Construcción de Plásmidos CRISPR y Detección de Eficiencia Knockout en Células de Mamíferos a través de un Sistema Dual de Reporteros Luciferase

Este protocolo describe los pasos clave en la generación y optimización de vectores sgRNA eficientes. Nuestra preaceleración del sgRNA candidato apunta al tiempo relativo y la inferencia. La principal ventaja de este protocolo es que permite analizar las impresiones de codificación de ADN para cada uno de los sgRNAs sin editar genes endógenos.

Este método de preselección también se puede aplicar a otras medidas de edición de genes a través de roturas de doble cadena. Comience diluyendo los oligonucleótidos liofilizados a una concentración final de 10 micromolares en agua doble destilada. Mezclar oligonucleótidos hacia delante e inverso en un tubo de PCR de paredes delgadas a una relación uno a uno sin añadir ningún búfer adicional.

Incubar la mezcla a 95 grados centígrados durante cinco minutos, luego bajar la temperatura a 72 grados Celsius durante 10 minutos. Retire la mezcla de oligonucleótidos de la máquina PCR y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Para digerir el vector pX330-xCas9, con Bbs1, combine el vector, la enzima y el tampón de digestión en un volumen de 50 microlitros e incubar la reacción a 37 grados centígrados durante dos horas.

Después de realizar la transformación celular, elija de cinco a 10 colonias bacterianas de la placa LB y utilice cada una de ellas para inocular un mililitro de medios LB con 60 miligramos de ampicilina en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, incubar los tubos en una coctelera giratoria durante dos a tres horas. Realizar PCR para la pantalla de plásmidos recombinantes como se describe en el manuscrito de texto, a continuación, ejecutar los productos en un 2%Agarose gel de menos de 10 voltios por centímetro.

Después de identificar los plásmidos positivos, utilícelos, junto con un vector reportero, para co-transfecar una línea celular apropiada. Para anlicer las células, elimine el medio de crecimiento de las células cultivadas. Lave suavemente la superficie del recipiente de cultivo con PBS y prescinda 100 microlitros de PLB en cada pozo de cultivo para cubrir completamente la capa mono celular.

Deje que la placa se incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, luego transfiera el izado a un tubo o vial para su posterior manipulación o almacenamiento. Para realizar el ensayo de luciferasa dual, programe los luminómetros para proporcionar un retardo de dos segundos de lectura previa seguido de un período de medición de 10 segundos. A continuación, dispensar 100 microlitros de reactivo de ensayo de luciferasa en el número adecuado de tubos luminómetros.

Agregue cuidadosamente 20 microlitros de lisado celular en el tubo del luminómetro y mezcle pipeteando dos o tres veces. Coloque el tubo en el luminómetro e inicie la lectura. Retire el tubo de muestra del luminómetro.

Añadir 100 microlitros de reactivo de parada y vórtice brevemente para mezclar. Devuelva la muestra al luminómetro e inicie la lectura. Registre la actividad de Renilla Luciferase, normalizada a la actividad de Firefly Luciferase, específicamente la recíproca de la relación mostrada en la pantalla.

Deseche el tubo de reacción cuando haya terminado. Este método se utilizó para generar tres vectores sgRNA para ovejas DKK2 Exon 1. SgRNA y xCas9 que expresan vectores fueron construidos pre-digerir la columna vertebral vectorial seguida de ligarla en una serie de fragmentos cortos de ADN de doble cadena a través de pares de oligo recocidos.

Siete colonias bacterianas fueron examinadas con PCR guiado de par de imprimación específica y se detectaron las colonias positivas. El gen que apunta a las capacidades de pX330-xCas9 T1, T2 y T3 se detectó simultáneamente con el ensayo de luciferasa dual. El último vector sgRNA mostró la señal de detección más alta y posteriormente se utilizó para la investigación de edición de genes de ovejas.

Siguiendo este protocolo, se puede realizar un ensayo T7EI o un ensayo Ribonuclease. Estas medidas adicionales dan impresiones más precisas de la edición de genes endógenos.