Name: Aislamiento y cuantificación del virus del Zika de múltiples órganos en un ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprenda a aislar y cuantificar el virus del Zika en múltiples órganos de ratón para estudiar la patogénesis viral y la respuesta inmunológica. Este método permite comprender la diseminación del virus y evaluar vacunas.

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El Dr. Pinto es financiado por una beca de semilla de la Escuela de Medicina de la Universidad de Saint Louis y fondos de startups de la Escuela de Medicina de la Universidad de Saint Louis. El Dr. Brien es financiado por un premio K22AI104794 de investigador temprano de la NIH NIAID, así como una beca de semilla de la Escuela de la Universidad de Saint Louis. Para todas las personas financiadas, los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

<ol><li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%3A+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li>
<li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infection+in+Man%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li>
<li>Fagbami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+investigations+on+arbovirus+infections+at+Igbo-Ora%2C+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+Geographical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria.</a> Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).</li>
<li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li>
<li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda%3A+a+serological+survey+in+Karamoja+district%2C+1984%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li>
<li>Wikan, N., Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%3A+history+of+a+newly+emerging+arbovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus: history of a newly emerging arbovirus.</a> Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+outbreaks+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Weekly+Epidemiological+Record%22%5BJournal%5D)">Zika virus outbreaks in the Americas.</a> The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).</li>
<li>Brien, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Immunological+basis+of+age-related+vulnerability+to+viral+infection%22">Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection</a>. , Oregon Health & Science University. (2007).</li>
<li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus-specific+CD4+T+cells+exhibit+direct+antiviral+cytokine+secretion+and+cytotoxicity+and+are+sufficient+for+antiviral+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection.</a> Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).</li>
<li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li>
<li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+therapeutic+antibodies+that+neutralize+homologous+and+heterologous+genotypes+of+dengue+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823(2010).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor-1+%28IRF-1%29+shapes+both+innate+and+CD8%28%2B%29+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230(2011).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8%2B+T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407(2011).</li>
<li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+quantification%2C+detection%2C+and+storage+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li>
<li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343(2013).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li>
<li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086(2014).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae%2C+Bunyaviridae%2C+and+Filoviridae+Families%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li>
<li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237(2018).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086(2014).</li>
<li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+quantification%2C+detection%2C+and+storage+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li>
<li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237(2018).</li>
<li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li>
<li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Por lo tanto, la infección por ZIKV puede causar una enfermedad neurológica, por lo que los modelos animales actuales para estudiar la patogénesis, las respuestas inmunitarias y la eficacia protectora de las vacunas y los antivirales deben centrarse en el control viral dentro del SNC. Uno de los desafíos para centrarse en la enfermedad del SNC es que a menudo viene a expensas de estudiar la infección periférica. Los métodos de aislamiento de órganos propuestos aquí se centran en la necesidad de evaluar rápidamente la inf...

El virus del Zika (ZIKV) es un arbovirus que pertenece a la familia flaviviridae, que incluye importantes patógenos humanos neuroinvasivos como el virus powassan (POWV), el virus de la encefalitis japonesa (VJE) y el virus del Nilo Occidental (WNV)1. Tras su aislamiento e identificación, se han notificado periódicamentelas infecciones humanas por el ZIKV en Africa y Asia 2,3,4,5, y epidemias en América Central y del Sur (revisado sin referencia6). Sin embargo, no fue hasta hace pocoque se pensaba que ZIKV causaba una enfermedad grave 7. Ahora hay miles de casos de enfermedades neurológicas y defectos congénitos relacionados con infecciones por ZIKV. La rápida aparición de ZIKV ha suscitado muchas preguntas relacionadas con: por qué hay un aumento en la gravedad de la enfermedad, cuál es la respuesta inmunológica a la infección por ZIKV y existen patologías virales y/o inmunes mediadas relacionadas con el aumento de la neurología manifestaciones y defectos congénitos. Ahora existe la prisa por entender la enfermedad relacionada con el sistema nervioso central (SNC) asociada con el ZIKV, así como la necesidad de probar rápidamente la eficacia de los antivirales y vacunas contra el ZIKV. Es en este contexto que hemos desarrollado métodos para el análisis rápido de los titulas ZIKV tanto en la periferia como en el SNC utilizando un enfoque específico de ZIKV (FFA).
Los modelos animales pequeños son importantes para comprender la progresión de la enfermedad y para la evaluación temprana de vacunas, terapias y antivirales. Hemos establecido pequeños modelos animales para el estudio de la enfermedad de arbovirus mediante el uso de varias cepas de ratón para modelar la infección humana y la protección contra patógenos virales8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Utilizando esta experiencia previa, comenzamos a modificar las técnicas utilizadas para la evaluación del virus WNV y del dengue, un flavivirus relacionado para la evaluación del titer ZIKV tanto en órganos periféricos como en el SNC21,23, 24. Las ventajas de estos métodos sobre otros ensayos son: 1) que combinen la capacidad de cosechar órganos periféricos y del SNC para el análisis; 2) los métodos son adaptables para la citometría de flujo, para mediciones de respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, junto con tituladores virales en el mismo animal en el mismo órgano; 3) la técnica de cosecha es adaptable para el análisis histológico; 4) el ZIKV FFA es un método de alto rendimiento rápido para el análisis de titer viral; y 5) estos métodos pueden aplicarse a la evaluación de tituladores virales en los órganos de animales infectados con la mayoría de los patógenos25.

