mida el crecimiento de SMP sin necesidad de agregar células.</li>
</ol>3. Análisis preliminar de resultados
<ol><li>Para cada día de experimento, elija un intervalo de tiempo de crecimiento logarítmico de acuerdocon las curvas de crecimiento medidas, entre la fase de crecimiento lineal y la estacionaria (T 0, Tfinal). Tome aproximadamente 6 x 8 puntos de tiempo, mientras descarta la primera y la última mediciones para evitar errores derivados de la inexactitud de la detección exponencial del crecimiento (véase la figura 2A,panel superior). NOTA: Deseche las cepas que muestran curvas de crecimiento anormales o cepas en las que no se pudo detectar la fase de crecimiento logarítmico y repita el experimento.</li>
	<li>
Calcular la fluorescencia normalizada media de mCerulean y la tasa de producción de mCherry, a partir de los datos brutos de fluorescencia mcerulean y mCherry para cada concentración de inductor (Figura2A).
	<ol>
<li>Calcule mCerulean normalizado de la siguiente manera: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq1.jpg"> donde blank(mCerulean) es el nivel mCerulean [a.u.] para medio solamente, blank(OD) es la densidad óptica para medios solamente, y mCerulean y OD son los valores de fluorescencia mceruleana y densidad óptica, respectivamente.</li>
		<li>MCerulean promedio sobre los diferentes puntos de tiempo (Figura2B,dos paneles superiores) de la siguiente manera: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq2.jpg"> donde #Time puntos es el número de puntos de tiempo de datos que se tienen en cuenta, T0 es el momento en el que comienza la fase de crecimiento exponencial, y Tfinal es el momento en el que finaliza la fase de crecimiento exponencial.</li>
		<li>Calcule la tasa de producción de mCherry (Figura2B,dos paneles inferiores) de la siguiente manera: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq3.jpg"> donde mCherry(t) es el nivel de mCherry [a.u.] en el momento t, OD es el valor de densidad óptica, T0 es el momento en el que comienza la fase de crecimiento exponencial, y Tfinal es el momento en el que finaliza la fase de crecimiento exponencial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Por último, trazar la tasa de producción de mCherry en función de mCerulean, creando curvas de respuesta a la dosis en función de la fluorescencia de fusión RBP-mCerulean (Figura2C). Tales tramas representan la producción del gen reportero en función de la presencia de la RBP en la célula.</li>
</ol>4. Rutina de ajuste de la función de respuesta de la dosis y extracción de KRBP
<ol><li>Bajo el supuesto de que la tasa de traducción ribosoma con el límite RBP es constante, modele la tasa de producción de mCherry de la siguiente manera (véase la figura 2D,línea verde): <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq4.jpg"> donde [x] es la fluorescencia media normalizada de mCerulean calculada de acuerdo con Eq. 2, la tasa de producción de mCherry es el valor calculado de acuerdo con Eq. 3, KRBP es la afinidad de unión relativa [a.u.], Ksin consolidar es la tasa ribosoma de traducción con la RBP sin consolidar, n es el factor de cooperatividad, y C es la fluorescencia base [a.u.]. C, n, Ksin consolidary KRBP se encuentran ajustando los datos de la velocidad de producción de mCherry al modelo (Eq. 4).</li>
	<li>Utilizando el software de análisis de datos, lleve a cabo un procedimiento de ajuste en parcelas que representen la tasa de producción de mCherry en función de mCerulean promedio (paso 3.3) y extraiga los parámetros de ajuste de acuerdo con la fórmula en Eq. 4. NOTA: Solo se tienen en cuenta los resultados de ajuste con R2 &gt; 0,6. Para esos ajustes, error KRBP está principalmente en el rango de 0.5% a 20% de los valores de KRBP, para un intervalo de confianza 0.67, mientras que aquellos con mayor error KRBP también pueden ser verificados por ojo.</li>
	<li>Normalizar los valores deK RBP por el valor máximo respectivo de mCerulean promediado para cada función dosis-respuesta. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq5.jpg"> donde KRBP en [a.u.] es el valor extraído del procedimiento de ajuste en Eq. 4, y max (mCerulean promediado) es la señal mCerulean media máxima [a.u] observada para la cepa actual. NOTA: La normalización facilita la comparación correcta del efecto regulador entre las cepas al eliminar la dependencia de los niveles máximos de expresión de RBP particulares.</li>
</ol>

