Preparación de la médula ósea entera para el análisis de citometría de masa de células de linaje neutrófilo

Este protocolo de citometría de masas preserva la integridad de toda la médula ósea, permitiendo el rescate de la información que se perdió durante la preparación convencional de la muestra para el análisis de células poco estudiadas. Este protocolo de aislamiento de médula ósea rápido y sin esfuerzo facilita la adquisición de poblaciones viables de células mieloides de corta duración, como subconjuntos raros de linaje de neutrófilos. El uso de la citometría de masas para identificar previamente las células inmunitarias apreciadas, como las células de linaje de neutrófilos, puede tener amplias implicaciones para una amplia variedad de enfermedades.

Este protocolo preserva la integridad de las células mieloides de corta duración que están presentes en la médula ósea y se pueden aplicar fácilmente a otros tipos de tejido como el tumor sólido. Simplificamos al protocolo para que sea lo más fácil de usar posible, pero como en todos los estudios biológicos puede necesitar algunas corridas de práctica para manejar. Cuando estés haciendo esto la primera vez, puedes preparar todos tus reactivos primero y luego seguir estrictamente el protocolo.

Si experimenta algún problema, puede conectarse a CyTOForum y hablar con otros usuarios de CyTOF que pueden ayudar a solucionar problemas. Para la preparación biológica de muestras, los trucos simples pueden hacer una gran diferencia con el resultado final. Una demostración visual es mucho más fácil para un nuevo usuario comprender el protocolo.

Si está haciendo esto por primera vez, puede preparar sus reactivos primero y luego seguir estrictamente el protocolo. Para la cosecha de médula ósea, coloque un ratón C57 negro de seis a 10 semanas en la posición supina sobre una almohadilla quirúrgica estéril y use 70% de etanol para esterilizar el abdomen y las extremidades posteriores. Usa un par de tijeras quirúrgicas diseccionando para abrir la cavidad abdominal y extraer la piel para exponer las extremidades posteriores.

Usando un par de fórceps de apósito con puntas contundentes, sostenga la tibia del ratón justo debajo del tobillo y use un par de fórceps de apósito curvos para estabilizar la tibia por debajo de los fórceps de apósito con puntas contundentes. Usa los fórceps de apósito con puntas contundentes para romper la tibia y extraer el músculo para exponer el hueso. Antes de colocar la tibia en PBS frío, mueva los fórceps de apósito curvos estabilizadores al fémur y deslice los fórceps de apósito con punta contundente por debajo de la articulación de la rodilla para sostener la rótula.

Tire suavemente hacia arriba para dislocar la rótula y retire el músculo de la rótula para exponer el fémur. Sostenga el fémur expuesto por los fórceps de apósito curvo y use tijeras quirúrgicas para cortar el fémur de la parte inferior del hueso. A continuación, coloque el fémur en PBS.

A continuación, utilice una aguja de calibre 18 para perforar un agujero en un tubo de micro centrífuga de 0,5 mililitros y coloque ambos huesos en el tubo con los extremos abiertos de los huesos hacia abajo hacia el agujero. Coloque el tubo de 0,5 mililitros en un tubo de micro centrífuga de 1,7 mililitros y gire los tubos de doble capa en una micro centrífuga. Al final de la centrifugación, confirme que la médula ósea se ha extraído en la parte inferior del tubo.

Para manchar las células de la médula ósea para la citometría de masas, suspenda la médula ósea en un mililitro de tóntina de lyis de células sanguíneas rojas durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, recoger las células por centrifugación y re suspender el pellet en un mililitro de PBS frío. Filtrar las células a través de un colador de 70 micrómetros en un tubo cónico de 15 mililitros y lavar las células con nueve mililitros de PBS fresco y frío.

Re suspenda el gránulo de células de médula ósea en 10 mililitros de PBS fresco y frío para contar y transferir una cinco veces 10 a la sexta célula alícuota en un nuevo tubo de 15 mililitros. Recoger las células por centrifugación y re suspender las células en un mililitro de tampón de tinción de citometría de masa, complementado con 125 cisplatino nanomolar. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, lave las células en cuatro mililitros de tampón de citometría de masa fresca.

Re suspenda el pellet en 50 microlitros de la solución de bloqueo de receptores FC. Después de 10 minutos a cuatro grados centígrados, agregue 50 microlitros del cóctel de anticuerpos de interés para las células y pipetee suavemente para mezclar. La temperatura en diferentes pasos de incubación es muy importante para preservar la viabilidad de las células de la médula ósea.

Después de 30 minutos a cuatro grados centígrados, lave las células dos veces en dos mililitros de tampón de citometría de masa fresca por lavado antes de volver a suspender las células en un mililitro de 1,6% de formaldehído recién preparado durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, recoger las células por centrifugación y re suspender el pellet en un mililitro de tampón fijo de perm complementado con 125 solución de intercalación nanomolar para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados. Antes de analizar las células por citometría de masas, vortice suavemente y centrifugar la suspensión celular antes de lavar las células en dos mililitros de tampón de tinción de citometría de masa fresca.

A continuación, lave las células dos veces en un mililitro de agua destilada por lavado, aspirando cuidadosamente el sobrenadante después del segundo lavado antes de volver a suspender las células en una de una por 10 a las sextas células por mililitro de concentración de tampón de citometría de masa para el análisis de citometría de masas. En esta gráfica de incrustación de vecino estocástico distribuido en T, las celdas a través de varios tejidos de ratón se agrupaban en subconjuntos en función de la similitud de sus perfiles de expresión de marcador de superficie medidos por un panel de citometría de masa de 33 parámetros. Las celdas con propiedades más similares se agrupaban automáticamente en función de la expresión de estos marcadores en cada celda.

Usando este método, se conservó la integridad de toda la médula ósea, lo que llevó al descubrimiento de una población celular previamente desconocida que co-expresa neutrophil y células hematopoyéticas y células progenitoras firman marcadores de superficie. Esta población celular, que se omitió anteriormente en estudios de progenitores mieloides, debido al agotamiento positivo de células Ly6G, exhibe un patrón distinto de expresión de marcador de superficie. Más importante aún, estos datos condujeron al descubrimiento de un pequeño subconjunto del clúster celular positivo Ly6G que no expresa Ly6G, pero se agruparon estrechamente a las células positivas Ly6G CD117, lo que sugiere la similitud de estas células con el linaje de neutrófilos basado en la expresión de los 33 marcadores de superficie utilizados en este experimento de citometría de masas.

A continuación, se podría construir un panel de clasificación de celdas activado por florescencia de 13 colores, lo que permite el aislamiento de los progenitores de neutrófilos por citometría de flujo para ensayos funcionales posteriores. Es importante realizar el procedimiento de aislamiento de la médula ósea lo más rápido posible y mantener las células en cuatro grados Celsius durante el procedimiento de tinción.