Name: En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Aprende a evaluar variantes missense en genes humanos asociados a enfermedades usando Drosophila melanogaster in vivo. Este método permite diagnosticar enfermedades raras y estudiar mecanismos de proteínas de forma rápida y económica.

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Agradecemos a José Salazar, Julia Wang y a la Dra. Karen Schulze por la lectura crítica del manuscrito. Reconocemos a los Doctores Ning Liu y Xi Luo por la caracterización funcional de las variantes TBX2 discutidas aquí. El Centro de Detección de Organismos Modelo de la Red de Enfermedades No Diagnosticadas fue apoyado a través del Fondo Común de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (U54 NS093793). H. T. C. fue apoyado además por el NIH[CNCDP-K12 y NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of Neurology (Neuroscience Research grant), Burroughs Wellcome Fund (Career Award for Medical Scientists), Child Neurology Society and Child Neurology Foundation ( PERF Elterman), y el Premio de La Independencia Temprana del Director de los NIH (DP5 OD026426). M. F. W. fue apoyado por la Fundación Simons (Premio SFARI: 368479). S. Y. fue apoyado además por el NIH (R01 DC014932), la Simons Foundation (Premio SFARI: 368479), la Asociación de Alzheimer (New Investigator Research Grant: 15-364099), Naman Family Fund for Basic Research, y Caroline Wiess Law Fund for Research in in Medicina Molecular. La microscopía confocal de BCM es apoyada en parte por NIH Grant U54HD083092 al Núcleo de Neurovisualización del Centro de Investigación de Discapacidades Intelectuales y del Desarrollo (IDDRC).

Los autores no tienen nada que revelar.

Los estudios experimentales con Drosophila melanogaster proporcionan un sistema de ensayo robusto para evaluar las consecuencias de las variantes humanas asociadas a la enfermedad. Esto se debe a la gran cantidad de conocimiento y diversas herramientas genéticas que han sido generadas por muchos investigadores en el campo de la mosca durante el siglopasado 89. Al igual que cualquier otro sistema experimental, sin embargo, es importante reconocer las advertencias y limitaciones que existen...

