Name: Ensayo in vitro transcrito luciferase Reporter basado en ARN para estudiar el Reglamento de traducción en las células infectadas por el poxvirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprende a estudiar la regulación de la traducción en células infectadas por poxvirus mediante un ensayo de luciferasa basado en ARN transcrito in vitro. Este método permite analizar elementos cis en mRNA como 5'UTR y 3'UTR.

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El proyecto fue financiado por los institutos nacionales de la salud (AI128406 www.nih.gov) a la ZY y en parte por el centro de investigación del cáncer de Johnson (http://cancer.k-state.edu) en forma de postgrado estudiante verano Stipend a PD.

1. preparación de la plantilla de ADN por PCR para la transcripción in vitro
<ol><li>Para preparar la plantilla de ADN mediante PCR, diseñe imprimadores. Al diseñar imprimaciones considerar características cruciales como la longitud de imprimación, temperatura de recocido (Tm), contenido GC, 3 ' end con G o C, etc. Nota: Discutidos detalladamente en esta literatura25,26,27.</li>
	<li>Diseño de imprimadores para generar amplicón PCR que contiene los siguientes elementos en la dirección 5 ' a 3 ': T7-Promoter, líder Poly (A), luciferasa Firefly ORF y una cola Poly (A) referida a continuación como T7_12A-FLUC. Diseño de imprimadores (avance y retroceso) para abarcar todos los elementos adicionales no presentes en el ADN de la plantilla (figura 2A). Nota: La secuencia de todos los elementos se puede encontrar en la tabla 1.
</li>
	<li>Incluir varios nucleótidos adicionales en el primer avance (5 '-3 ')28, seguidos por el T7-promotor, el líder Poly (A) o la secuencia deseada 5 '-UTR y aproximadamente 20 nucleótidos, ajuste basado en Tm, correspondiente al extremo 5 ' del gen del reportero Orf. Asegúrese de que la región correspondiente en la imprimación sea idéntica a la hebra de sentido (+ hebra) del gen. Nota: Durante largos 5 '-UTR, sintetizar dos fragmentos de ADN: uno con T7 promotor seguido de largo 5 '-UTR y segundo con ORF del reportero gene. Unir estos dos fragmentos utilizando la extensión de superposición PCR29.</li>
	<li>Diseño de imprimación inversa (5 '-3 ') para incluir la cola Poly (a) y aproximadamente 20 nucleótidos, ajuste basado en Tm, correspondiente al extremo 3 ' del ORF del gen reportero. Asegúrese de que la región correspondiente en la imprimación es idéntica a la hebra antisentido (-Strand) del gen y un codón de parada en el bastidor está presente antes de la cola Poly (A). Nota: La longitud deseada de la A en un poly (A) líder o poli (A) cola se puede personalizar en los imprimadores. Por ejemplo, para agregar 50 a en la cola Poly (a), la imprimación inversa debe implicar 50 T. Del mismo modo, para agregar 20 a en el líder Poly (A), la imprimación delantera debe implicar 20 A.</li>
	<li>Para el control interno, diseñe otro conjunto de imprimadores que contengan los siguientes elementos en la dirección 5 ' a 3 ': T7 Promoter, una secuencia de codificación aleatoria de 5 '-UTR que contiene la secuencia Kozak, Renilla luciferasa ORF y la cola Poly (a) referida a continuación como T7_ Kozak-Rluc.</li>
