Biopsia y vitrificación de blastocisto humano

Tanto la biopsia de blastocisto como la vitrificación han sido una revolución en la FIV, la fecundación in vitro, permitiendo a los embrólogos de todo el mundo realizar pruebas genéticas de preimplantación en embriones humanos con un riesgo mínimo para el embrión. La biopsia de trofectodermo ha permitido la recuperación de unas siete células de un embrión completamente crecido, lo que permite un análisis genético sólido aguas abajo. Además, hasta la fecha no se ha demostrado ningún impacto en este enfoque.

La eficiencia clínica de este flujo de trabajo permite a los pacientes con afecciones monogénicas y a todos aquellos pacientes con mayor riesgo de anomalías cromosómicas dentro de su blastocisto beneficiarse de las pruebas genéticas preimplantacionales. Todavía hay espacio para mejorar las estrategias actuales de selección de embriones. Por ejemplo, el perfil miRnomico y proteómico representa opciones intrigantes para complementar las pruebas genéticas preimplantacionales en una sola biopsia de trofctodermo.

Los operadores sin experiencia a menudo tienen problemas para abrir y penetrar en la zona pellucida. Es sólo una cuestión de concentración. El blastocisto, el objetivo láser y las pipetas deben estar en el mismo plano focal.

Después de etiquetar la placa de biopsia con los detalles del paciente, con un marcador permanente y no tóxico, numera cada gota de 10 microlitros del medio con búfer HEPES con el embrión y el ciclo ID.Usando una pipeta de extracción de 300 micrómetros, transfiera un blastocisto viable y completamente expandido a la primera gota de la placa de biopsia y enjuague la gota para eliminar el exceso de calor medio, antes de mover el blastocisto en la segunda gota. Coloque el plato bajo un microscopio invertido y coloque la pipeta de biopsia con un medio de la tercera gota del plato de la biopsia. Bajo un aumento de 20 veces, oriente el blastocisto para obtener una visión clara de la masa de la célula interna a las siete en punto, y asegure el embrión en la pipeta de retención.

Concéntrese en la zona pellucida para que tanto las pipetas como el blastocisto estén en el mismo plano focal. Cambie al objetivo láser y coloque el puntero láser en la zona pellucida en el lado opuesto de la masa de la celda interna. Taladre la zona pellucida con dos o tres pulsos láser, y presione suavemente la pipeta de biopsia contra la zona pellucida para permitir que el medio sea soplado a través de la brecha para separar las células del trofoctodermo de la superficie interna.

Cuando el trofectodermo se desprende, entre a través del orificio y aspire de siete a ocho células de trofctodermo en la pipeta de biopsia con succión suave. Mientras aplica una succión moderada para estirar las células diana, mueva ligeramente la pipeta de biopsia hacia atrás y dirija el láser hacia la parte más delgada de las células aspiradas. Dispare de dos a cinco pulsos láser en las uniones entre las células para separar las células diana del cuerpo del embrión.

Cuando el fragmento de trofectoderm se haya separado del blastocisto, suelte el fragmento en la misma gota de biopsia lejos del blastocisto para evitar que el fragmento sea aspirado de nuevo en la pipeta de biopsia. Suelte el blastocisto de la pipeta de sujeción y levante rápidamente ambas pipetas para evitar que el fragmento se pegue a las pipetas. A continuación, imagine el fragmento biopsiado con fines de control de calidad.

Cuando todos los blastocistos hayan sido biopsiados como se acaba de demostrar, mueva la placa de biopsia de vuelta a la capucha de flujo laminar y etiquete el plato de cultivo post-biopsia con la identificación de la pareja y cada gota con el embrión y los ID de ciclo. En presencia de un testigo, enjuague el blastocisto en medio de FIV limpio y mueva el blastocisto a su caída correspondiente en la placa posterior a la biopsia. A continuación, coloque la placa posterior a la biopsia en un Celsius de 37 grados, 6% de dióxido de carbono y una incubadora de oxígeno al 5%.

En presencia del testigo y dentro de una campana de flujo laminar a temperatura ambiente, etiquete los tubos PCR con un marcador permanente no tóxico. Etiquete la tapa de un plato de cultivo de tubos de 60 x 15 milímetros con los ID de embrion biopsiados y agregue dos gotas de 10 microlitros de solución de lavado de biopsia al plato. Preparar una pipeta de extracción de 140 micrómetros con solución de lavado de biopsia de la segunda gota de la placa de tubo bajo el microscopio estéreo para visualizar los fragmentos de trofctodermo.