<table><tbody><tr><td>1-bromo-3-cloropropano (BCP)</td><td>MRC gen</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 cc</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific BD 309642</td><td></td></tr><tr><td>aguja de 18 g</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-557-145</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa TB de 1 cc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-16H</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 20 cc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-561-66</td><td></td></tr><tr><td>Molino de bolas de 24 tubos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15 340 163</td><td></td></tr><tr><td>perlas de acero inoxidable de 3,2 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9084634</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Incubadora de cultivo de tejidos</td><td>Nuair</td><td>5800</td><td></td></tr><tr><td>4G2 anticuerpo</td><td>en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de fondo plano de 96 pocillos</td><td>Midsci</td><td>TP92696</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fondo redondo de 96 pocillos</td><td>Midsci</td><td>TP92697</td><td></td></tr><tr><td>Basix 1,5 mL Tubos Eppendorf</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Grapas concentradas de lejía germicida</td><td></td><td>30966CT</td><td></td></tr><tr><td>CTL S6 Analizador CTL</td><td></td><td>CTL S6 Analizador</td><td></td>universal</tr><tr><td>Tijeras de corte curvas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Glucosa media-alta Con 4.500 mg/L de glucosa</td><td>MilliporeSigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (grado de biología molecular)</td><td>MilliporeSigma</td><td>e7023</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>MilliporeSigma</td><td>F0926-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11036-20</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>MilliporeSigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón anti-HRP anticuerpo marcado con HRP</td><td>MilliporeSigma</td><td>8924</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3537-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (grado de biología molecular)</td><td>MilliporeSigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de ketamina/xilacina</td><td>Medicina comparativa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>MilliporeSigma</td><td>g7513</td><td></td></tr><tr><td>Magmax RNA kit de purificación</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1830</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>MilliporeSigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Ependorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MiniCollect 0,5 mL Tubos EDTA</td><td>Bio-one</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de junta tórica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-403-195</td><td></td></tr><tr><td>Un paso q Mezcla RT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4392938</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EMS- 15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>MilliporeSigma</td><td>d8537-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas multicanal Proline</td><td>Sartorius</td><td>72230/72240</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas monocanal Proline</td><td>Sartorius</td><td>728230</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de ARNasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol BD</td><td>MRC gen</td><td>RB192</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma oscilante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-676-333</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher</td><td>MT10040CV</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>MilliporeSigma</td><td>s7900</td><td></td></tr><tr><td>Cuchara/espátula</td><td>Fine Science Tools</td><td>10090-17</td><td></td></tr><tr><td>Recto tijeras de corte</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MilliporeSigma</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>True Blue Substrate</td><td>VWR</td><td>95059-168</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>MilliporeSigma</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y cuantificación del virus del zika de múltiples órganos en un ratón