	<li>En un tubo de PCR, agregue los reactivos en el siguiente orden: agua libre de DNase, 2x polimerasa de ADN de alta fidelidad, imprimadores, y secuencia confirmada de ADN de la plantilla de luciferasa (tabla 2). Nota: Las cantidades de componentes individuales en la mezcla deben ajustarse de acuerdo con el volumen de reacción.</li>
	<li>Utilice un ciclo de PCR estándar de 3 pasos (desnaturalización, recocido, extensión) para generar una plantilla de ADN como se muestra en la tabla 3. Nota: La temperatura de recocido X ° c depende del conjunto de imprimación que se está utilizando y el tiempo de extensión T min depende del tamaño de amplicón PCR y de la polimerasa de ADN utilizada.</li>
	<li>Detecte el producto de PCR ejecutando el 5-10% de la reacción PCR en electroforesis de gel de tris-acetato-EDTA (TAE) al 1% (conteniendo 0,1 μg/ml de bromuro de etilo) junto con el estándar de peso molecular disponible comercialmente. Visualice el gel bajo un iluminador UV para determinar el tamaño del producto de PCR.</li>
	<li>Después de determinar el tamaño correcto del producto de PCR, ~ 1,7 KB para T7_12A-FLUC y ~ 1,0 KB para T7_Kozak-Rluc, purificarlo usando un kit de purificación de PCR disponible comercialmente. Elute el ADN utilizando 100 μL de agua libre de nucleasa (figura 2B).</li>
	<li>Una vez purificada, Compruebe la concentración del ADN utilizando un espectrofotómetro y determine la relación A260/A280 (~ 1.8-2.0 es aceptable).</li>
	<li>Almacene el ADN purificado a-20 ° c o utilice para la transcripción in vitro inmediatamente.</li>
</ol>2. generar mRNA por transcripción in vitro
<ol><li>
Sintetizar ARN del producto PCR in vitro, utilizando un kit de transcripción in vitro (figura 3a). Nota: las plantillas de ADN T7_12A-FLUC y T7_Kozak-Rluc se utilizan para sintetizar mRNAs 12A-FLUC y Kozak-rluc, respectivamente.<ol>
<li>Para ello, tome un tubo de microcentrífuga y agregue los reactivos en el siguiente orden: agua libre de DNase-RNase, mezcla de búfer NTP, análogo de Cap, producto de PCR de plantilla, mezcla de pomerasa T7-RNA (tabla 4). Nota: Otros sistemas de taponado también se pueden utilizar para tapar secuencialmente el ARN después de la transcripción in vitro siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Mezclar bien e incubar a 37 ° c durante 2 h.</li>
		<li>Proceda a la purificación del ARN sintetizado utilizando un kit de purificación de ARN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecutar ARN purificado en 1,5% Tris-borato-EDTA (TBE) gel (conteniendo 0,5 μg/ml de bromuro de etidio) para comprobar el ARN. Visualice el gel bajo un iluminador UV (figura 3B).</li>
	<li>Compruebe la concentración del ARN utilizando un espectrofotómetro y determine la relación A260/A280 (~ 1.8-2.0 es aceptable).</li>
	<li>Aliquot el ARN purificado y almacenar a-80 ° c.</li>
</ol>3. transfect mRNA a las células
<ol><li>Semillas de células HeLa en una placa de 24-Well (para ser aprox. ~ 80-90% confluente al día siguiente) e incubar durante la noche en una incubadora a 37 ° c con 5% CO2.</li>
	<li>Infectar las células HeLa con el virus vaccinia (VACV) en una multiplicidad de infecciones (MOI) de 5 o mantener las células de HeLa no infectadas para la comparación. Nota: MOI es el número de partículas virales infecciosas por célula.</li>
