Name: Biopsia y vitrificación de blastocisto humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprende la biopsia y vitrificación de blastocisto humano para diagnóstico genético preimplantacional con mínimo riesgo embrionario. Este método permite obtener células de trophectodermo para análisis genético robusto.

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AG y RM recopilaron los datos y redactaron el manuscrito. DC analizó los datos, redactó los resultados representativos, realizó las estadísticas y revisó el manuscrito. FMU y LR proporcionaron una discusión crítica de los resultados y de todo el manuscrito.

El protocolo para la biopsia de blastocisto humano, aquí descrito, sigue las directrices del Comité Ético de Investigación Humana de G.EN.E.R.A.
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para conocer los materiales necesarios. El material adicional requerido incluye calzado y atuendo de laboratorio, mascarilla quirúrgica, cubierta capilar, guantes quirúrgicos, un marcador permanente no tóxico, fórceps y desinfectante. El uso de bata quirúrgica, guantes quirúrgicos desechables, máscara facial, cubierta del cabello es obligatorio para prevenir el riesgo de contaminación. Todas las áreas de trabajo, así como el equipo involucrado en el proceso, deben limpiarse a fondo con desinfectante de laboratorio (por ejemplo, Oosafe) antes de iniciar cualquier procedimiento. Todos los consumibles y medios utilizados deben ser estériles y envasados o alícuotas individualmente. Se sugiere utilizar una estación de trabajo dedicada para biopsia y tubos y limitar el acceso de la zona sólo a los operadores involucrados en el procedimiento (embriólogo y testigo).
1. Preparación el día antes del procedimiento de biopsia
<ol><li>
Prepare el plato de cultivo posterior a la biopsia.
	<ol>
<li>Colocar 6 gotas de medio de cultivo de FIV de 20 l (Tablade materiales)en un plato de cultivo de FIV y superponer con 6 ml de aceite mineral precalentado para el cultivo embrionario (Tablade materiales).</li>
		<li>Agregue otros 10 l de medio de cultivo de FIV a cada gota. Incubar durante la noche a 37oC en una atmósfera controlada (5% O2, 6% CO2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare una placa de 4 pocillos de FIV para enrredar el blastocisto después de la biopsia.
	<ol>
<li>Colocar 600 l de medio de cultivo de FIV en los dos primeros pozos y superponer con 300 l de aceite mineral precalentado para el cultivo embrionario.</li>
		<li>Incubar durante la noche a 37oC en una atmósfera controlada (5% O2, 6% CO2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dispensar 1,5 l de solución de carga (Tablade materiales)en cada tubo de PCR que se utilizará para tubos de células TE, girarlo y mantenerlo a 4 oC.</li>
</ol>2. Preparación el día del procedimiento de biopsia
<ol><li>
Prepare el plato de la biopsia.
	<ol>
<li>Colocar 3 gotas de medio tampón HEPES de 10 ol (complementado con albúmina sérica humana) (Tablade materiales)en una fila en un plato de cultivo de FIV.</li>
		<li>Repita el paso 1.1.1 según el número de blastocistos disponibles (hasta 4 blastocistos por plato) y superponga con 6 ml de aceite mineral precalentado para el cultivo embrionario.</li>
		<li>Incubar el plato a 37 oC durante al menos 1 h antes de realizar el procedimiento de biopsia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Selección y calificación de blastocistos
<ol><li>
Calificar el blastocisto según su expansión y la apariencia morfológica de ICM y TE (Figura1). NOTA: Los criterios de calificación han sido adaptados de Gardner y Schoolcraft15 y descritos previamente por Capalbo et al. y Cimadomo et al.4,11.<ol>
<li>Defina el tamaño y el grado de expansión como: A para un blastocisto completamente rayado, B para un blastocisto de eclosión, C para un blastocisto completamente expandido y D para un blastocisto no expandido (estos embriones se biopsian solo si no se expandieron más hasta el día 7).</li>
		<li>Definir grado ICM: 1 para ICM notable con varias células estrictamente empaquetadas; 2 para discernible con varias células pero aproximadamente embaladas; 3 para difícil de distinguir con muy pocas células de baja calidad.</li>
		<li>Definir el grado TE de la siguiente manera: 1 para epitelio bien organizado con varias células; 2 para epitelio suelto con pocas células; 3 para pocas y/o grandes células de baja calidad.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Biopsia de trofhectoderm
<ol><li>Realizar una biopsia de TE en todos los blastocistos completamente expandidos viables (preferiblemente grado C para el tamaño y la expansión).</li>
	<li>Establezca pipetas de sujeción y biopsia para cada procedimiento de biopsia. Las recomendaciones para la pipeta de biopsia son las siguientes: diámetro interno de 30 m, ángulo de curvatura de 35o, punta de distancia de 0,75 mm para doblar.</li>
	<li>Etiquete el plato de biopsia con los detalles del paciente (nombre y apellidos de la mujer, fecha de nacimiento e identificación) y luego numera cada gota con embriones e identificaciones de ciclo. Utilice un marcador permanente no tóxico.</li>
	<li>Transfiera el blastocisto con una pipeta de decapado de 300 m a la primera gota de la placa de biopsia y enjuáguelo para eliminar el exceso de medio de cultivo. A continuación, mueva el blastocisto en la segunda gota de la placa de biopsia.</li>
	<li>Mueva el plato al microscopio invertido y prepare la pipeta de biopsia que aspira algún medio de la tercera gota de la placa de biopsia.</li>
	<li>Con aumento 20x, oriente el blastocisto para tener una visión clara del MIC. Cuando se visualice a las 7 en punto (frente al área que se dirigirá para eliminar las células TE), fije el embrión en la pipeta de retención (Figura2a).</li>