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<li>Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+involved+in+post-transcriptional+regulation+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 141(2015).</li>
<li>Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+renaissance+in+RNA+synthetic+biology%3A+new+mechanisms%2C+applications+and+tools+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).</li>
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<li>Bendak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+assessing+the+RNA-binding+potential+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein.</a> Nucleic Acids Research. 40 (14), e105(2012).</li>
<li>Strein, C., Alleaume, A. -M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+assay+for+RNA-binding+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells.</a> RNA. 20 (5), 721-731 (2014).</li>
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<li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li>
<li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li>
<li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2%E2%80%99-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+%28SHAPE-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li>
<li>Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+properties+of+the+coat+protein+from+bacteriophage+GA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).</li>
<li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li>
<li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li>
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<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2%E2%80%99-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+%28SHAPE-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486(2015).</li>
<li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12(2016).</li>
<li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li>
<li>Bernardi, A., Spahr, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método descrito en este artículo facilita la medición cuantitativa in vivo de la afinidad de unión RBP-ARN en células de E. coli. El protocolo es relativamente fácil y se puede llevar a cabo sin el uso de maquinaria sofisticada, y el análisis de datos es sencillo. Además, los resultados se producen inmediatamente, sin el tiempo de espera relativamente largo asociado con los resultados de la secuenciación de próxima generación (NGS).
Una limitación a este método es que sólo funciona...

La regulación post-transcripción basada en proteína de unión al ARN (RBP), caracterizada específicamente de la interacción entre los PBP y el ARN, se ha estudiado extensamente en las últimas décadas. Hay múltiples ejemplos de regulación descendente traslacional en bacterias originadas por PBP que inhiben, o compiten directamente con, la unión ribosoma1,2,3. En el campo de la biología sintética, las interacciones RBP-ARN están emergiendo como una herramienta significativa para el diseño de circuitos genéticos basados en transcripción4,5. Por lo tanto, hay un aumento en la demanda de caracterización de tales interacciones RBP-ARN en un contexto celular.
Los métodos más comunes para estudiar las interacciones proteína-ARN son el ensayo de cambio de movilidad electroforético (EMSA)6, que se limita a entornos in vitro, y varios ensayos desplegables7,incluido el método CLIP8,9 . Si bien estos métodos permiten el descubrimiento de sitios de enlace de ARN novo, sufren de inconvenientes tales como protocolos intensivos en mano de obra y costosas reacciones de secuenciación profunda y pueden requerir un anticuerpo específico para la extracción de RBP. Debido a la naturaleza susceptible del ARN a su entorno, muchos factores pueden afectar las interacciones RBP-ARN, haciendo hincapié en la importancia de interrogar la unión RBP-ARN en el contexto celular. Por ejemplo, nosotros y otros hemos demostrado diferencias significativas entre las estructuras de ARN in vivo e in vitro10,11.
Basándonos en el enfoque de un estudio anterior12, recientemente demostramos10 que al colocar sitios de unión prediseñados para los PBP cápside de los bacteriófagos GA13, MS214, PP715y Q-16 en el región de iniciación de traducción de un ARNm reportero, la expresión del reportero está fuertemente reprimida. Presentamos un método relativamente simple y cuantitativo, basado en este fenómeno de represión, para medir la afinidad entre los PBP y su correspondiente sitio de unión de ARN in vivo.

<table><tbody><tr><td>Sal sódica de ampicilina</td><td>SIGMA</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio (MgSO4)</td><td>ALFA AESAR</td><td>33337</td><td></td></tr><tr><td>48 placas</td><td>Axygen</td><td>P-5ML-48-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 8 carriles</td><td>Axygen</td><td>RESMW8I</td><td></td></tr><tr><td>placas de 96 pocillos</td><td>Axygen</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos para lector de placas</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005029</td><td></td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>NEB</td><td>R0507</td><td></td></tr><tr><td>Secuencias de sitios de unión</td><td>Gen9 Inc. y Twist Bioscience</td><td></td><td>ver Tabla 1</td></tr><tr><td>E. coli células TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Eagl-HF</td><td>NEB</td><td>R3505</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>BIO LAB</td><td>071205</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Incubadora</td><td></td> <td>licónica TECAN</td></tr><tr><td>Kanamycin solfate</td><td>SIGMA</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>KpnI- HF</td><td>NEB</td><td>R0142</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>Sistema robótico de manipulación de líquidos</td><td>TECAN</td><td>EVO 100, MCA 96 canales</td><td></td>Software de</tr><tr><td>análisis Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multipipeta 8 carriles</td><td>Axygen</td><td>BR703710</td><td></td></tr><tr><td>N-butanoil-L-homoserina lactona (C4-HSL)</td><td>tampón caimán</td><td>K40982552 019</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Industrias Biológicas</td><td>020235A</td><td></td>Lector de</tr><tr><td>placas</td><td>TECAN</td><td>Infinite F200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Q5 HotStart Polimerasa</td><td>NEB</td><td>M0493</td><td></td></tr><tr><td>RBP seqeunces</td><td>Addgene</td><td>27121 & 40650</td><td>ver Tabla 2</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCL)</td><td>BIO LAB</td><td>190305</td><td></td></tr><tr><td>SV Gel y sistema de limpieza de PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y arn en bacterias