	<li>MOI de X = {[(número de células * X)/virus titer] * 1000} μl de virus por 1 mL de medio.</li>
	<li>
Después de la infección de h post deseada (HPI) (en este experimento a 10-12 HPI), transfectar mRNA (500 ng de ARNm total por pozo de placas de 24-Well) utilizando un reactivo de transexcreción lipídica catiónica como se muestra en la Figura 3C.
	<ol>
<li>Para un pozo de una placa de 24-Well, mezclar 480 ng de 12A de rodamiento de la secuencia luciferasa Firefly (12A-FLUC) mRNA y 20 ng de la secuencia Kozak que lleva Renilla luciferasa (Kozak-rluc) mRNA en un tubo de microcentrífuga. En otro tubo de microcentrífuga añadir 1,1 μL de reactivo de transfección de lípidos catiónicos.</li>
		<li>Añadir 55 μL de medio sérico reducido en ambos tubos. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
		<li>Después de 5 min de incubación, añadir 55 μL de reactivo de transfección de lípidos catiónicos que contiene un medio sérico reducido en mRNA que contiene el tubo.</li>
		<li>Mezclar suavemente pero a fondo, e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.</li>
		<li>Durante la incubación, retire el medio de cultivo celular y añada 400 μL de medio sérico reducido por pozo de placas de 24 pozo.</li>
		<li>Después de la incubación, añadir 100 μl de la mezcla gota a gota y uniformemente a un pozo de placas de 24-well.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mida las actividades de luciferase
<ol><li>Cinco horas después de la transfección de 12A-FLUC y Kozak-rluc mRNA, miden la actividad de luciferasa utilizando un sistema de ensayo luciferasa capaz de realizar dos ensayos de reportera (p. ej., dual luciferasa Reporter kit de ensayo).</li>
	<li>Quitar el medio sérico reducido y lisar las células añadiendo 150 μL de tampón de lisis 1x, un componente del kit de ensayo luciferasa.</li>
	<li>Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, recoger el lisado por desguace las células y transferir a un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Centrifugar el lisado a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° c a desechos de células de pellet.</li>
	<li>Añadir 30 μL de sobrenadante en placa de ensayo de pared opaca 96 bien blanca con un fondo sólido.</li>
	<li>Mida la luminiscencia doble utilizando el kit de ensayo luciferasa y un luminómetro de lector de placas multimodo.</li>
	<li>Realice la medición utilizando la función cinética (sobre una base por pozo) utilizando los ajustes descritos en la tabla 5. Nota: La lectura también se puede tomar con Luminómetro manual. Añadir un volumen igual de lisado y sustrato para FLUC en una cubeta. Espere 2 s y mida durante 10 s con el luminómetro. Después de la medición de FLUC, sacar rápidamente la cubeta del luminómetro y añadir un volumen igual del sustrato para Rluc manualmente. Una vez más, espere 2 s y mida durante 10 s con el luminómetro.</li>
	<li>Exporte los datos de lectura de luminiscencia a un formato de archivo deseable.</li>
	<li>Determine la tasa de conversión relativa del mRNA 12A-FLUC en las células HeLa infectadas no infectadas y VACV, dividiendo el valor de FLUC por el valor de Rluc de control interno. Nota: La figura 1 complementaria muestra el análisis paso a paso de los datos sin procesar para obtener la actividad FLUC relativa.</li>
</ol>