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Los métodos que se presentan demuestran procedimientos de laboratorio para el aislamiento de órganos de animales infectados por el virus del Zika y la cuantificación de la carga viral. El objetivo del procedimiento es cuantificar los lanzadores virales en áreas periféricas y del SNC del ratón en diferentes momentos posteriores a la infección o en diferentes condiciones experimentales para identificar factores virológicos e inmunológicos que regulan la infección por el virus del Zika. Los procedimientos de aislamiento de órganos demostrados permiten tanto la cuantificación del ensayo de formación de enfoque como la evaluación cuantitativa de la PCR de los lanzadores virales. Las técnicas de aislamiento rápido de órganos están diseñadas para la preservación del morte del virus. La cuantificación de los titer virales mediante el ensayo de formación de enfoque permite la evaluación rápida del rendimiento del virus del Zika. El beneficio del ensayo de formación de enfoque es la evaluación del virus infeccioso, la limitación de este ensayo es el potencial de toxicidad de órganos que reduce el límite de detección. La evaluación del titor viral se combina con un PCR cuantitativo, y el uso de un número de copia del genoma viral de control de ARN recombinante dentro del órgano se evalúa con un límite bajo de detección. En general, estas técnicas proporcionan un método preciso de alto rendimiento rápido para el análisis de los lanzadores virales del Zika en la periferia y el SNC de los animales infectados por el virus del Zika y se pueden aplicar a la evaluación de los tituladores virales en los órganos de los animales infectados con la mayoría de los animales infectados con la mayoría patógenos, incluido el virus del dengue.

Para evaluar los lanzadores ziKV utilizando el protocolo descrito anteriormente Ifnar1-/- ratones se infectaron con ZIKV (PRVABC59) mediante inyección subcutánea (SC) en la almohadilla del pie. Aquí, la administración de 1 x 105 FFU de ZIKV a 8-12 semanas de edad Ifnar1-/- ratones SC no es letal, pero el virus puede replicarse tanto en la periferia como en el SNC. Esta dosis y ruta se utilizan para estudiar las respuestas inmunitarias de...

El objetivo del protocolo es demostrar las técnicas utilizadas para investigar la enfermedad viral aislándose y cuantificando el virus del Zika, a partir de múltiples órganos en un ratón después de la infección.

