Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para el aislamiento de ARN de células endoteliales in vivo

Hola, soy Bin Ren, soy profesor asociado de cirugía e ingeniería biomédica en la Universidad de Alabama en la Escuela de Medicina de Birmingham. Nuestro laboratorio está interesado en la biobequia celular endotelial angiogénesis acuogénesis en el contexto de estas enfermedades cardiovasculares comunes y cánceres. Una de nuestras investigaciones se centra en la regulación epigenética y de transcripción de la transdiferenciación y la angiogénesis de células endoteliales.

Para entender los mecanismos transcripcionales de la angiogénesis, hemos establecido líneas de ratón de ingeniería transgénicas, en las que no sólo hemos eliminado un genógeno específico asociado con la angiogénesis en las células endoteliales, sino que una sonda GFP mejorada será etiquetada genéticamente en un ribosoma de células endoteliales nativas. De esta manera, podemos aislar y purificar bucles de ARN mensajero asociado de células endoteliales en diferentes órganos tisulares directamente en animales transgénicos. A continuación, podemos utilizar el ARN mensajero purificado para el análisis posterior de las transcripciones y el transcriptoma.

Mediante la secuenciación de ARN y la PCR en frío en tiempo real. En este video, mis estudiantes Patrick Moran y Jordan Palmer y los técnicos de investigación Nicholas Barnekow y Rong Yuan le mostrarán un enfoque genotipado de ratones transgénicos y el ARN mensajero aspirador directamente desde el endotelial en los animales transgénicos. El genotipado es un preliminar importante en este protocolo para asegurar que el hielo tenga la etiqueta GFP en los ribosomas de las células endoteliales.

Dado que todos los pasos de aislamiento de ARNi aguas abajo dependen de la presencia de ribosomas etiquetados con GFP, es esencial determinar el genotipo antes de comenzar el experimento. Antes de comenzar el aislamiento de ARN, se deben completar varios pasos preparatorios. Estos incluyen la preparación del tampón y la unión del anticuerpo anti-GFP a las perlas de la proteína G dina.

Los buffers pueden durar hasta un mes a cuatro grados Celsius y las perlas unidas a anticuerpos pueden durar hasta una semana a cuatro grados centígrados. Así que tenga en cuenta estas limitaciones al planificar su experimento. El uso de un homogeneizador accionado molar es una excelente manera de aumentar el rendimiento del ARN.

Asegúrese de utilizar ajustes y duraciones de frecuencia más bajos para reducir la degradación del ARN. Como se mencionó anteriormente, el genotipado es un paso preliminar importante en el protocolo de prueba. Asegurar que los ratones cuyo ARN debe aislarse utilizando la técnica TRAP sean positivos para el gen TRAP, al menos heterocigotos, pero lo ideal es homocigoto para el gen TRAP es un paso importante porque asegurarse de que la etiqueta GFP está en el ribosoma es esencial para tirar hacia abajo utilizando la reacción de anticuerpos antigenios y las perlas anti-GFP que habrá preparado antes de comenzar el experimento.

Aísle los tejidos deseados del ratón y colóquelos inmediatamente en un PBS helado con una solución de ciclohexamida de 100 microgramos por mililitro. Esto garantiza que la traducción se detenga y que el transcriptoma será una representación precisa del ratón antes de la eutanasia. Utilice un homogeneizador accionado por motor para homogeneizar el tejido en una suspensión celular.

Los ajustes de temporización y frecuencia ideales tendrán que ser determinados por el laboratorio individual en función del homogeneizador accionado por motor en particular que va a utilizar. El uso de una configuración de frecuencia demasiado alta puede provocar la degradación del ARN e interrumpir el resto del protocolo. Suspenda el pellet celular dentro del búfer de lelisis que debería haber preparado antes de comenzar el experimento.

Asegúrese de homogeneizar aún más esta mezcla para garantizar una homogeneización adecuada antes de proceder con el resto del protocolo. Centrifugar el homogeneizar durante 10 minutos a 2.000 veces G en una centrífuga de cuatro grados Celsius. Esto va a peletizar los núcleos y grandes desechos celulares que pueden interferir con la reacción de inmunoprecipitación aguas abajo.

Añadir lípidos DHPC y CA-630 al sobrenadante desde el paso de centrifugación anterior. Estos lípidos ayudarán a separar las fases de la proteína de los otros componentes intracelulares. Coloque la suspensión sobre hielo durante cinco minutos y dé la vuelta.