	<li>Concéntrese en la zona pellucida y compruebe que tanto las pipetas como el blastocisto están en el mismo plano focal.</li>
	<li>Cambie al objetivo láser (tiempo de pulso 0,3 ms, 6,5 m) y coloque el puntero láser en la zona pellucida en el lado opuesto de ICM. Taladre la zona pellucida a través de 2 x 3 pulsos láser (Figura2b).</li>
	<li>Presione suavemente la pipeta de biopsia contra la zona pellucida y sople algún medio a través de la brecha para separar las células TE de su superficie interna y acelerar el colapso del blastocisto (Figura2c).</li>
	<li>Una vez que el TE se separa (Figura2d), entrar a través del agujero (si es necesario, hacerlo más ancho con un último pulso láser) y aspirar algunas células TE (idealmente 7-813,16) en la pipeta con succión suave (Figura2e).</li>
	<li>Mueva ligeramente la pipeta de biopsia hacia atrás mientras aplica una succión moderada para estirar las células diana (Figura2f).</li>
	<li>Dirija el láser hacia la parte más delgada de las células aspiradas y dispare 2 x 5 pulsos láser en las uniones entre las células para separar las células diana del cuerpo del embrión (Figura2g). El tiempo de los pulsos láser y el número de pulsos se pueden ajustar de acuerdo con la calidad del blastocisto; sin embargo, trate de minimizarlos para evitar la lisis celular.</li>
	<li>Después de la separación del fragmento de TE del blastocisto (Figura2h),suéltelo en la misma caída de biopsia lejos del blastocisto. Esto es necesario para evitar que se succionen de nuevo en la pipeta de biopsia (Figura2i).</li>
	<li>Suelte el blastocisto de la pipeta de sujeción y levante rápidamente ambas pipetas para evitar que el fragmento se pegue a ellas.</li>
	<li>Tome una foto del fragmento biopsiado para el control de calidad (Figura 3). NOTA: Si se va a biopsiar más de un blastocisto por procedimiento (hasta cuatro por plato de biopsia), cambie la pipeta de biopsia por una nueva para evitar la contaminación cruzada entre embriones.</li>
	<li>Repita los pasos 4.1 a 4.13.</li>
	<li>Mueva la antena de biopsia de nuevo a la capucha de flujo laminar.</li>
	<li>Etiquete el plato de cultivo post-biopsia con la identificación de la pareja, y cada gota con el embrión y la identificación del ciclo.</li>
	<li>En presencia de un testigo, enjuague el blastocisto en un medio limpio de FIV y, por último, muévalo a su correspondiente gota de la placa post-biopsia.</li>
	<li>Mover la placa post-biopsia a la incubadora en una atmósfera controlada(37 oC, 6% CO 2, 5% O2) hasta la vitrificación. Es aconsejable realizar vitrificación dentro de los 30 minutos del procedimiento de biopsia, para evitar la reexpansión del blastocisto.</li>
</ol>5. Tubos
NOTA: Todo el procedimiento debe llevarse a cabo en presencia de un testigo y en el interior de la campana de flujo laminar a temperatura ambiente. Durante el procedimiento, mantenga los tubos PCR en un estante de tubo frío sobre hielo (Figurasuplementaria 1).
<ol><li>Etiquete los tubos PCR con un marcador permanente no tóxico. NOTA: El etiquetado debe realizarse según lo solicitado por el laboratorio genético. Generalmente, el nombre y apellidodel del paciente (iniciales), la identificación de pareja, el embrión y la identificación del ciclo (por ejemplo: JD 12345 1.2 para el embrión N.1 del 2o ciclo perteneciente a Jane Doe cuya identificación de pareja es 12345). La identificación del embrión debe notificarse también en letras en el cuerpo del tubo.</li>
	<li>Etiquete la tapa de un plato de cultivo de 60 mm x 15 mm (plato de tubo) con los ID de los embriones biopsiados (Figurasuplementaria 1) y prepare dos gotas de 10 ol de solución de lavado de biopsia (Tablade materiales)en ella.</li>
	<li>Prepara la pipeta de desmontaje de 140 m (FiguraSuplementaria 1) con una solución de lavado de biopsia de la segunda gota de la placa de tubo.</li>
	<li>Coloque la antena de biopsia debajo del estereomicroscopio para visualizar fácilmente los fragmentos de TE.</li>
	<li>Suelte suavemente alguna solución de lavado de biopsia sobre el fragmento de TE; luego, cárguelo en la pipeta de desmontaje.</li>
	<li>Mueva el fragmento de TE a la segunda gota de solución de lavado de biopsia en la placa de tubo y enjuáguelo cuidadosamente de 2 a 3 veces.</li>
	<li>Transfiera el fragmento de TE a la parte inferior del tubo PCR (previamente etiquetado después de él) con solución de carga, prestando atención para evitar tocar sus paredes con la punta de la pipeta de desmontaje.</li>
	<li>Repita el procedimiento del paso 5.3 al paso 5.7 para cada fragmento de TE, prestando atención a utilizar un nuevo capilar para cada fragmento de TE.</li>
	<li>Al final del procedimiento de tubería, poner todos los tubos PCR en una mini centrífuga, y girarlos durante unos segundos.</li>
	<li>Almacene las muestras a -20 oC hasta que las envíe al laboratorio genético de referencia para su análisis.</li>
</ol>6. Vitrificación de Blastoquistes
<ol><li>Vitrify congeló blastocistos en un radio de 30 minutos de la biopsia de TE para evitar su reexpansión.</li>
	<li>Etiquete la placa de vitrificación con los detalles de la mujer y los documentos de identificación de los blastocistos que deben ser vitrificados.</li>
	<li>Etiquetar los soportes de vitrificación con el nombre y apellidos de la mujer, el documento de identidad de pareja, el documento de identidad del embrión que se cargará en él, así como la fecha del procedimiento. Se utilizan crioetiquetas especiales que preservan su integridad incluso a muy baja temperatura (-196 oC).</li>
	<li>A temperatura ambiente, dispensar 0,3 ml de solución de equilibrio (ES) (Tablade materiales)para cada blastocisto que se vitrifique.</li>
	<li>En presencia de un testigo, mueva el blastocisto en ES utilizando la pipeta de desmontaje de 300 m.</li>
	<li>Deje el blastocisto en el ES durante 13-15 min. Después de una contracción inicial del volumen, se observará una re-expansión gradual.</li>