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</ol>

A los autores no les gustaría declarar ningún interés financiero competidor.

Todos los pasos de cuatro núcleos son fundamentales para el éxito del ensayo de reportero de luciferasa, basado en ARN transcrito in vitro. Se debe prestar especial atención al diseño de imprimación, especialmente para la secuencia de promotor T7. La polimerasa de T7 RNA comienza la transcripción de la primera G (gGG-5'-UTR-Aug-) subrayada en T7 promotor añadida antes de la secuencia 5 '-UTR. Aunque el sitio de inicio de la transcripción (TSS) comienza a partir de la primera G en el extremo 5 ', la disminución del...

Según el dogma central, la información genética fluye del ADN al ARN y finalmente a la proteína1,2. Este flujo de información genética está altamente regulado en muchos niveles, incluyendo la traducción de mRNA3,4. El desarrollo de ensayos de reportera para medir la regulación de la expresión génica facilitará la comprensión de los mecanismos regulatorios involucrados en este proceso. Aquí describimos un protocolo para estudiar la traducción de mRNA usando un ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa en células infectadas con poxvirus.
Los poxvirus comprenden muchos patógenos humanos y animales altamente peligrosos5. Como todos los demás virus, los poxvirus dependen exclusivamente de la maquinaria de célula huésped para la síntesis de proteínas6,7,8. Para sintetizar eficientemente las proteínas virales, los virus desarrollaron muchas estrategias para secuestrar la maquinaria celular translacional para redirigirla para la traducción de mRNAs virales7,8. Un mecanismo comúnmente empleado por virus es utilizar elementos de acción CISen sus transcripciones. Algunos ejemplos notables son el sitio de entrada ribosome interno (IRES) y el potenciador de la traducción independiente de la PAC (CITE)9,10,11. Estos elementos CIShacen de las transcripciones virales una ventaja traslacional al atraer maquinaria traslacional a través de diversos mecanismos12,13,14. Más de 100 mRNAs de poxvirus tienen un elemento de acción CISevolutivamente conservado en la región 5 '-no traducida (5 '-UTR): un 5 '-poli (a) líder en los 5 ' extremos de estos mRNAs15,16. Las longitudes de estos 5 '-Poly (A) líderes son heterogéneos y se generan por el deslizamiento de la polimerasa del arn codificado con poxvirus durante la transcripción17,18. Nosotros, y otros, recientemente descubrimos que el 5 '-poli (A) líder confiere una ventaja de traducción a un mRNA en las células infectadas con el virus vaccinia (VACV), el miembro prototypic de poxvirus19,20.
El ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa se desarrolló inicialmente para entender el papel del líder 5 '-Poly (A) en la traducción de mRNA durante la infección por poxvirus19,21. Aunque los ensayos de reportero de luciferasa basados en ADN plásmido han sido ampliamente utilizados, hay varios inconvenientes que complicarán la interpretación de resultados en las células infectadas por el poxvirus. En primer lugar, los plásmidos son capaces de replicar en las células infectadas por VACV22. En segundo lugar, la transcripción críptica a menudo ocurre a partir del ADN plásmido18,23,24. En tercer lugar, la transcripción impulsada por el promotor de VACV genera Poly (A)-líder de longitudes heterogéneas por lo que dificulta el control de la longitud del líder Poly (a) en algunos experimentos18. Un ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa que evita estos problemas y la interpretación de los datos es sencilla.
Hay cuatro pasos clave en este método: (1) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para generar la plantilla de ADN para la transcripción in vitro; (2) transcripción in vitro para generar mRNA; (3) transfección para entregar mRNA en las células; y (4) la detección de la actividad luciferasa como indicador de la traducción (figura 1). El amplificador de PCR resultante contiene los siguientes elementos en la dirección 5 ' a 3 ': T7-Promoter, líder Poly (A) o la secuencia deseada de 5 '-UTR, luciferasa Firefly con marco de lectura abierta (ORF) seguida de una cola Poly (A). El amplicón de PCR se utiliza como la plantilla para sintetizar mRNA por transcripción in vitro usando la T7 polimerasa. Durante la transcripción in vitro, m7G Cap u otro análogo de la tapa se incorpora en el mRNA recién sintetizado. Las transcripciones coronadas se transfectadas en células no infectadas o infectadas por VACV. El lisado celular se recoge en el momento deseado después de la transfección para medir las actividades de luciferasa que indican la producción de proteínas del mRNA transfeccionado. Este ensayo reportero se puede utilizar para estudiar la regulación de la traducción por CIS-Element presente en 5 '-UTR, 3 '-UTR u otras regiones de un mRNA. Además, el ensayo in vitro transcrito basado en ARN puede utilizarse para estudiar diferentes mecanismos de iniciación de la traducción, incluyendo iniciación dependiente de la PAC, iniciación independiente de la tapa, reiniciación e iniciación interna como IRES.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 Mezcla maestra</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492</td><td>ADN polimerasa de alta fidelidad utilizada en PCR</td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G Estructura de tapa de ARN análoga</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td>Tapa anti inversa analógica o ARCA</td></tr><tr><td>Corning 96 Well Half-Area microplaca de poliestireno de fondo plano blanco</td><td>Corning</td><td>3693</td><td>Placa blanca de 96 pocillos con paredes opacas con fondo sólido</td></tr><tr><td>Sistema de ensayo reportero de luciferasa dual</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Kit de ensayo de luciferasa dual (DLAK)</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Kit puro</td><td>de ciclo OMEGA BIO-TEK</td><td>D6492</td><td>Kit de purificación de PCR</td></tr><tr><td>GloMax Navigator Luminómetro de microplaca</td><td>Promega</td><td>GM2010</td><td>Referido como luminómetro de lector de placas multimodo</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Kit rápido de síntesis de ARN de alto rendimiento</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td>en Kit de transcripción in vitro</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>11668019 Reactivo de transfección de lípidos catiónicos</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Se utiliza para medir la concentración de ADN y ARN</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Medios de suero reducidos</td></tr><tr><td>Purelink RNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A Kit de</td><td>purificación de ARN</td></tr><tr><td>Sistema de tapado Vaccinia</td> Sistema de <td>taponado</td> <td>M2080</td> de <td>New England Biolabs</td></tr></tbody></table>