Centrifugar el izado durante 10 minutos a 13.000 veces G para peletizar cualquier material soluble. Mantenga el 15% del aclarado claro para pasos futuros. Agregue las perlas unidas al anticuerpo anti-GFP al sobrenadante de anesado celular e incubar la mezcla a cuatro grados Celsius con rotación de extremo sobre extremo durante 30 minutos.

Aquí es donde los anticuerpos anti-GFP unirán los ribosomas etiquetados por GFP, lo que nos permite aislar aún más el ARN de estos ribosomas. Recoge las perlas en tu rack magnético y lava las cuentas cinco veces usando tu tampón de lavado de polisoma de alta sal que habrás preparado antes de comenzar el aislamiento. Continúe inmediatamente con el siguiente paso en el que colocará las perlas en el búfer RLT.

Centrifugar el izado durante tres minutos a toda velocidad y retirar cuidadosamente el sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo de microfugo. Añadir un volumen de 70%etanol al izado despejado y mezclar inmediatamente por pipeteo. Proceda inmediatamente al siguiente paso en el que transferirá hasta 700 microlitros de la muestra, incluyendo cualquier precipitado que pueda haberse formado, a una columna de centrifugado colocada en un tubo de recogida de dos mililitros.

Centrifugar el izado durante 15 segundos a más de 8.000 veces G para lavar la membrana de la columna de centrifugado. Deseche el flujo a través y proceda al siguiente paso. Agregue 350 microlitros de búfer RW1 a la columna de giro.

Centrifugar durante 15 segundos a más de 8.000 veces G para lavar la membrana de la columna de centrifugado y descartar el flujo a través. Repita este paso utilizando otros 350 microlitros de búfer RW1 antes de continuar con el paso siguiente. Agregue 500 microlitros de TAMPón de búfer RPE a la columna de giro.

Centrifugar durante 15 segundos a más de 8.000 veces G para lavar la membrana de la columna de centrifugado. Deseche el flujo a través y proceda a repetir este paso agregando otros 500 microlitros de buffer RPE a la columna de giro. Esta vez, centrifugar durante dos minutos a más de 8.000 veces G para lavar la membrana de la columna de centrifugado.

Deseche el flujo y coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recolección de dos mililitros y proceda a centrifugar a toda velocidad durante un minuto para eliminar cualquier búfer residual que pueda estar presente en la columna de centrifugado. Deseche el flujo y coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recogida de 1,5 mililitros. Proceda a añadir de 30 a 50 microlitros de agua libre RNase directamente a la membrana de la columna de centrifugado.

Centrifugar durante un minuto a más de 8.000 veces G para eluir el ARN de la membrana de la columna de centrifugado. En este punto, el ARN se disuelve en agua libre de RNase y puede almacenarse a menos 80 grados centígrados durante un año. Proceda a cuantificar y comprobar la pureza del ARN que ha aislado utilizando un espectrofotómetro.

Usted está buscando un pico en 260 nanómetros, que es ácido nucleico, incluyendo ARN, absorbe al máximo. La cantidad se representa en la parte inferior derecha de la imagen en nanogramos por microlitro. La calidad se puede inferir por la relación 260 230 que se muestra un artículo por encima de la cantidad en la parte inferior derecha de la pantalla.

Nuestro enfoque mostró bajos rendimientos de ARN, especialmente cuando purificamos el ARNm de los tejidos cardíacos o de tejidos previamente congelados. Por lo tanto, tenemos que optar por las condiciones para aumentar los rendimientos. Sin embargo, observamos en ratones con deficiencia de CD-36 específicos de la CE, el nivel de ephrina B2 y DLL4 aumentó significativamente tanto en endotelia pulmonar como cardíaca, en comparación con el control.

Estos resultados fueron consistentes con nuestros estudios in vitro anteriores, lo que sugiere que la calidad del ARN es suficiente para el análisis posterior. El rendimiento era bajo debido a las estrictas condiciones en nuestro espacio de trabajo. Para superar esta limitación, es fundamental establecer una zona de trabajo libre de RNase y descontaminar superficies de trabajo y equipos que pueden contaminarse con RNase y cambiar los guantes con frecuencia con el fin de extraer ARN de calidad y aumentar los rendimientos.

También es fundamental encontrar concentraciones adecuadas de anticuerpos GFP en la matriz de afinidad y utilizar concentraciones adecuadas de inhibidor de la RNase en el tampón de la lesis tisular y utilizar material plástico libre de RNase y reactivos para la extracción de ARN de ribosomas endoteliales de los tejidos dirigidos.