	<li>Llene un pequeño estante de enfriamientocon nitrógeno líquido (LN 2) y colóquelo debajo de la campana de flujo laminar.</li>
	<li>Dispensar 300 l de solución de vitrificación (VS) (Tablade materiales)en el segundo pozo. Después de la reexpansión completa del blastocisto, transfiéralo en la solución VS durante 1 min y enjuáguelo para diluir el ES.</li>
	<li>En presencia de un testigo, cargue el blastocisto en el soporte de vitrificación y encárguese de eliminar el exceso de VS. Una película sutil de solución debe rodear el blastocisto.</li>
	<li>Sumergir el soporte de vitrificación en LN2 y moverlo enérgicamente con el fin de reducir el riesgo de formación de burbujas cerca de la muestra.</li>
	<li>Coloque la tapa protectora mientras mantiene el soporte de vitrificación sumergido en el LN2.
</li>
	<li>En presencia de un testigo, mueva el soporte de vitrificación en un tanque de almacenamiento LN2 a largo plazo.</li>
</ol>7. Contracción artificial de blastocistos no biopsiados
<ol><li>
Si no se realiza ninguna biopsia te, colapse artificialmente los blastocistos inmediatamente antes de la vitrificación (Figura4).
	<ol>
<li>Mueva el plato de cultivo de la incubadora al microscopio invertido y concéntrese en el embrión seleccionado.</li>
		<li>Cambie al objetivo láser (pulso preconfigurado: 0,3 ms, 6,5 m), apunte a la zona pellucida en el lado opuesto del MIC y, a continuación, dirija 1–2 pulsos láser a las uniones entre las células TE a una distancia segura del MIC. Los blastocistos deben colapsar en menos de 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proceda con la vitrificación del blastocisto colapsado como se describe en la sección 6.</li>
</ol>8. Calentamiento transferible de blastocisto
<ol><li>El día del ET, prepare la placa ET de 4 pocillos colocando 600 ml de medio de cultivo de FIV preequilibrado para cada pocal. Incubar a 37oC en una atmósfera controlada (5% O2, 6% CO2), mientras se realiza el calentamiento del blastocisto.</li>
	<li>Etiqueta el plato de calentamiento con el nombre y apellido de la mujer, identificación de pareja, identificación del embrión que se calentará en él.</li>
	<li>Dispensar 1 ml de la solución de descongelación (TS) (Tablade materiales)en un plato de un solo pozo de FIV (Figurasuplementaria 1) y calentarla a 37 oC en un termostato durante al menos 1 h antes de iniciar el procedimiento.</li>
	<li>Llene un pequeño soporte de refrigeración con LN2 y colóquelo en la campana de flujo laminar cerca del área de trabajo.</li>
	<li>Antes de iniciar el procedimiento, compruebe la información de blastocisto que se indica en el soporte de vitrificación. Todos los ID deben coincidir con el informe genético y el blastocisto para calentar debe ser elegido entre los transferibles. Se requiere un testigo durante el procedimiento.</li>
	<li>Saque el plato de un solo pozo que contiene TS caliente del termostato y colóquelo en un escenario calentado bajo el estereomicroscopio.</li>
	<li>Tire de la tapa protectora dentro del LN2 usando fórceps.</li>
	<li>Sumérgete rápidamente en la punta del soporte de vitrificación en el TS de 37oC.</li>
	<li>Bajo observación microscópica, mueva suavemente el soporte de vitrificación hasta que el blastocisto se libere de la punta.</li>
	<li>Deje el blastocisto durante un total de 1 min en el TS, prestando atención para mantenerlo en la parte inferior del TS.</li>
	<li>A temperatura ambiente dispensa 200 l de solución de dilución (DS) (Tablade materiales)en el primer pozo de la placa de vitrificación.</li>
	<li>Transfiera el blastocisto a DS y colóquelo en la parte inferior del pozo mientras libera un poco de TS en la parte superior del mismo para crear una especie de gradiente. Déjalo durante 3 min.</li>
	<li>Dispensar 200 l de solución de lavado (WS) en 2 pozos diferentes (WS1 y WS2).</li>
	<li>Transfiera el blastocisto a WS1 y colóquelo en la parte inferior del pozo mientras libera algún medio DS en la parte superior del mismo. A continuación, transfiera el blastocisto a WS2 y déjelo sin perturbaciones durante 1 min.</li>
	<li>Etiquetar la placa ET post-calentamiento con el nombre y apellido de la mujer, identificación de pareja, identificación del embrión que se cultivará en ella.</li>
	<li>En presencia de un testigo, transfiera el blastocisto calentado al medio de cultivo preequilibrado en la placa ET post-calentamiento.</li>
	<li>Enjuague el blastocisto en el primer poceto de la placa ET y colóquelo en el segundo pozo.</li>
	<li>Transfiera el plato de cultivo post-calentamiento a la incubadora en una atmósfera controlada (37 oC, 6% CO2, 5% O2) y escene el blastocisto durante al menos 1,5 horas antes de comprobar su supervivencia y reexpansión. NOTA: La Figura 5 muestra ejemplos de blastocistos degenerados, crio-sobrevividos pero no re-expandidos y crio-sobrevividos y completamente expandidos.</li>
</ol>9. EmbryoTransfer
<ol><li>Para realizar ET, coloque el plato en la etapa calentada de la campana de flujo laminar, para que el embrión sea visible bajo el microscopio con un aumento bajo.</li>
	<li>Tome aproximadamente 0,4 ml de medio de cultivo de FIV. Fije firmemente la punta de la jeringa en el extremo receptor del catéter interno y luego suelte el medio hasta 0,1 ml.</li>
	<li>Aspirar el medio de cultivo hasta observar los embriones que entran en el catéter (cantidad mínima de medios: 10-15 l).</li>
	<li>Coloque el catéter en la caja de plástico y vaya al quirófano y coloque el catéter interno en la guía externa.</li>
	<li>Una vez que haya llegado al útero, empuje el émbolo de la jeringa para liberar el embrión. Suelte muy lentamente el medio hasta que el émbolo esté leyendo 0,1 ml.</li>
	<li>Lleve el catéter de vuelta al laboratorio y compruebe bajo el microscopio que el embrión ha sido transferido.</li>
</ol>