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

En el paso de iniciación de la traducción proteica, el ribosoma se une a la región de iniciación del ARNm. La iniciación de la traducción se puede bloquear mediante la unión de una proteína de unión al ARN (RBP) a la región de iniciación del ARNm, lo que interfiere con la unión ribosoma. En el método presentado, utilizamos este fenómeno de bloqueo para cuantificar la afinidad de unión de los BBP con sus sitios de enlace cognados y no cognados. Para ello, insertamos un sitio de enlace de prueba en la región de iniciación de un ARNm de reportero e inducemos la expresión de la RBP de prueba. En el caso de la unión RBP-RNA, observamos una represión sigmoidal de la expresión del reportero en función de la concentración de RBP. En el caso de la no afinidad o la afinidad muy baja entre el sitio de enlace y la RBP, no se observó una represión significativa. El método se lleva a cabo en células bacterianas vivas, y no requiere maquinaria costosa o sofisticada. Es útil para cuantificar y comparar entre las afinidades de unión de diferentes PBP que son funcionales en bacterias a un conjunto de sitios de unión diseñados. Este método puede ser inapropiado para sitios de enlace con alta complejidad estructural. Esto se debe a la posibilidad de represión de la iniciación ribosomal por compleja estructura de ARNm en ausencia de RBP, lo que resultaría en una expresión genética de reportero basal más baja, y por lo tanto una represión de reportero menos observable sobre la vinculación de la RBP.

El método presentado utiliza la competencia entre una RBP y el ribosoma para la unión a la molécula de ARNm (Figura1). Esta competencia se refleja en la disminución de los niveles de mCherry en función del aumento de la producción de RBP-mCerulean, debido al aumento de las concentraciones de inductor. En el caso del aumento de la fluorescencia de la macurrulenta, sin cambios significativos en el mCherry, se deduce la falta de unión RBP. Los resultados represe...

En este método, cuantificamos la afinidad de unión de proteínas de unión al ARN (RBP) a sitios de unión cognados y no cognados utilizando un ensayo de reportero simple, vivo y en células bacterianas. El ensayo se basa en la represión de un gen reportero.

Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

La caracterización de la unión a proteínas al ARN in vivo sigue siendo un desafío importante debido a la naturaleza compleja del ARN y a los muchos factores que afectan su interacción con las proteínas. La proteína de unión al ARN o la afinidad RBP-ARN se mide dentro de las células bacterianas vivas. Dado que el entorno celular afecta tanto a la estructura del ARN como a la unión resultante al RBP-ARN, medir la afinidad in vivo es crucial para comprender tales interacciones en sistemas naturales.El secreto del éxito está en el diseño de los plásmidos. El diseño debe utilizar varias ondas de delta y evitar la inserción de codones de parada y mutaciones de cambio de marco. Comience este protocolo diseñando el casete del sitio de enlace.Cada mini gen contiene un sitio de restricción EagI, 40 bases del extremo final principal del gen de resistencia a la kanamicina, el promotor pLac/Ara, el sitio de unión ribosoma, AUG del gen mCherry, un espaciador, un sitio de unión RBP, 80 bases del extremo final de los cinco genes mCherry y un sitio de restricción de ApaLI. Para aumentar la tasa de éxito del ensayo, diseñe tres casetes de sitio de enlace para cada sitio de enlace con espaciadores que constan de al menos una, dos y tres bases. Digerir dos veces los mini genes y el vector objetivo con EagI HF y ApaLI antes de realizar la purificación de columnas de los resúmenes.Ligar los mini genes digeridos a la columna vertebral del sitio de unión que contiene el resto del gen del reportero mCherry, terminador y un gen de resistencia a la kanamicina. A continuación, transforme la solución de ligadura en Escherichia coli en las 10 células principales. Después de identificar transformantes positivos a través de la secuenciación de Sanger, almacene plásmidos purificados en el formato de 96 pozos a menos 20 grados centígrados.También almacenar las cepas bacterianas como stocks de glicerol en el formato de 96 pozos en menos 80 grados Celsius. Orden personalizado la secuencia RBP requerida que carece de un codón de parada como un mini gen de ADN de doble cadena con sitios de restricción en los extremos. Transforme los plásmidos preparados en células bacterianas químicamente competentes que ya contienen un plásmido mCeruleano RBP.Para ahorrar tiempo, vajilla las células usando un pipeteador de ocho canales en placas de ocho carriles que contienen agar Luria-Bertani con antibióticos relevantes. Las colonias deben aparecer en 16 horas a 37 grados centígrados. Seleccione una sola colonia para cada doble transformador y transfiera a 48 placas de pozo que contengan 1,5 mililitros de LB con antibióticos apropiados.Cultivar las células durante un período de 18 horas a 37 grados Celsius temblando a 250 RPM. Almacene las pernoctaciones como existencias de glicerol a menos 80 grados centígrados en placas de 96 pozos. Por la mañana, programe el robot para calentar 180 microlitros de medio semi-poro o SPM en 96 placas de pozo.Programe el robot para preparar la placa inductor. En una placa limpia de 96 pozos, prepare pozos con SPM que consta de 95%BA y 5%LB. El número de pozos corresponde al número deseado de concentraciones de inductores.Añadir C4-HSL a los pozos en la placa inductor que contendrá la mayor concentración de inductores. A continuación, programe el robot para diluir en serie el medio de cada uno de los pozos de mayor concentración en 23 concentraciones más bajas que van de cero a 218 nanomolares. El volumen de cada dilución del inductor debe ser suficiente para todas las cepas.Para diluir las cepas de la noche, programe el robot para que se diluya por un factor de 10 mezclando 20 microlitros de bacterias con 180 microlitros de SPM en 48 placas de pozo. A continuación, diluir de nuevo por un factor de 10 tomando 20 microlitros de la solución diluida en la placa de tensión pre-preparada adecuada para la medición fluorescente. Ahora programe el robot para añadir el inductor diluido de la placa inductor a las placas de 96 pozos con las cepas diluidas de acuerdo con las concentraciones finales.Agitar las placas de 96 pozos a 37 grados centígrados durante seis horas. Durante ese tiempo, tome medidas de la densidad óptica u OD a 595 nanómetros, así como de la fluorescencia mCherry y mCerulean a través de un lector de placas cada 30 minutos. Para fines de normalización, mida el crecimiento de SPM sin células añadidas.Aquí se muestran parcelas tridimensionales para una cepa positiva. Las gráficas representan los niveles de OD crudos, la fluorescencia mCerulean y la fluorescencia mCherry en función del tiempo y la concentración del inductor. Se calcularon los niveles de expresión de estado estacionario de mCerulean para cada concentración de inductor para las cepas positivas y negativas.La tasa de producción de mCherry también se calculó para cada concentración de inductor para cepas positivas y negativas. La tasa de producción de mCherry se estableció en función de la fluorescencia mceruleana media de más de dos duplicados biológicos para dos cepas. El ajuste KRBP utilizando la fórmula de ajuste se muestra para la tensión positiva que exhibe una respuesta de unión específica.Para la cepa negativa, no se extrajo ningún valor KRBP. Las curvas de respuesta a dosis normalizadas se determinaron para 30 cepas diferentes basadas en dos PBP como 10 sitios de unión en diferentes ubicaciones. Se observan tres tipos de respuestas, alta afinidad, baja afinidad y sin afinidad.Aquí se muestran resultados cuantitativos de KRBP para dos RBP, proteína de recubrimiento MS2 y proteína de recubrimiento PP7 con 10 casetes de sitio de unión diferentes. Las curvas de respuesta a la dosis para la proteína de recubrimiento MS2 con un sitio de unión mutada en cuatro ubicaciones diferentes se muestran aquí para demostrar el efecto del espaciado mutante en la producción de mCherry. Se muestra la secuencia del sitio de enlace mutado probado.Es importante utilizar una técnica estructural como la forma de buscar químicamente la estructura del complejo proteína-ARN y visualizar qué regiones de ARNm se ven afectadas por la unión al ARN. Recientemente, utilizamos esta técnica de una manera de alto rendimiento para medir simultáneamente la afinidad de los RMP a 10.000 sitios de enlace.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este video demuestra la acción capilar radial diferencial del ensayo de ligandos, una técnica para el cribado sistemático de alto rendimiento de proteínas de unión a segundo mensajero de nucleótidos intracelulares. Esta técnica permite la unión directa de los mensajeros a la proteína diana sobreexpresada en el lisado celular, evitando la necesidad de purificación de la proteína.