ensayo in vitro transcrito luciferase reporter basado en arn para estudiar el reglamento de traducción en las células infectadas por el poxvirus

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Cada poxvirus mRNA transcrito después de la replicación del ADN viral tiene un líder de 5 '-Poly (A) evolutivamente conservado, no con plantilla en el 5 '-UTR. Para diseccionar el papel de 5 '-Poly (A) líder en la traducción de mRNA durante la infección por el poxvirus desarrollamos un ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa. Este ensayo de reportero consta de cuatro pasos principales: (1) PCR para amplificar la plantilla de ADN para la transcripción in vitro; (2) transcripción in vitro para generar ARNm utilizando la polimerasa de T7 RNA; (3) transfección para introducir in vitro el mRNA transcrito en las células; (4) detección de la actividad luciferasa como indicador de la traducción. El ensayo de la reportera luciferasa basado en ARN descrito aquí elude los problemas de la replicación plásmia en las células infectadas por el poxvirus y la transcripción críptica del plásmido. Este protocolo se puede utilizar para determinar la regulación de la traducción por CIS-Elements en un mRNA que incluye 5 '-UTR y 3 '-UTR en sistemas que no sean células infectadas por el poxvirus. Por otra parte, diferentes modos de iniciación de la traducción como dependiente de la PAC, Cap-independiente, re-iniciación, y la iniciación interna se pueden investigar utilizando este método.

Los cuatro pasos del ensayo in vitro transcrito de la luciferasa basada en ARN: la PCR para generar una plantilla de ADN para la transcripción in vitro, la transcripción in vitro para generar ARNm, la transfección de mRNA y la medición de luciferasa, se pueden ver en el diagrama esquemático ( Figura 1). El diseño de imprimadores para ambas plantillas de ADN (FLUC y Rluc) y el esquema general de PCR de extensión de voladizo se ilustra en el esquema (<strong cl...

Presentamos un protocolo para estudiar la regulación de la traducción de mRNA en células infectadas por poxvirus usando el ensayo de reportero de luciferasa transcrito in vitro basado en ARN. El ensayo se puede utilizar para estudiar la regulación de la traducción por CIS-Elements de un mRNA, incluyendo 5 '-región no traducida (UTR) y 3 '-UTR. También se pueden examinar diferentes modos de iniciación de la traducción utilizando este método.

Ensayo in vitro transcrito luciferase Reporter basado en ARN para estudiar el Reglamento de traducción en las células infectadas por el poxvirus