Los pacientes con enfermedades raras a menudo se someten a un arduo viaje conocido como la "odisea diagnóstica" para obtener un diagnóstico preciso1. Se cree que la mayoría de las enfermedades raras tienen un fuerte origen genético, lo que hace que los análisis genéticos/genómicos sean elementos críticos del estudio clínico. Además de la secuenciación de paneles genéticos candidatos y el análisis de variación de los números de copia basados en microarrays cromosómicos, las tecnologías de secuenciación de todo el exónmio (WES) y de secuenciación del genoma completo (WGS) se han convertido en herramientas cada vez más valiosas en la última década2, 3. Actualmente, la tasa de diagnóstico para la identificación de una variante patógena conocida en WES y WGS es de 25% (mayor en casos pediátricos)4,5. Para la mayoría de los casos que permanecen sin diagnosticar después del WES/WGS clínico, un problema común es que hay muchos genes y variantes candidatas. La secuenciación de próxima generación a menudo identifica variantes novedosas o ultra raras en muchos genes, y la interpretación de si estas variantes contribuyen a los fenotipos de la enfermedad es un reto. Por ejemplo, aunque se cree que la mayoría de las mutaciones sin sentido o en marcadas en los genes son alelos de pérdida de función (LOF) debido a la descomposición mediada por tonterías de la transcripción codificada, las mutaciones truncadas encontradas en los últimos exones escapan a este proceso y pueden funcionar como alelos benignos o de ganancia de función (GOF)6.
Por otra parte, predecir los efectos de un alelo de sentido erróneo es una tarea desalentadora, ya que puede dar lugar a una serie de diferentes escenarios genéticos como se describe por primera vez por Herman Muller en la década de 1930 (es decir, amorfo, hipómorfo, hipermorfo, antimorfo, neomorfo o isomorfo)7 . Numerosos programas y metodologías en silico se han desarrollado para predecir la patogenicidad de variantes de mala detección basadas en la conservación evolutiva, el tipo de cambio de aminoácidos, la posición dentro de un dominio funcional, la frecuencia del alelo en la población general, y otros parámetros8. Sin embargo, estos programas no son una solución integral para resolver el complicado problema de la interpretación de variantes. Curiosamente, un estudio reciente demostró que cinco algoritmos de predicción de patogenicidad variante ampliamente utilizados (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) están de acuerdo en la patogenicidad -80% del tiempo8 . En particular, incluso cuando todos los algoritmos están de acuerdo, devuelven una predicción incorrecta de patogenicidad hasta el 11% del tiempo. Esto no sólo conduce a una interpretación clínica defectuosa, sino que también puede disuadir a los investigadores de dar seguimiento a nuevas variantes al enumerarlas falsamente como benignas. Una forma de complementar la limitación actual del modelado de silico es proporcionar datos experimentales que demuestren el efecto de la función variante in vitro, ex vivo (por ejemplo, células cultivadas, organoides) o in vivo.
Los estudios funcionales in vivo de variantes asociadas a enfermedades raras en MO tienen fortalezas únicas13 y han sido adoptados por muchas iniciativas de investigación de enfermedades raras en todo el mundo, incluyendo la Red de Enfermedades No Diagnosticadas (UDN) en los Estados Unidos y Rare Redes de Modelos y Mecanismos de Enfermedades (RDMM) en Canadá, Japón, Europa y Australia14. Además de estos esfuerzos coordinados para integrar a los investigadores de MO en el flujo de trabajo de diagnóstico de enfermedades raras y estudios mecánicos a escala nacional, una serie de estudios de colaboración individuales entre investigadores clínicos y de MO han llevado al descubrimiento y la caracterización de muchos nuevos genes y variantes causantes de enfermedades humanas82,83,84.
En la UDN, un Centro centralizado de Cribado de Organismos Modelo (MOSC) recibe presentaciones de genes y variantes candidatas con una descripción de la condición del paciente y evalúa si la variante es probable que sea patógena utilizando herramientas informáticas e in vivo Experimentos. En la Fase I (2015-2018) de la UDN, el MOSC comprendía un Núcleo Drosophila [Baylor College of Medicine (BCM)] y Zebrafish Core (Universidad de Oregón) que trabajaba en colaboración para evaluar casos. Utilizando el análisis informático y una serie de estrategias experimentales diferentes en Drosophila y pez cebra, el MOSC ha contribuido hasta ahora al diagnóstico de 132 pacientes, identificación de 31 nuevos síndromes55,descubrimiento de varios nuevos genes de la enfermedad (p. ej., EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) y expansión fenotípica de la enfermedad conocida genes (por ejemplo, CACNA1A21,ACOX122).
Además de los proyectos dentro de la UDN, los investigadores del MOSC Drosophila Core han contribuido a los nuevos descubrimientos genéticos de la enfermedad en colaboración con los Centros de Genómica Mendeliana y otras iniciativas (por ejemplo, ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) utilizando el mismo conjunto de informática y genética estrategias desarrolladas para la UDN. Dada la importancia de los estudios de MO sobre el diagnóstico de enfermedades raras, el MOSC se amplió para incluir un núcleo de C. elegans y un segundo núcleo de pez cebra (ambos en la Universidad de Washington en St. Louis) para la Fase II (2018-2022) de la UDN.
