Construcción de Plásmidos CRISPR y Detección de Eficiencia Knockout en Células de Mamíferos a través de un Sistema Dual de Reporteros Luciferase
5 de diciembre de 2020
Aquí, presentamos un protocolo que describe un método simplificado para la generación eficiente de plásmidos que expresa tanto la enzima CRISPR como el ARN guía único asociado (sgRNAs). La coexistencia de células de mamíferos con este vector sgRNA/CRISPR y un vector reportero de luciferasa doble que examina la reparación de rotura de doble hebra permite evaluar la eficiencia de la eliminatoria.
Este protocolo describe los pasos clave en la generación y optimización de vectores sgRNA eficientes. Nuestra preaceleración del sgRNA candidato apunta al tiempo relativo y la inferencia. La principal ventaja de este protocolo es que permite analizar las impresiones de codificación de ADN para cada uno de los sgRNAs sin editar genes endógenos.
Este método de preselección también se puede aplicar a otras medidas de edición de genes a través de roturas de doble cadena. Comience diluyendo los oligonucleótidos liofilizados a una concentración final de 10 micromolares en agua doble destilada. Mezclar oligonucleótidos hacia delante e inverso en un tubo de PCR de paredes delgadas a una relación uno a uno sin añadir ningún búfer adicional.
Incubar la mezcla a 95 grados centígrados durante cinco minutos, luego bajar la temperatura a 72 grados Celsius durante 10 minutos. Retire la mezcla de oligonucleótidos de la máquina PCR y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Para digerir el vector pX330-xCas9, con Bbs1, combine el vector, la enzima y el tampón de digestión en un volumen de 50 microlitros e incubar la reacción a 37 grados centígrados durante dos horas.
Después de realizar la transformación celular, elija de cinco a 10 colonias bacterianas de la placa LB y utilice cada una de ellas para inocular un mililitro de medios LB con 60 miligramos de ampicilina en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, incubar los tubos en una coctelera giratoria durante dos a tres horas. Realizar PCR para la pantalla de plásmidos recombinantes como se describe en el manuscrito de texto, a continuación, ejecutar los productos en un 2%Agarose gel de menos de 10 voltios por centímetro.
Después de identificar los plásmidos positivos, utilícelos, junto con un vector reportero, para co-transfecar una línea celular apropiada. Para anlicer las células, elimine el medio de crecimiento de las células cultivadas. Lave suavemente la superficie del recipiente de cultivo con PBS y prescinda 100 microlitros de PLB en cada pozo de cultivo para cubrir completamente la capa mono celular.
Deje que la placa se incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, luego transfiera el izado a un tubo o vial para su posterior manipulación o almacenamiento. Para realizar el ensayo de luciferasa dual, programe los luminómetros para proporcionar un retardo de dos segundos de lectura previa seguido de un período de medición de 10 segundos. A continuación, dispensar 100 microlitros de reactivo de ensayo de luciferasa en el número adecuado de tubos luminómetros.
Agregue cuidadosamente 20 microlitros de lisado celular en el tubo del luminómetro y mezcle pipeteando dos o tres veces. Coloque el tubo en el luminómetro e inicie la lectura. Retire el tubo de muestra del luminómetro.
Añadir 100 microlitros de reactivo de parada y vórtice brevemente para mezclar. Devuelva la muestra al luminómetro e inicie la lectura. Registre la actividad de Renilla Luciferase, normalizada a la actividad de Firefly Luciferase, específicamente la recíproca de la relación mostrada en la pantalla.
Deseche el tubo de reacción cuando haya terminado. Este método se utilizó para generar tres vectores sgRNA para ovejas DKK2 Exon 1. SgRNA y xCas9 que expresan vectores fueron construidos pre-digerir la columna vertebral vectorial seguida de ligarla en una serie de fragmentos cortos de ADN de doble cadena a través de pares de oligo recocidos.
Siete colonias bacterianas fueron examinadas con PCR guiado de par de imprimación específica y se detectaron las colonias positivas. El gen que apunta a las capacidades de pX330-xCas9 T1, T2 y T3 se detectó simultáneamente con el ensayo de luciferasa dual. El último vector sgRNA mostró la señal de detección más alta y posteriormente se utilizó para la investigación de edición de genes de ovejas.