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<li>Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage-stage+biopsy+significantly+impairs+human+embryonic+implantation+potential+while+blastocyst+biopsy+does+not%3A+a+randomized+and+paired+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+births+after+transfer+of+rebiopsy+and+revitrification+of+blastocyst+that+had+%E2%80%9Cno+diagnosis%E2%80%9D+following+trophectoderm+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy.</a> Fertility and Sterility. 106 (3), e164(2016).</li>
<li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+efficacy+of+blastocoel+fluid+and+spent+media+as+sources+of+DNA+for+preimplantation+genetic+testing+in+standard+clinical+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions.</a> Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).</li>
<li>Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+mitochondrial+DNA+in+blastocoele+fluid+and+embryo+culture+medium%3A+evidence+and+potential+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use.</a> Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Sólo los embriólogos experimentados que hayan completado su período de entrenamiento deben realizar tanto la biopsia TE como la vitrificación del blastocisto. Además, se requiere un testigo para monitorear los procedimientos y garantizar una trazabilidad eficiente durante i) los movimientos del blastocisto biopsiado desde la antena de biopsia (FiguraSuplementaria 1) a la antena post-biopsia (FiguraSuplementaria 1 ), a continuación a la placa de vitrificación (Figurasuplementaria ...

El objetivo principal de la embriología humana moderna es maximizar el número de nacimientos vivos por ciclo estimulado y reducir los costos, el tiempo y los esfuerzos para lograr un embarazo. Para lograr este objetivo, se deben emplear enfoques validados para la selección de embriones para identificar embriones reproductivos competentes dentro de una cohorte obtenida durante un ciclo de FIV. Según las últimas pruebas, el cultivo de blastocisto1 combinado con pruebas cromosómicas exhaustivas y transferencia de embriones euploide (ET) calentada vitrificada es el marco más eficiente para aumentar la eficiencia de la FIV2. Claramente, las pruebas de aneuploidía requieren un espécimen embrionario, que en la actualidad se representa principalmente a partir de pocas células recuperadas del trophectoderrm (TE), es decir, la sección del blastocisto que da origen a los anexos embrionarios (por ejemplo, la placenta) durante el embarazo . Más allá del análisis del cariotipo, también se podrían evaluar mutaciones genéticas únicas a partir de una biopsia TE como parte de una estrategia clínica conocida como pruebas genéticas preimplantacionales (PGT; -A para aneuploidías, -SR para reordenamientos cromosómicos estructurales, -M para enfermedades monogénicas). Otros métodos de biopsia de ovocitos/embriones han sido teorizados y adoptados clínicamente a lo largo de las últimas décadas, a saber, biopsia de cuerpos polares y biopsia de blastomero. Sin embargo, su uso se reduce hoy en día, ya que sus inconvenientes procesales (por ejemplo, mayor carga de trabajo y riesgo de impacto reproductivo) y las limitaciones diagnósticas (por ejemplo, cuestiones de análisis de una sola célula) obstaculizan implícitamente un equilibrio suficiente entre los costos, los riesgos y beneficios (para una revisión ver3).
En este artículo, uno de los principales protocolos para la biopsia de TE se describe a fondo junto con los procedimientos posteriores de vitrificación, calentamiento y transferencia requeridos. El flujo de trabajo aquí descrito es ideal para una unidad PGT ocupada.
Como ya ha descrito anteriormente nuestro grupo4,5, el procedimiento implica la apertura secuencial de la zona pellucida de blastocistos completamente expandidos y la eliminación de pocas células TE (en promedio 7-8). En comparación con el método de biopsia de blastocisto basada en el sombreado asistida por láserdeldía 3, este procedimiento podría facilitar el horario diario de una unidad de FIV donde se deben realizar oportunamente procedimientos delicados, como la biopsia de blastocisto y la vitrificación. Tan pronto como el blastocisto alcanza su expansión completa, la biopsia se puede llevar a cabo seleccionando las células TE para extraer, evitando así el riesgo de hernia de la masa celular interna (ICM), lo que de otra manera haría que el procedimiento fuera un reto. En la literatura, también se ha descrito un tercer protocolo de biopsia de blastocisto, que implica la eclosión asistida por láser que se realiza una vez que el embrión ya ha alcanzado la etapa de blastocisto, pocas horas antes del procedimiento5,7. Sin embargo, este enfoque consume más tiempo y se adapta principalmente a las unidades de FIV que están implementando la biopsia TE en manos de operadores con experiencia limitada y en vista de una carga de trabajo diaria moderada-baja.
La inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)8 debe ser una técnica consolidada si se trata de realizar análisis genéticos en ficticia. Del mismo modo, un sistema de cultivo adecuado para cosechar embriones de forma segura en la etapa de blastocisto es crucial para la implementación de la estrategia de biopsia TE. Un número adecuado de incubadoras, así como el uso de baja tensión de oxígeno son requisitos previos clave para este fin, no comprometer la tasa de blastocisto9. Al mismo tiempo, se necesita un programa de criopreservación eficiente para gestionar de forma segura un ciclo de PGT. En la última década, la implementación de la vitrificación ha impulsado las tasas de criosupervivencia embrionaria hasta >99%10,11. Esto proporcionó tiempo suficiente para realizar pruebas genéticas y posponer la transferencia de embriones al siguiente ciclo menstrual, en un endometrio no estimulado y probablemente más receptivo12.
Tanto la biopsia de TE como la vitrificación son tareas exigentes que requieren habilidades estrictas y su eficacia puede variar entre operadores sin experiencia. Por lo tanto, se aboga un período de formación específico antes de permitir que cada operador realice estos procedimientos clínicamente; además, el mantenimiento de las habilidades de los operadores debe evaluarse periódicamente mediante el seguimiento de indicadores clave de rendimiento (KPI) para los procedimientos de criopreservación y biopsia. Cada clínica de FIV debe establecer KPI internos para este fin, que deben aproximarse a los publicados por consorcios internacionales y/o los resultados publicados por los laboratorios de referencia.
La biopsia TE, el calentamiento de la vitrificación y los procedimientos de testimonio son técnicas validadas en nuestra unidad, que se han estandarizado en todos los operadores involucrados según se informó en tres publicaciones anteriores11,13,14 .