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Nuestro protocolo para un ensayo de luciferasa transcrito in vitro basado en ARN ayuda a estudiar la regulación de la traducción en células infectadas por el virus de la viruela. Además, una longitud personalizada del Poly(A)liter permite estudiar sus efectos regulatorios en la traducción. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de la regulación de la traducción por parte de elementos Cis como 5'UTR y 3'UTR en ARNm y amplio espectro de iniciación de traducción.El ensayo de reportero de luciferasa transcrito in vitro puede adaptarse para incorporar modificaciones al límite máximo y otras modificaciones y utilizarse para probar el efecto en la traducción. Para empezar, diseñe imprimaciones hacia adelante y hacia atrás para generar el amplicon PCR que contiene los siguientes elementos en 5'a 3'dirección:T7-Promoter, Poly(A)liter, Firefly Luciferase ORF en una cola Poly(A) conocida como T7_12A-Fluc, incluyen varios nucleótidos adicionales en imprimación delantera seguidos de T7-Promotor Poly(A)litro o secuencia deseada 5'UTR y aproximadamente 20 nucleótidos correspondientes al extremo 5 del ORF del gen reportero. Ajuste la longitud de la imprimación en función de la temperatura de fusión correspondiente al 5'final del ORF del gen reportero, asegurándose de que la región correspondiente en la imprimación es idéntica a la cadena de detección del gen.A continuación, diseñe la imprimación inversa para incluir Poli(A)cola y aproximadamente 20 nucleótidos. Ajuste en función de la temperatura de fusión correspondiente al ORF del 3'end del gen reportero, asegurándose de que la región correspondiente de la imprimación sea idéntica a la cadena antisrés del gen y que haya un codón de parada en el marco antes de la cola Poly(A). Para el control interno, diseñe otro conjunto de imprimadores que contenga los siguientes elementos en 5'a 3'direction:T7-Promoter, una secuencia de codificación aleatoria de 5'UTR que contenga la secuencia Kozak, Renilla Luciferase ORF y Poly(A)tail, conocida como T7_Kozak-Rluc.Para configurar la reacción, añada reactivos en el siguiente orden a un tubo de PCR: agua libre de DNase, 2X de ADN polimerasa de alta fidelidad, imprimaciones y secuencia confirmada de ADN de plantilla luciferasa. Después de un ciclo estándar de PCR de tres pasos para generar una plantilla de ADN, detecte el producto PCR ejecutando 5-10% de la reacción pcr en una electroforesis de gel DE TAE de 1% de agarosa junto con un estándar de peso molecular. Para determinar el tamaño del producto PCR, visualice el gel bajo un iluminador UV.Después de determinar el tamaño correcto del producto PCR, purízalo utilizando un kit de purificación de PCR disponible comercialmente utilizando 100 microlitros de agua libre de nucleasas para eluir el ADN. Compruebe la concentración del ADN purificado utilizando un espectrofotómetro y guárdelo en menos 20 grados Celsius para su uso para la transcripción in vitro inmediatamente. Para sintetizar el ARN del producto PCR, añada los siguientes reactivos a un tubo de microcentrífuga: agua libre DNase-RNase, mezcla de búfer NTP, análogo de tapa, plantilla de producto PCR y mezcla de polimerasa T7-ARN del kit de transcripción in vitro.Homogeneizar. Incubar a 37 grados centígrados durante dos horas y luego proceder a la purificación del ARN sintetizado utilizando un kit de purificación de ARN. Para comprobar el ARN purificado, caliente el ARN a 70 grados durante cinco minutos para extraer la estructura secundaria y ejecútelo con gel TBE de 1,5 agarosa.A continuación, visualice el gel bajo un iluminador UV. Compruebe la concentración del ARN purificado utilizando un espectrofotómetro. Aliquot y almacenar a menos 80 grados Celsius.Células HeLa de siembra en una placa de 24 pozos para lograr 80-90% de confluencia al día siguiente e incubar durante la noche en una incubadora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Infectar las células de HeLa con el virus de la Vacuna a una multiplicidad de infección de cinco y mantener