Siguiendo este protocolo, se puede realizar un ensayo T7EI o un ensayo Ribonuclease. Estas medidas adicionales dan impresiones más precisas de la edición de genes endógenos.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Visión general
Este protocolo describe un método simplificado para generar plásmidos que expresan la enzima CRISPR y el ARN guía único (sgRNA) asociado. Permite la evaluación de la eficiencia del knockout mediante la co-transfección con un vector informador de luciferasa dual.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Edición genética
- Tecnología CRISPR
- Construcción de plásmidos
Antecedentes
- La generación eficiente de vectores sgRNA es crucial para la edición genética.
- El protocolo permite el análisis de impresiones de codificación de ADN sin editar genes endógenos.
- La preselección de objetivos de sgRNA puede mejorar la eficiencia de la edición.
- Este método puede aplicarse a varias medidas de edición genética.
Propósito del estudio
- Proporcionar un protocolo para generar vectores sgRNA eficientes.
- Facilitar el análisis de la efectividad de sgRNA en la edición genética.
- Simplificar el proceso de evaluación de la eficiencia del knockout.
Métodos utilizados
- Dilución de oligonucleótidos liofilizados a una concentración final de 10 micromolares.
- Mezcla de oligonucleótidos directos y reversos en un tubo de PCR.
- Co-transfección de células de mamífero con vector sgRNA/CRISPR y vector informador.
- Evaluación de la eficiencia de reparación de roturas de doble cadena.
Principales resultados
- El protocolo permite la generación eficiente de vectores sgRNA.
- La eficiencia del knockout puede evaluarse efectivamente.
- La preselección de objetivos de sgRNA mejora el proceso de edición.
- El método es aplicable a otras estrategias de edición genética.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un enfoque confiable para generar vectores sgRNA.
- Facilita el análisis de la edición genética sin alterar los genes endógenos.
- El método puede adaptarse para varias aplicaciones en la edición genética.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Efficient sgRNA vector construction and rapid knockout efficiency assessment are critical for accelerating CRISPR-based target validation in early discovery pipelines. The dual luciferase reporter system enables quantitative, pre-endogenous screening of candidate sgRNAs, reducing time and resource expenditure before full-scale gene editing. This workflow supports portfolio triage by prioritizing sgRNAs with the highest editing potential for downstream applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid preselection of sgRNAs with high editing efficiency before endogenous gene targeting.
- Supports functional target validation by quantifying double-strand break repair via reporter assays.
- Reduces mechanistic ambiguity by isolating sgRNA performance in a controlled system.
- Facilitates predictive confidence in CRISPR reagent selection for subsequent studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, quantitative readout for sgRNA activity using dual luciferase ratios.
- Improves assay reproducibility and comparability across candidate sgRNAs.
- Enables scalable screening of multiple sgRNA constructs in parallel.
- Prepares validated sgRNA/CRISPR vectors for downstream gene editing workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sgRNA selection with translational goals by ensuring only high-efficiency reagents advance.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by minimizing failed edits in disease-relevant models.
- De-risks preclinical studies by front-loading sgRNA efficacy assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling efficient sgRNA selection prior to endogenous gene editing and downstream functional studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway interrogation by enabling rapid sgRNA efficacy screening.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible luciferase-based outputs for sgRNA comparison.
- Analytics: Provides normalized dual luciferase ratios to objectively rank sgRNA performance.
- Translational Research: Ensures only validated, high-performing sgRNAs progress to disease-relevant or preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for sgRNA validation across multiple gene targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in CRISPR reagent selection.
- Operational Value: Standardizes sgRNA screening and accelerates vector construction timelines.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by prioritizing high-efficiency sgRNAs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and reduces late-stage failure due to ineffective gene editing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell transfection, and luciferase assay execution.
- Needs access to PCR, gel electrophoresis, and luminometer instrumentation.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and data normalization.
- Adaptable to various mammalian cell lines and gene targets with appropriate optimization.
- Dependent on accurate oligonucleotide design and vector preparation for reproducible results.