Libere suavemente alguna solución de lavado de biopsia sobre el fragmento de trofectodermo y cargue el fragmento en la pipeta de desmontaje. Mueva el fragmento a la segunda gota de solución de lavado de biopsia y enjuague cuidadosamente el tejido de dos a tres veces. Transfiera el fragmento de trofectodermo a la parte inferior del tubo PCR debidamente etiquetado con solución de carga, teniendo cuidado de evitar tocar las paredes del tubo con la punta de la pipeta de desmontaje.

Cuando todos los fragmentos se hayan añadido a sus tubos, gire todos los tubos en una mini centrífuga durante unos segundos para sedimentar los fragmentos. A continuación, almacene las muestras a menos 20 grados centígrados hasta que se envíen al laboratorio genético de referencia para su análisis. Dentro de los 30 minutos de la biopsia de trofectoderm, etiquete una placa de vitrificación con los detalles del paciente y las identificaciones de los blastocistos que deben ser vitrificadas.

Usando crioetiquetas especiales resistentes a la temperatura fría, etiquete los soportes de vitrificación con el nombre y apellido del paciente, la identificación de la pareja, la identificación del embrión que se cargará en él y la fecha del procedimiento. A temperatura ambiente, dispensar 300 microlitros de solución de equilibrio para cada blastocisto que se vitrifique y, en presencia de un testigo, utilizar una pipeta de desmontaje de 300 micrómetros para mover el blastocisto en un volumen de solución de equilibrio. Deje el blastocisto en la solución de equilibrio durante 13 a 15 minutos.

Después de una contracción inicial del volumen, se observará una re-expansión gradual. Al final del equilibrio, añadir 300 microlitros de solución de vitrificación al segundo pocóculo de la placa de vitrificación y transferir el blastocisto completamente expandido a la solución de vitrificación durante un minuto. Al final de la incubación, enjuague el blastocisto para diluir la solución de equilibrio y, en presencia de un testigo, cargue el blastocisto en el soporte de vitrificación.

Eliminar el exceso de solución de vitrificación. Una película sutil de solución debe rodear el blastocisto. Sumerja el soporte de vitrificación en nitrógeno líquido y mueva vigorosamente el soporte para reducir el riesgo de formación de burbujas cerca de la muestra.

A continuación, coloque la tapa protectora en el soporte mientras el soporte de vitrificación todavía está sumergido en nitrógeno líquido. De los 1.544 procedimientos de biopsia de trofoctoderm realizados durante este período representativo de dos años, entre uno y cuatro blastocistos fueron biopsiados por procedimiento durante entre tres a 22 minutos por procedimiento. En estas gráficas, se muestra el tiempo medio de la biopsia para cada operador a lo largo de los trimestres del estudio, con un valor global medio de 8,24 minutos.

Es útil adquirir una imagen de cada fragmento biopsiado con fines de control de calidad para evaluar si la causa de los diagnósticos no concluyentes era imputable a la dimensión y/o calidad del fragmento, al tubo o a algunos problemas en el procesamiento de la muestra en el laboratorio genético. En este estudio, 572 blastocistos euploides fueron calentados para someterse a una transferencia de embriones después de un diagnóstico de euploidía. Todos los blastocistos vitrificados en 30 minutos, con el 2,4% de los blastocistos no se re-expandiendo entre 31 y 90 minutos y 4.9% no se re-expandió más allá de 90 minutos desde el recalentamiento.

Especialmente para la mala calidad y / o día siete blastocistos, el tiempo entre la biopsia y la vitrificación parece crucial para lograr la re-expansión después del calentamiento. Tenga cuidado de enfocar antes de abrir la zona pellucida al exponer la unión entre la célula del trofctoderm y el disparo, y tenga cuidado también de evitar la re-expansión del blastocisto antes de la vitrificación. Existen otros dos enfoques de biopsia de blastocisto, ambos que implican la apertura de zona pellucida y la espera de un arco espontáneo de las células del trofctodermo.

Estos enfoques son más fáciles, pero requieren más manipulaciones y consumen más tiempo. La eficacia de este flujo de trabajo permite la implementación de tecnologías moleculares en FIV con el fin de tratar de seleccionar el blastocisto con la mayor probabilidad de implantarse antes de la transferencia de embriones. Recuerde no utilizar ningún dispositivo o solución que pueda ser tóxico para los embriones y prevenir la contaminación del ADN mediante el uso de materiales libres de ADN.