<table><tbody><tr><td>EquipmentRack de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>tubos fríos</td><td>Biocision</td><td>XTPCR96</td><td></td></tr><tr><td>Controlador electrónico de pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>710931</td><td></td></tr><tr><td>Flexipet juego de asas ajustables</td><td>Cook</td><td>G18674</td><td>Soporte para stripper</td></tr><tr><td>Gilson Pipetman</td><td>Gilson</td><td>66003</td><td>p20</td></tr><tr><td>FIV Sistema de Testigos Electrónicos</td><td>CooperSurgical Fertility & Soluciones genómicas</td><td>RI Witness Sistema de gestión ART</td>Microscopio invertido Nikon Eclipse TE2000-U Campana de flujo laminar IVF TECH Flujo de aire de grado A Objetivo láser RI Saturn 5 Microinyectores Nikon Narishige NT-88-V3 Mini centrífuga para tubos de PCR Eppendorf <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>CSLQSPIN</td><td>para tubos de PCR de 0,2 mLl</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td>Termostato</td><td>Panasonic</td><td>MCO-5AC-PE</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora trigás</td><td>Panasonic</td><td>MCO-5M-PE</td><td>02/CO2</td></tr><tr><td>Consumibles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de biopsia</td><td>RI</td><td>7-71-30FB35720</td><td>30 &micro; m ID, piso 35 &deg; C</td></tr><tr><td>Cryolock</td><td>Cryolock</td><td>CL-R-CT</td><td></td></tr><tr><td>CSCM completo</td><td>Irvine Scientific</td><td>90165</td><td>Medio de cultivo de FIV suplementado con HSA</td></tr><tr><td>Catéter de transferencia de embriones</td><td>Cook</td><td>G17934</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Flexipet</td><td>Cook</td><td>G26712</td><td>140&micro; m punta de pipeta de extracción</td></tr><tr><td>Flexipet pipeta Cook</td><td></td><td>G46020</td><td>300&micro; m puntas de pipeta de extracción</td></tr><tr><td>Pipeta de sujeción</td><td>RI</td><td>7-71-IH35/20</td><td>30 &micro; m ID, piso 35 &deg; C</td></tr><tr><td>Albúmina de suero humano</td><td>Irvine Scientific</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>FIV Plato de un pocillo</td><td>Aceite mineral de halcón</td><td>353653</td><td></td></tr><tr><td>para el cultivo de embriones</td><td>Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>Medio HTF modificado</td><td>Irvine Scientific</td><td>90126</td><td>Medio tamponado para hepes</td></tr><tr><td>Nuclon Delta Surface</td><td>Thermofisher scientific</td><td>176740</td><td>Plato de FIV 4- placa de pocillos con tapa corredera</td></tr><tr><td>Primaria Plato de cultivo celular</td><td>Corning</td><td>353802</td><td>60 mm x15 mm</td></tr><tr><td>Reproplate</td><td>Kitazato</td><td>83016</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>10ml</td></tr><tr><td>Puntas Gilson desechables estériles</td><td>Eppendorf</td><td>0030 075.021</td><td>200 &micro; L</td></tr><tr><td>Kit de tubos</td><td>Proporcionado por el laboratorio</td><td></td><td>genético Tubos de PCR (0,2 mL), solución de carga, solución de lavado para biopsia</td></tr><tr><td>Medios de vitrificación</td><td>Kitazato</td><td>VT801</td><td>Soluciones de equilibrio y vitrificación</td></tr><tr><td>Medios de calentamiento</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>Soluciones de descongelación y dilución</td></tr></tbody></table>