Aislamiento y cuantificación del virus del Zika de múltiples órganos en un ratón

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

En este video describimos un conjunto de procedimientos diseñados para interrogar el impacto de una infección viral y la respuesta inmunológica resultante utilizando un modelo Murine de infección por Zika. Este protocolo es significativo porque nos permite desarrollar una comprensión mecanicista de la infección y la inmunidad identificando hasta qué punto un virus se ha diseminado por todo el cuerpo, transversando barreras físicas y accediendo a los tejidos. Estas técnicas permiten una comprensión detallada de la patogénesis viral y proporcionan la capacidad de diseccionar el mecanismo de protección proporcionado por las vacunas o terapias.Aquí demostramos este método utilizando la infección por el virus del Zika de ratones, pero este método se puede aplicar a una serie de infecciones virales, incluyendo otros flavivirus como el virus del Dengue y alfavirus como el virus Chikungunya. Cosechar los órganos del sistema nervioso central puede ser un desafío, por lo que es importante que una persona planee un pequeño experimento y esté preparada para practicar las técnicas de antemano. Este protocolo permite la rápida disección de la propagación viral dentro de modelos animales pequeños con la capacidad de visualizar, capturar y almacenar datos experimentales.Es importante demostrar visualmente este método para permitir que el experimentador entienda cómo cosechar los órganos del sistema nervioso central. También es importante ver el nivel de confluencia celular y la intensidad de los focos virales. Para comenzar, utilice fórceps para eliminar la piel del ratón infectado.Decapitar la cabeza del ratón con tijeras, seguido de la eliminación de los brazos y las piernas. Para cosechar el cerebro, usa tijeras la Grange serradas para cortar el cráneo a través del foramen magnum. Pelar el cráneo con fórceps, y sacar el cerebro con una espátula.Usando tijeras contundentes fuertes, retire el hueso que rodea la columna vertebral, luego corte a través del hueso pélvico para exponer el foramen vertebral a nivel lumbar. Luego, retire tanto músculo como sea posible que rodea la columna vertebral. Coloque cuidadosamente la punta biselada de la aguja dentro del foramen vertebral, evitando la presión excesiva para evitar que la aguja invada el cuerpo vertebral.Sostenga fuertemente para ejercer presión sobre el cuerpo vertebral y la aguja, y presione el émbolo de la jeringa para expulsar el cable en la placa de petri. Transfiera inmediatamente la médula espinal en el tubo etiquetado y colóquela en el baño de hielo seco para una mayor homogeneización. Para la homogeneización, agregue un mililitro de DMEM y homogeneice la muestra en un BeadBeater.Después de asegurar que los órganos son homogeneizados, centrífugas y muestras de alícuotas en hielo y almacenar en el menos 80 grados Celsius hasta que sea necesario. El día del ensayo, retire las muestras homogeneizadas del congelador de menos 80 grados centígrados y permita que se descongelen. Con las muestras sobre hielo, diluir el virus del Zika diez veces en el primer pozo de la placa de dilución y utilizar una pipeta multicanal para hacer diez veces diluciones seriales por la placa, cambiando las puntas cada vez.Al añadir 20 microlitros de muestra en 180 microlitros de medios de crecimiento, cambie las puntas de pipeta entre cada dilución. Prepare la placa de formación de enfoque quitando el medio de la placa plana preparada de 96 pozos que cubre las virocélulas. Para evitar que la monocapa se seque, añada inmediatamente 100 microlitros de la dilución del virus a cada pocótulo de la viropla.Utilice el mismo conjunto de consejos para añadir de la concentración más baja a la más alta. Placa de roca de lado a lado de dos a cuatro veces e incubar a 37 grados Celsius en 5% dióxido de carbono durante una a dos horas. Calentar 2%metilcelulosa a temperatura ambiente.A continuación, diluir la solución de 2%metilcelulosa en medios de crecimiento en una proporción de aproximadamente dos a uno. Después de la incubación, añadir 125 microlitros de los medios de crecimiento de metilcelulosa a cada pocillo de las placas de 96 pocillos. Incubar de nuevo a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono durante 32 a 40 horas.Para fijar las virocélulas, en un gabinete de bioseguridad añadir 50 microlitros de 5%paraformaldehído sobre la parte superior de la capa de metilcelulosa en cada pozo de las placas de 96 pozos. Incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Alternativamente, cubra las placas con Parafilm y colóquelas a cuatro grados centígrados durante la noche.Después de eso, utilice una pipeta para eliminar la superposición y los medios de las células en un recipiente desechable dentro del gabinete de bioseguridad. Lavar suavemente con 150 microlitros de PBS por pozo. Retire el PBS de las placas y retire la placa del gabinete de bioseguridad.Repita el lavado PBS dos veces, luego agregue 150 microlitros por pozo una vez FFA tampón de lavado y deje a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos para permeabilizar las células fijas. A continuación, utilice el anticuerpo primario de Zika para detectar la infección. Preparar el anticuerpo primario 4G2 a una concentración de un microgramo por mililitro en tampón de tinción FFA.Flick FFA tampón de lavado de las placas, y añadir 50 microlitros del anticuerpo primario en el tampón de tinción FFA a cada pozo. Luego sella las placas con Parafilm, o película de plástico, e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Prepare el anticuerpo antiratón HRP secundario con una concentración de uno a 5.000 en el tampón de tinción FFA.Después de retirar la solución de anticuerpos, lave las células tres veces con 150 microlitros FFA tampón de lavado por pozo. Retire el tampón de lavado moviendo el fregadero cada vez. Manche las células con el anticuerpo secundario en el tampón de tinción FFA a 50 microlitros por pozo e incubar de una a dos horas a temperatura ambiente.Después de eso, lave las células tres veces con el tampón de lavado FFA, de nuevo, quitando el tampón de lavado moviendo el fregadero cada vez. Agregue 50 microlitros del sustrato TrueBlue a cada pozo. Espere de dos a 15 minutos hasta que las manchas estén completamente definidas con un fondo mínimo.Después de que las manchas sean visibles, lave suavemente con agua con una mano para proteger a la monocapa de la fuerza del agua que corre. Toque seco en toallas de papel. Poco después, utilice un ámbito de disección para contar manualmente los puntos de cada pozo o utilice un contador de puntos automatizado.En el software ImmunoCapture, seleccione una dilución con focos fácilmente distinguidos entre 20 y 200 por pozo para cada muestra y calcule el título en unidades formadoras de enfoque por milímetro utilizando el promedio de pozos duplicados. En este experimento, se mostró una carga viral en los tejidos periféricos y del sistema nervioso central después de que los ratones Ifnar recibieran el virus del Zika por vía subcutánea. El límite de detección era de entre 100 y 500 FFU por gramo, basado en el órgano.Al realizar el ensayo de formación de enfoque, los errores técnicos pueden dar lugar a resultados subóptimos. La toxicidad de los órganos, impulsada por una alta concentración de hígado, alteró la sensibilidad del ensayo. Cuando el título viral en el órgano era menor que la toxicidad, el FFA no podía registrar con precisión los títulos virales.Las células renales ilustraron toxicidad con alta concentración de órganos, pero fueron superadas por el título viral a bajas concentraciones de órganos. El pipeteo o lavado vigoroso puede eliminar la monocapa, lo que provoca la pérdida de datos de informes inexactos de los resultados del título. Las fibras o pelos que están presentes en el papel absorbente de banco de laboratorio, pueden contaminar pozos individuales y causar errores significativos si se utiliza un programa de conteo automatizado.La densidad celular es otro problema, que puede afectar dramáticamente el éxito de un ensayo de formación de enfoque. Las células a aproximadamente 60% de confluencia al comienzo del ensayo, en comparación con las células chapadas en 90% de confluencia, mostraron una diferencia dramática que impactó el ensayo de formación de enfoque. La planificación del tamaño y el alcance del experimento para que la recolección de órganos se complete de manera eficiente, es la parte más importante del procedimiento, seguido de iniciar el ensayo de formación de enfoque con células de alta calidad.Este procedimiento se ha utilizado para cuantificar el virus para múltiples familias virales. Este protocolo también se puede adaptar a la mosización de compuestos terapéuticos y cuantificar títulos de anticuerpos neutralizantes. Estas técnicas se utilizan para cuantificar el virus vivo y deben tomarse las medidas de seguridad adecuadas de acuerdo con las directrices establecidas en el BMBL.

