Explorar el espacio de secuencia para identificar sitios de unión para proteínas reguladoras que unen el ARN

El protocolo se utiliza para la mutagénesis de saturación de un sitio de unión a proteínas. Si no se conoce el sitio de unión a proteínas, se puede identificar mediante este protocolo. La técnica tiene relevancia para el diagnóstico de la enfermedad y la terapia.

Creo que todo su potencial en ciencias biomédicas aún está por explotarse plenamente. Este método se puede aplicar ampliamente a cualquier proteína o reacción donde las moléculas deseadas se pueden separar de moléculas no deseadas. Asegúrese de que la biblioteca esté correctamente aleatoria y asegúrese de que durante cada paso de unión y separación el enriquecimiento del pliegue de las moléculas deseadas sea alto.

Implica varios pasos y muchos detalles que se demuestran mejor, en lugar de explicarse con palabras. Después de ver este video, usted debe estar cómodo con cómo preparar una biblioteca aleatoria, sintetizar una piscina de ARN inicial, y realizar una reacción de unión para separar las moléculas deseadas y no deseadas para obtener alta afinidad y aglutinantes específicos. En primer lugar, sintetizar la imprimación directa y la imprimación inversa por síntesis química en un sintetizador de ADN.

Además, sintetiza una plantilla de oligonucleótido de biblioteca aleatoria con 31 posiciones aleatorias. En un tubo de PCR, mezcle una plantilla de biblioteca aleatoria de ADN de un micromolar, Imprimación delantera de un micromolar que contiene promotor de la polimerasa de ARN T7 y imprimación inversa, Tris de 20 mililitros a ocho pH, cloruro de magnesio de 1,5 mililares, cloruro de potasio de 50 mililitrolares, albúmina sérica bovina acetilada de 1 microgramos por mililitro, dos unidades de polimerasa Taq y 200 micromolares cada una de dNTP. Configure la máquina PCR con cinco ciclos de desnaturalización, recocido y pasos de extensión, seguido de un ciclo de extensión para adjuntar al promotor a la biblioteca de ADN.

Configure una reacción de transcripción de 100 microlitros que contenga tampón de transcripción T7, ADN de grupo de biblioteca aleatoria de un micromolar, TDT de cinco milímetros, GTP de dos milímetros, un milimotor cada uno de ATP, CTP y UTP, y ARN polimerasa T7 de dos unidades por microlitión. Ahora ponte un escudo de vidrio acrílico y guantes. Introducir radiactividad añadiendo 5 microlitros o menos de UTP alfa-32P en la reacción de transcripción para la autoradiografía.

Incubar la mezcla de reacción en un tubo de microcentrífuga durante dos horas a 37 grados centígrados. Para gel-purificar el ARN, preparar un 10%desnaturalizando gel de poliacrilamida. Cargue muestras en los recipientes del gel.

Exponga el gel a una película de rayos X e identifique la ubicación de las transcripciones en el gel y corte la rodaja de gel. Coloque la rodaja de gel en un tubo centrífugo y rompa en trozos más pequeños con una punta homogeneizadora. Añadir proteinasa K tampón para sumergir las piezas de gel.

Deje el tubo en un encador durante al menos dos horas a temperatura ambiente. A continuación, gire en una microcentrífuga de alta velocidad durante cinco minutos a temperatura ambiente para eliminar los residuos de gel y recuperar la solución tampón. Agregue un volumen igual de fenol-cloroformo en el tubo con el sobrenadante, el vórtice y la centrífuga.

Repita la extracción con fenol-cloroformo una vez más y luego con cloroformo una vez más. A continuación, mezcle la fase acuosa del tampón de la proteinasa K con un volumen de 1/10 de acetato de sodio de tres molares a pH 5,2, 10 microgramos de ARN o 20 microgramos de glucógeno, y de dos a tres volúmenes de etanol almacenados a menos 20 grados centígrados. Deje el tubo a menos 80 grados centígrados durante una hora.

Gire el tubo que contiene la solución durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante cuidadosamente, y agregue 70%etanol para enjuagar el pellet de ARN. Gira de dos a cinco minutos.

Aspirar el etanol cuidadosamente y secar al aire el pellet de ARN. A continuación, añadir 50 microlitros de agua tratada con DEPC para solubilizar el pellet de ARN. Deje la muestra a menos 20 grados centígrados para su almacenamiento.

Para unir proteínas y ARN en un volumen de reacción de 100 microlitros, Preparar primero el clorhidrato de Tris de 10 mililitros a pH 7,5 que contenga cloruro de potasio de 50 mililitros, TDT de un mililar, albúmina sérica bovina de 09 microgramos por microlitro, 5 unidades por microlitro de ARN, tRNA de 15 microgramos por microlitro y EDTA de un mililo. A continuación, agregue 30 microlitros de proteína recombinante PTB y 10 microlitros de ARN de la piscina adecuada. Coloque los tubos que contienen las reacciones de unión en un bloque de temperatura durante unos 30 minutos a 25 grados centígrados.