biopsia y vitrificación de blastocisto humano

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

La biopsia de blastocisto se realiza para obtener un diagnóstico genético fiable durante los ciclos de FIV con pruebas genéticas preimplantacionales. A continuación, el flujo de trabajo ideal implica un protocolo de vitrificación seguro y eficiente, debido al tiempo de respuesta de las técnicas de diagnóstico y para transferir el embrión o embriones seleccionados en un endometrio fisiológico en un siguiente ciclo natural. Un enfoque de biopsia que abarca la apertura secuencial de la zona pellucida y la recuperación de 5-10 células de trophectoderm (idealmente 7-8) limita tanto el número de manipulaciones requeridas como la exposición del embrión a condiciones ambientales subóptimas. Después del entrenamiento adecuado, la técnica fue reproducible entre diferentes operadores en términos de sincronización de la biopsia (8 min, que van 3-22 min en función del número de embriones a biopsia por plato), diagnósticos concluyentes obtenidos (97,5%) y las tasas de nacimientos vivos después de la transferencia de blastocisto euploide vitriloide (>40%). La tasa de supervivencia después de la biopsia, vitrificación y calentamiento fue tan alta como 99.8%. La tasa de reexpansión a 1,5 h del calentamiento fue tan alta como 97%, dependiendo en gran medida del momento entre la biopsia y la vitrificación (idealmente 30 min), la calidad morfológica del blastocisto y el día de la biopsia. En general, es mejor vitrifiar un blastocisto colapsado; por lo tanto, en ciclos no-PGT, la contracción artificial asistida por láser podría realizarse para inducir el colapso embrionario antes de la criopreservación. La perspectiva de futuro más prometedora es el análisis no invasivo de los medios de cultivo de FIV después del cultivo del blastocisto como fuente putativa de ADN embrionario. Sin embargo, esta vanguardia potencial todavía está en investigación y todavía es necesario definir y validar un protocolo fiable.

La Figura 6 representa un esquema de todos los resultados de un procedimiento de biopsia que se puede adoptar para estandarizar el protocolo y monitorear el rendimiento de cada operador. El principal resultado procedimental es el momento para completar la biopsia/biopsias; el principal resultado técnico es la calidad de la trama producida después de pruebas genéticas que podrían resultar en un diagnóstico concluyente o no concluyente, el último de los cuales ...