isolation-quantification-zika-virus-from-multiple-organs

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El video muestra un procedimiento para cuantificar el virus del Zika en múltiples órganos de ratón a través de un ensayo de formación de foco. El proceso consiste en infectar monocapas de células de mamíferos con homogeneizados de tejido infectado por virus, seguido del uso de metilcelulosa para prevenir la propagación viral. Posteriormente, se emplea la inmunotinción para permitir una cuantificación y medición precisas de la infectividad específica de un órgano.

Ensayo de formación de focos para cuantificar los títulos de virus en los órganos de un ratón infectado

El video muestra la inyección intracerebral de suspensión del virus del Zika en un ratón adulto para inducir neurodegeneración. Un ratón anestesiado se asegura en un marco estereotáxico y se perfora un orificio en el cráneo expuesto para la inyección. Se inyecta una suspensión del virus del Zika en el tejido cerebral. La infección viral causa inflamación, lo que lleva a la neurodegeneración.

Establecimiento de un modelo de neurodegeneración inducida por el virus del Zika en un ratón adulto

El virus del Zika (ZIKV), un patógeno emergente, está relacionado con anomalías del desarrollo fetal y microcefalia. El establecimiento de un sistema eficaz de cultivo de células infecciosas es crucial para los estudios de replicación del ZIKV, así como para el desarrollo de vacunas y fármacos. En este estudio, se ilustran y discuten varios ensayos virológicos relacionados con el ZIKV.

Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la<em&gt; In Vitro</em&gt; Profiláctica Efecto de los interferones

Este protocolo describe la recuperación del virus Zika infeccioso a partir de un clon de ADNc infeccioso de dos plásmidos.

Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone

Aquí se describe un método para el establecimiento de un modelo de microcefalia inducida por virus Zika en ratón. Este protocolo incluye métodos para embrionario, neonatal y adulto etapa inoculación intracerebral del virus Zika.

Establecimiento de modelos de ratón para trastornos neurológicos inducidos por el Virus Zika utilizando estrategias de inyección Intracerebral: embrionario, Neonatal y adulto

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Evaluación de respuestas de células T Zika Virus-específica en Immunoprivileged órganos de ratones- / - Ifnar1 infectados

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Cuantificación de estimulación dependiente de los anticuerpos del Virus Zika en células humanas primarias

El protocolo presentado puede determinar la competencia vectorial de las poblaciones de mosquitos Aedes aegypti para un virus determinado, como el Zika, en un entorno de contención.

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Propagación de virus y cuantificación colorimétrica basada en células

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