las células HeLa no infectadas para la comparación. Luego incubar la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 10 a 12 horas.Después de las horas deseadas después de la infección, mezclar 480 nanogramos de secuencia 12A con Arndor de Firefly Luciferase y 20 nanogramos de secuencia Kozak con Arnm De Renilla Luciferase en un tubo de microcentrífuga. En otro tubo de microcentrífuga, añadir 1,1 microlitros de reactivo de transfección lipídica catiónica. Añadir 55 microlitros de medios séricos reducidos a ambos tubos, mezclar e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.A continuación, añada 55 microlitros de reactivo de transfección lipídica catiónica que contenga medios séricos reducidos al tubo que contiene ARNm. Mezclar suavemente pero a fondo con una pipeta e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Durante la incubación, retire el medio de cultivo celular de las células y agregue 400 microlitros de medio sérico reducido por pozo.Una vez finalizada la incubación, añadir 100 microlitros de la gota de la mezcla sabia y uniformemente por pozo de la placa de 24 pozos. Cinco horas después de la co-transfección con 12A Fluc y Kozak Rluc mRNA, eliminar el medio sérico reducido de las células y lalyse las células mediante la adición de 150 microlitros 1X tampón de lisis del kit de ensayo Luciferase capaz de realizar dos ensayos de reportero. Después de incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, raspe las células con goma y jeringa estéril y transfiera a un tubo de microcentrífuga.Para los desechos de células de pellet, centrifugar el izado a 12.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera 30 microlitros de sobrenadante por pozo de una placa de ensayo blanca de 96 pozos con paredes opacas con un fondo sólido. Utilice el kit de ensayo De Luciferase y un luminómetro lector de placas multimodo para medir la luminiscencia dual utilizando la función cinética como se describe en el manuscrito.Después de exportar los datos de lectura de luminiscencia a un formato de archivo deseable, determine la tasa de traducción relativa de 12A Fluc mRNA en células HeLA no infectadas e infectadas por VACV dividiendo el valor Fluc por el valor Rluc de control interno. Este ensayo se utilizó para probar la eficiencia de traducción de un ARNm Fluc que contiene un 5'Poly(A)liter en células infectadas y infectadas por VACV. Tanto las células infectadas no infectadas como las células infectadas por VACV se cotrans infectaron con éxito con Fluc y Rluc mRNA.La división de Fluc por Rluc normalizó la eficiencia de la transfección en la estabilidad del ARN en las células. 5'Poly(A)liter que contiene ARNm tiene una ventaja traslacional durante la infección por VACV en comparación con las células no infectadas. Esto no se debió a la eficiencia diferencial de la transfección o a la estabilidad del ARNm, ya que el nivel de ARN era similar en las células infectadas no infectadas e infectadas por VACV cinco horas después de la transfección de ARNm.Tenga especial cuidado al diseñar imprimaciones, ya que esto puede afectar no sólo a la eficiencia de la reacción PCR, sino también a todos los procesos posteriores que requieren el ADN amplificado. Este método es un ensayo importante para probar rápidamente la regulación de traducción por elementos Cis. Si es posible, este método debe ser corroborado por otros experimentos complementarios.Se deben tomar precauciones durante el uso del virus de Vaccinia y evitar la exposición a sustancias químicas como bromuro de etidio y fenol.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este método describe un alto rendimiento in vitro síntesis de ARNm con caperuza y sin caperuza a partir de un plásmido linealizado que contiene el Gaussia gen luciferasa (GLuc). El ARN se purifica y una fracción del ARN sin caperuza se caperuza enzimáticamente utilizando el Vaccinia enzima de capping viral. En el paso final, el ARNm se transfecta en células HeLa y los sobrenadantes del cultivo celular se analizan para determinar la actividad de luciferasa.