La biopsia de blastocisto y la vitrificación son necesarias para realizar pruebas genéticas preimplantacionales de manera eficiente. Un enfoque que implica la apertura secuencial de la zona pellucida y la recuperación de 7-8 células de trophectoderm en el día 5-7 post-inseminación limita tanto el número de manipulaciones requeridas como la exposición del embrión a condiciones ambientales subóptimas.

Biopsia y vitrificación de blastocisto humano

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

Tanto la biopsia de blastocisto como la vitrificación han sido una revolución en la FIV, la fecundación in vitro, permitiendo a los embrólogos de todo el mundo realizar pruebas genéticas de preimplantación en embriones humanos con un riesgo mínimo para el embrión. La biopsia de trofectodermo ha permitido la recuperación de unas siete células de un embrión completamente crecido, lo que permite un análisis genético sólido aguas abajo. Además, hasta la fecha no se ha demostrado ningún impacto en este enfoque.La eficiencia clínica de este flujo de trabajo permite a los pacientes con afecciones monogénicas y a todos aquellos pacientes con mayor riesgo de anomalías cromosómicas dentro de su blastocisto beneficiarse de las pruebas genéticas preimplantacionales. Todavía hay espacio para mejorar las estrategias actuales de selección de embriones. Por ejemplo, el perfil miRnomico y proteómico representa opciones intrigantes para complementar las pruebas genéticas preimplantacionales en una sola biopsia de trofctodermo.Los operadores sin experiencia a menudo tienen problemas para abrir y penetrar en la zona pellucida. Es sólo una cuestión de concentración. El blastocisto, el objetivo láser y las pipetas deben estar en el mismo plano focal.Después de etiquetar la placa de biopsia con los detalles del paciente, con un marcador permanente y no tóxico, numera cada gota de 10 microlitros del medio con búfer HEPES con el embrión y el ciclo ID.Usando una pipeta de extracción de 300 micrómetros, transfiera un blastocisto viable y completamente expandido a la primera gota de la placa de biopsia y enjuague la gota para eliminar el exceso de calor medio, antes de mover el blastocisto en la segunda gota. Coloque el plato bajo un microscopio invertido y coloque la pipeta de biopsia con un medio de la tercera gota del plato de la biopsia. Bajo un aumento de 20 veces, oriente el blastocisto para obtener una visión clara de la masa de la célula interna a las siete en punto, y asegure el embrión en la pipeta de retención.Concéntrese en la zona pellucida para que tanto las pipetas como el blastocisto estén en el mismo plano focal. Cambie al objetivo láser y coloque el puntero láser en la zona pellucida en el lado opuesto de la masa de la celda interna. Taladre la zona pellucida con dos o tres pulsos láser, y presione suavemente la pipeta de biopsia contra la zona pellucida para permitir que el medio sea soplado a través de la brecha para separar las células del trofoctodermo de la superficie interna.Cuando el trofectodermo se desprende, entre a través del orificio y aspire de siete a ocho células de trofctodermo en la pipeta de biopsia con succión suave. Mientras aplica una succión moderada para estirar las células diana, mueva ligeramente la pipeta de biopsia hacia atrás y dirija el láser hacia la parte más delgada de las células aspiradas. Dispare de dos a cinco pulsos láser en las uniones entre las células para separar las células diana del cuerpo del embrión.Cuando el fragmento de trofectoderm se haya separado del blastocisto, suelte el fragmento en la misma gota de biopsia lejos del blastocisto para evitar que el fragmento sea aspirado de nuevo en la pipeta de biopsia. Suelte el blastocisto de la pipeta de sujeción y levante rápidamente ambas pipetas para evitar que el fragmento se pegue a las pipetas. A continuación, imagine el fragmento biopsiado con fines de control de calidad.Cuando todos los blastocistos hayan sido biopsiados como se acaba de demostrar, mueva la placa de biopsia de vuelta a la capucha de flujo laminar y etiquete el plato de cultivo post-biopsia con la identificación de la pareja y cada gota con el embrión y los ID de ciclo. En presencia de un testigo, enjuague el blastocisto en medio de FIV limpio y mueva el blastocisto a su caída correspondiente en la placa posterior a la biopsia. A continuación, coloque la placa posterior a la biopsia en un Celsius de 37 grados, 6% de dióxido de carbono y una incubadora de oxígeno al 5%.En presencia del testigo y dentro de una campana de flujo laminar a temperatura ambiente, etiquete los tubos PCR con un marcador permanente no tóxico. Etiquete la tapa de un plato de cultivo de tubos de 60 x 15 milímetros con los ID de embrion biopsiados y agregue dos gotas de 10 microlitros de solución de lavado de biopsia al plato. Preparar una pipeta de extracción de 140 micrómetros con solución de lavado de biopsia de la segunda gota de la placa de tubo bajo el microscopio estéreo para visualizar los fragmentos de trofctodermo.Libere suavemente alguna solución de lavado de biopsia sobre el fragmento de trofectodermo y cargue el fragmento en la pipeta de desmontaje. Mueva el fragmento a la segunda gota de solución de lavado de biopsia y enjuague cuidadosamente el tejido de dos a tres veces. Transfiera el fragmento de trofectodermo a la parte inferior del tubo PCR debidamente etiquetado con solución de carga, teniendo cuidado de