Acción capilar radial diferencial del ensayo de ligando: una técnica de alto rendimiento para identificar proteínas intracelulares de unión a segundo mensajero de nucleótidos bacterianos

Este video muestra un ensayo in vivo en bacterias para estudiar la interacción de las proteínas de unión al ARN (RBP) con el ARN. Las células bacterianas se transforman con dos construcciones de plásmidos: un plásmido de sitio de unión que codifica un ARNm que contiene un gen indicador fluorescente aguas abajo de un sitio de unión RBP, mientras que un plásmido RBP expresa las proteínas RBP bajo el control de un inductor. Tras el aumento mediado por inductores en la producción de RBP, los RBP se...

Ensayo de represión de genes reporteros para estudiar la regulación traslacional de un gen diana

Este video muestra un ensayo de extracción de ARN in vitro para identificar proteínas de unión a ARN (RBP), que interactúan con las secuencias de elementos ricos en adenilato-uridilato (ARE) en el ARNm. Las RBP diana de un lisado celular se mezclan con una sonda de ARN para formar complejos de ARN-proteína. Los complejos se aíslan mediante purificación por afinidad utilizando la afinidad de la marca de destiobiotina de la sonda de ARN a una perla magnética marcada con estreptavidina.

Ensayo de arn-proteína para aislar proteínas de unión a ARN mediante extracción por afinidad

En este video, describimos la evolución sistemática de ligandos mediante el método de enriquecimiento exponencial (SELEX) para identificar secuencias específicas de unión a ARN para una proteína diana de interés. La proteína se incuba con un gran grupo de secuencias de ARN aleatorias, y las secuencias de ARN de unión a proteínas se aíslan, se amplifican por PCR y se secuencian para identificar sus sitios de unión a proteínas.

Ensayo de unión in vitro basado en SELEX para identificar interacciones ARN-proteína

Un conjunto de ensayos colorimétricos se describe para la proteína rápidamente distintivo, ARN, ADN, y ducing re-azúcares en muestras de biomoléculas potencialmente heterogéneos.

Rapid ensayos colorimétricos para distinguir cualitativamente ARN y ADN en muestras Biomolecular

Desarrollamos una unión a ADN, ensayo basado en ELISA cuantitativo para medir las interacciones de los factores de transcripción con el ADN. Alta especificidad para la proteína RUNX2 se logró con un oligonucleótido de ADN consenso de reconocimiento y el anticuerpo monoclonal específico. Detección colorimétrica con una reacción anticuerpo-enzima-sustrato acoplado se monitorizó en tiempo real.

Un ensayo cuantitativo para estudiar proteínas: DNA Interacciones, reguladores Descubra transcripcional de la expresión génica, e identificar agentes antitumoral

Aquí, presentamos protocolos para cribar y caracterizar rápidamente la actividad antimicrobiana de las enzimas. El ensayo de difusión de microportaobjetos y el ensayo de liberación de colorante utilizan sustratos bacterianos objetivo para la evaluación cualitativa y cuantitativa de la actividad enzimática.

Los ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección y caracterización de proteínas de antimicrobianos

Las proteínas que se unen a secuencias específicas de RNA desempeñan papeles críticos en la expresión génica. Caracterización detallada de estos sitios de Unión es crucial para nuestra comprensión de la regulación génica. Aquí, se describe un enfoque solo paso para la mutagénesis de la saturación de los sitios de unión a proteínas en el ARN. Este enfoque es relevante para todos los sitios de unión a proteínas en el ARN.

Un enfoque de mutagénesis de saturación novela: Solo paso caracterización de sitios en el ARN usando fosforotioatos de unión de proteína reguladora

El ensayo Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) se puede utilizar para identificar pequeñas proteínas de unión a ligandos de un organismo mediante el uso de una biblioteca ORFeome.

Identificación de las proteínas de unión de pequeños ligandos con la acción capilar radial diferencial del ensayo de ligandos (DRaCALA)

Aquí, describimos un método para la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente utilizando un conjunto de vectores compatibles, seguido de las técnicas convencionales de pulldown para estudiar complejos de proteínas que no pueden ensamblarse in vitro.

Ensayo pulldown junto con coexpresión en células bacterianas como una herramienta eficiente en el tiempo para probar interacciones desafiantes proteína-proteína

Aquí, presentamos un método in vitro optimizado para descubrir, cuantificar y validar interactores de proteínas de secuencias específicas de ARN, utilizando extracto de proteína total de células humanas, perlas de estreptavidina recubiertas con ARN biotinilado y análisis de espectrometría de masas.

Un análisis extraíble cuantitativo optimizado de proteínas de unión al ARN utilizando ARN biotinilado corto

Aprende a cuantificar la unión de proteínas de unión a ARN en células bacterianas vivas mediante un ensayo de represión de gen reportero. Este método permite medir afinidades específicas y comprender interacciones proteína-ARN in vivo.

Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias

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