En la transcripción in vitro y la nivelación de mRNA de luciferasa Gaussia Seguido por transfección de células HeLa

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

Este video muestra un método para rastrear infecciones virales en modelos de ratón utilizando un virus de influenza A bi-reportero que expresa luciferasa y proteínas de fluorescencia. Este método permite realizar estudios tanto in vivo como ex vivo, lo que permite a los investigadores obtener información sobre la dinámica viral y los efectos de las intervenciones.

Un virus de la influenza indicador fluorescente de luciferasa para rastrear infecciones virales

Este video muestra un ensayo para estudiar la regulación de la traducción en células infectadas por poxvirus. Las células no infectadas e infectadas por el virus se transfectaron conjuntamente con ARNm que codifican para la luciferasa de luciérnaga (Fluc) y la luciferasa Renilla (Rluc), y el ARNm de Fluc contuvo una secuencia líder de Poly(A) de 5'. Al agregar sustratos bioluminiscentes en las células lisadas, mida la señal de ambas luciferasas para identificar la ventaja traduccional del ARNm...

Un ensayo reportero de luciferasa para estudiar la regulación de la traducción en células infectadas por Poxvirus

Se describe el uso de un virus vaccinia reportero fluorescente que permite la medición en tiempo real de la infectividad viral y la expresión génica a través de la expresión de etapa específica de fluoróforos espectralmente distintos reportero. Nos detalle un método basado en la placa para identificar con precisión la etapa en la que la replicación del virus se ve afectada en respuesta a la inhibición pequeña molécula.

Vaccinia Virus Reporter para cuantificar la función viral en todas las etapas de la Expresión Génica

Aquí describimos un ensayo de genes reporteros basado en células como una herramienta valiosa para examinar bibliotecas químicas en busca de compuestos que modulan los mecanismos de control postranscripcional ejercidos a través de 3' UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

La transfección en la línea celular de macrófagos, RAW264.7, es difícil debido a la respuesta natural de la célula contra materiales extraños. Describimos aquí un procedimiento suave pero robusto para transfectar genes reporteros de luciferasa en células RAW264.7.

Transfectar células RAW264.7 con un gen informador de luciferasa

Se presenta un ensayo de bioluminiscencia en vitro para determinar del ritmo circadiano celular en células epiteliales mamarias. Este método utiliza plásmidos de reportero de células de mamífero expresando desestabilizada luciferasa bajo el control del promotor del gen de periodo 2 . Puede ser adaptado a otros tipos de células para evaluar efectos de órgano-específicas en el ritmo circadiano.

In Vitro Ensayo de bioluminiscencia para la caracterización del ritmo circadiano en células epiteliales mamarias

Aquí, presentamos los protocolos para identificar inmunomoduladores 1) virus-codificado que promueven la replicación de arbovirus y host 2) eucariotas factores que limitan la replicación de arbovirus. Estos métodos basados en fluorescencia y luminiscencia permiten a los investigadores obtener rápidamente lecturas cuantitativas de la replicación de arbovirus en análisis simplistas con proporciones bajas de señal a ruido.

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

Para identificar nuevos reguladores de los factores de transcripción, desarrollamos un enfoque para las bibliotecas de ARN lentivirales o retrovirales arrayed utilizando un ensayo de reportero transcripcional basado en doble luciferasa. Este enfoque ofrece una forma rápida y relativamente económica de examinar a cientos de candidatos en un solo experimento.

Identificación de reguladores de factores de transcripción mediante la proyección de rendimiento medio de bibliotecas de matriz y un reportero basado en la doble luciferasa

Desarrollamos un ensayo informador de biogénesis de microARN intrónico para ser utilizado en células in vitro con cuatro plásmidos: uno con miARN intrónico, uno con el objetivo, uno para sobreexpresar una proteína reguladora y uno para Renilla luciferasa. El miARN se procesó y pudo controlar la expresión de luciferasa uniéndose a la secuencia objetivo.

Un ensayo reportero para analizar la maduración intrónica de microARN en células de mamíferos

Aprende a estudiar la regulación de la traducción en células infectadas por poxvirus mediante un ensayo de luciferasa basado en ARN transcrito in vitro. Este método permite analizar elementos cis en mRNA como 5'UTR y 3'UTR.

Ensayo in vitro transcrito luciferase Reporter basado en ARN para estudiar el Reglamento de traducción en las células infectadas por el poxvirus (Video) | JoVE Journal

Ensayo in vitro transcrito luciferase Reporter basado en ARN para estudiar el Reglamento de traducción en las células infectadas por el poxvirus

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