evitar tocar las paredes del tubo con la punta de la pipeta de desmontaje.Cuando todos los fragmentos se hayan añadido a sus tubos, gire todos los tubos en una mini centrífuga durante unos segundos para sedimentar los fragmentos. A continuación, almacene las muestras a menos 20 grados centígrados hasta que se envíen al laboratorio genético de referencia para su análisis. Dentro de los 30 minutos de la biopsia de trofectoderm, etiquete una placa de vitrificación con los detalles del paciente y las identificaciones de los blastocistos que deben ser vitrificadas.Usando crioetiquetas especiales resistentes a la temperatura fría, etiquete los soportes de vitrificación con el nombre y apellido del paciente, la identificación de la pareja, la identificación del embrión que se cargará en él y la fecha del procedimiento. A temperatura ambiente, dispensar 300 microlitros de solución de equilibrio para cada blastocisto que se vitrifique y, en presencia de un testigo, utilizar una pipeta de desmontaje de 300 micrómetros para mover el blastocisto en un volumen de solución de equilibrio. Deje el blastocisto en la solución de equilibrio durante 13 a 15 minutos.Después de una contracción inicial del volumen, se observará una re-expansión gradual. Al final del equilibrio, añadir 300 microlitros de solución de vitrificación al segundo pocóculo de la placa de vitrificación y transferir el blastocisto completamente expandido a la solución de vitrificación durante un minuto. Al final de la incubación, enjuague el blastocisto para diluir la solución de equilibrio y, en presencia de un testigo, cargue el blastocisto en el soporte de vitrificación.Eliminar el exceso de solución de vitrificación. Una película sutil de solución debe rodear el blastocisto. Sumerja el soporte de vitrificación en nitrógeno líquido y mueva vigorosamente el soporte para reducir el riesgo de formación de burbujas cerca de la muestra.A continuación, coloque la tapa protectora en el soporte mientras el soporte de vitrificación todavía está sumergido en nitrógeno líquido. De los 1.544 procedimientos de biopsia de trofoctoderm realizados durante este período representativo de dos años, entre uno y cuatro blastocistos fueron biopsiados por procedimiento durante entre tres a 22 minutos por procedimiento. En estas gráficas, se muestra el tiempo medio de la biopsia para cada operador a lo largo de los trimestres del estudio, con un valor global medio de 8,24 minutos.Es útil adquirir una imagen de cada fragmento biopsiado con fines de control de calidad para evaluar si la causa de los diagnósticos no concluyentes era imputable a la dimensión y/o calidad del fragmento, al tubo o a algunos problemas en el procesamiento de la muestra en el laboratorio genético. En este estudio, 572 blastocistos euploides fueron calentados para someterse a una transferencia de embriones después de un diagnóstico de euploidía. Todos los blastocistos vitrificados en 30 minutos, con el 2,4% de los blastocistos no se re-expandiendo entre 31 y 90 minutos y 4.9% no se re-expandió más allá de 90 minutos desde el recalentamiento.Especialmente para la mala calidad y / o día siete blastocistos, el tiempo entre la biopsia y la vitrificación parece crucial para lograr la re-expansión después del calentamiento. Tenga cuidado de enfocar antes de abrir la zona pellucida al exponer la unión entre la célula del trofctoderm y el disparo, y tenga cuidado también de evitar la re-expansión del blastocisto antes de la vitrificación. Existen otros dos enfoques de biopsia de blastocisto, ambos que implican la apertura de zona pellucida y la espera de un arco espontáneo de las células del trofctodermo.Estos enfoques son más fáciles, pero requieren más manipulaciones y consumen más tiempo. La eficacia de este flujo de trabajo permite la implementación de tecnologías moleculares en FIV con el fin de tratar de seleccionar el blastocisto con la mayor probabilidad de implantarse antes de la transferencia de embriones. Recuerde no utilizar ningún dispositivo o solución que pueda ser tóxico para los embriones y prevenir la contaminación del ADN mediante el uso de materiales libres de ADN.

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Investigación

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Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras en la corteza cerebral de los mamíferos. Este método describe un análisis cuantitativo 3D de morfologías de la columna vertebral en las neuronas glutamatérgicas piramidal corticales humanos derivadas de células madre pluripotentes inducidas.

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Aquí hay un protocolo para cultivar células madre pluripotentes (PSC) y células madre neurales (NSC) en un sistema de cultivo celular cerrado que permite la máxima esterilidad y reproducibilidad, reemplazando el gabinete de bioseguridad y la incubadora tradicionales. Este equipo cumple con las pautas de buenas prácticas clínicas de fabricación (cGMP) y buenas prácticas de laboratorio clínico (cGLP).

El cultivo humanas pluripotentes y células madre neurales en un sistema de cultivo celular cerrado para la investigación básica y preclínica

Aprende la biopsia y vitrificación de blastocisto humano para diagnóstico genético preimplantacional con mínimo riesgo embrionario. Este método permite obtener células de trophectodermo para análisis genético robusto.

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