A continuación, fraccionar el ARN enlazado del ARN sin enlazar a través de cuatro rondas de selección y amplificación. En primer lugar, filtre la muestra de 100 microlitrotro a temperatura ambiente a través de un filtro de nitrocelulosa unido a un colector de vacío. El complejo ARN-proteína permanece en el filtro.

Con una cuchilla de afeitar estéril, corte el filtro en fragmentos e insértelos en un tubo centrífugo. Sumerja las piezas del filtro en el tampón de la proteinasa K y colóquelo en un vaso durante un mínimo de tres horas o durante la noche para recuperar el ARN. Para desproteinizar la muestra de ARN, agregue un volumen igual de fenol-cloroformo, vórtice y luego centrifugar a alta velocidad durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Obtener la fase acuosa, y extraer con cloroformo de nuevo. Después de eso, mezclar el sobrenadante con 1/10 volumen de acetato de sodio de tres molares a pH 5.2 y dos a tres volúmenes de etanol absoluto. Deje el tubo en un congelador de menos 80 grados Celsius durante 30 minutos, y luego centrifugarlo a alta velocidad durante 10 minutos.

Repita los pasos de lavado y secado con 70% de etanol, y solubilizar el ARN en agua tratada con DEPC. Después de la primera ronda de ensayo de encuadernación de filtros, realice tres rondas más. A continuación, realice dos rondas de transcripción, unión y amplificación para separar las fracciones de ARN unidas a proteínas de las fracciones no enlazadas.

Prefabricar un gel nativo de poliacrilamida al 5% con una relación entre acrilamida y bis-acrilamida 60 a uno en tampón TBE 5x. A continuación, configure la reacción de unión a ARN-proteína. Coloque el gel en un dispositivo de electroforesis lleno de tampón TBE 5x en una sala fría a cuatro grados centígrados.

Aplicar 250 voltios durante 15 minutos, y pipetear la reacción de unión en diferentes pozos. A continuación, fraccionar aún más el ARN enlazado del ARN no unido ejecutando la electroforesis a 250 voltios durante una a dos horas. A continuación, exponga el gel a una película de rayos X e identifique la ubicación del ARN enlazado mediante autoradiografía.

Corte la rodaja de gel con el ARN encuadernado e insértelo en un tubo. Aplastar la rodaja de gel, e incubar en el tampón de la proteinasa K durante tres horas o durante la noche. Repita la extracción con fenol-cloroformo y cloroformo como se describió anteriormente.

Sintetizar cDNA del ARN disuelto. Preparar 20 microlitros de reacción, incluyendo dos microlitros de 10x tampón RT, dos microlitros de la transcriptasa inversa AMV, un microlitros de imprimación inversa, cinco microlitros de agua y 10 microlitros del ARN disuelto. Incubar a 42 grados centígrados durante 60 minutos.

Amplifique el ADNc utilizando 20 a 25 ciclos de PCR como se describió anteriormente. Repita el proceso de síntesis de ARN, unión a proteínas y separación de fracciones unidas a proteínas y sin unir. Para analizar la unión a proteínas, utilice el ensayo de desplazamiento de movilidad de gel o el ensayo de unión de filtros para determinar la afinidad y especificidad de unión para las agrupaciones seleccionadas o secuencias individuales dentro de cada grupo.

Utilice la autoradiografía o un imager de fósforo para detectar y cuantificar bandas en la fracción enlazada y la fracción sin enlazar. Continúe el protocolo con clonación y alineación de secuencia. En este estudio, se logró una selección-amplificación exitosa.

La proteína de unión de polipirimidina de mamíferos con una concentración de proteína 300 veces mayor muestra una unión apenas detectable a la secuencia cero de la piscina, pero alta afinidad por la agrupación de secuencias seleccionada. La ampliación de la selección se identificó con éxito en proteínas de unión al ARN con el sitio de unión preferido o de consenso. La adición del PTB recombinante, que se une a un sitio de empalme de tres primos aguas arriba, conduce a la activación del sitio de empalme de tres primos alternativo o descendente.

Por el contrario, la adición de hnRNP C recombinante conduce a la represión de ambos sitios de empalme de tres primos. La adición del factor de empalme general recombinante U2AF65 revirtió la represión del sitio de empalme de tres primos mediado por HnRNP C. Es importante recordar que una buena biblioteca aleatoria y condiciones de encuadernación adecuadas que dan un enriquecimiento de alto pliegue en cada paso de enlace son necesarios para el éxito.

Se pueden utilizar ensayos funcionales adecuados y pruebas in vivo para validar el resultado de este enfoque. En el campo de la expresión génica, se han estudiado las funciones de numerosas proteínas utilizando esta técnica. Es importante usar guantes y sellos radiactivos para protegerse mientras se trabaja con poliacrilamida y radiactividad.