Este manuscrito describe un protocolo de estudio funcional in vivo que se utiliza activamente en el núcleo de Drosophila UDN MOSC para determinar si las variantes de mala detección tienen consecuencias funcionales en la proteína de interés utilizando moscas transgénicas que expresan Proteínas. El objetivo de este protocolo es ayudar a los investigadores de MO a trabajar en colaboración con grupos de investigación clínica para proporcionar evidencia experimental de que una variante candidata en un gen de interés tiene consecuencias funcionales, facilitando así el diagnóstico clínico. Este protocolo es más útil en un escenario en el que un investigador de Drosophila es abordado por un investigador clínico que tiene un paciente de enfermedad rara con una variante candidata específica en un gen de interés.
Este protocolo se puede dividir en tres elementos: (1) recopilar información para evaluar la probabilidad de que la variante de interés sea responsable del fenotipo del paciente y la viabilidad de un estudio funcional en Drosophila,(2) herramientas genéticas existentes y el establecimiento de otras nuevas, y (3) realizar estudios funcionales in vivo. El tercer elemento se puede subdividir en dos subelementos en función de cómo se puede evaluar la función de una variante de interés (experimento de rescate o estrategias basadas en sobreexpresión). Es importante tener en cuenta que este protocolo puede adaptarse y optimizarse a muchos escenarios fuera de la investigación de enfermedades monogénicas raras (por ejemplo, enfermedades comunes, interacciones gene-ambiente y pantallas farmacológicas/genéticas para identificar dianas terapéuticas). La capacidad de determinar la funcionalidad y la patogenicidad de las variantes no sólo beneficiará al paciente de interés al proporcionar un diagnóstico molecular preciso, sino que también tendrá impactos más amplios en la investigación científica tanto traslacional como básica.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Stocks para la transgénesis de ADNc UAS-humano</cepas >inyección</td><td></td><td></td><td></td> fuerte</tr> <tr><td>para la transgénesis (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24871</td><td>Reactivo específico: VK33 (3er cromosoma) Línea de inyección</td></tr><tr><td>Cepas de inyección para la transgénesis (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24872</td><td>Reactivo específico: VK37 (2º cromosoma) Línea de inyección</td></tr><tr><td><> < vector ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>clonación</td> fuerte <td>Thermo Fisher</td><td>#12536-017</td><td>Reactivo específico: pDONR221</td></tr><tr><td>Drosophila vector de transgénesis</td><td>Regalo de los Dres. Johannes Bischof y Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS)</td><td></td><td>Reactivo específico: pGW-HA.attB</td></tr><tr><td>Kits y reactivos de biología molecular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A2790</td><td>Reactivo específico: Agarosa (grado de biología molecular)</td></tr><tr><td>Células químicamente competentes (E. coli)</td><td>Thermo Fisher</td><td>#18265017</td><td>Reactivo específico: DH5&alpha;</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel de ADN</td><td>Reactivo</td> <td>específico #K210012</td> Thermo Fisher<td>: Kit de extracción de gel PureLink</td></tr><tr><td>Kit de aislamiento y purificación de ADN</td><td>Qiagen</td><td>#27104</td><td>Reactivo específico: QIAprep Spin Miniprep Kit</td></tr><tr><td>de polimerasa de alta fidelidad</td><td>NEB</td><td>#M0491</td><td>Reactivo específico: Q5 Kit de polimerasa</td></tr><tr><td>Sistema de clonación mediado por recombinasa</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11789020</td><td>Reactivo específico: Kit de clonasa Gateway BP</td></tr> Sistema <tr><td>de clonación mediado por recombinasa</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11791100</td><td>Reactivo específico: Kit de enzimas Gateway LR Clonasa II</td></tr><tr><td>Kit de mutagénesis dirigida al sitio</td><td>Agilent</td><td>#200523</td><td>Reactivo específico: Kit de mutagénesis Quick Change</td></tr> <tr><td>II<Equipo relacionado con > electrorretinograma fuerte</análisis</td> ><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ERG</td> fuerte<td>Dispositivos moleculares</td><td>N/A</td><td>Reactivo específico: Axon pCLAMP 10 Data Paquete de software Recopilación</td></tr> de <tr><td>datos ERG</td><td>LabX</td><td>#R150358</td><td>Reactivo específico: Amplificador biológico aislado ISO-DAM</td></tr><tr><td>Estimulador ERG</td><td>Astro-Med</td><td>#S48</td><td>Reactivo específico: Estimulador de pulso cuadrado</td></tr></tbody></table>

en vivo estudio funcional de variantes humanas raras asociadas a la enfermedad usando drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Los avances en la tecnología de secuenciación han hecho que los conjuntos de datos de genoma completo y de exoma completo sean más accesibles tanto para el diagnóstico clínico como para la investigación en genética humana de vanguardia. Aunque se han desarrollado varios algoritmos in silico para predecir la patogenicidad de las variantes identificadas en estos conjuntos de datos, los estudios funcionales son críticos para determinar cómo las variantes genómicas específicas afectan la función proteica, especialmente por tener un sentido erróneo Variantes. En la Red de Enfermedades No Diagnosticadas (UDN) y otros consorcios de investigación de enfermedades raras, organismos modelo (MO) incluyendo Drosophila, C. elegans,pez cebra y ratones se utilizan activamente para evaluar la función de la enfermedad humana putativa Variantes. Este protocolo describe un método para la evaluación funcional de variantes humanas raras utilizadas en el Centro de Detección de Organismos Modelo Drosophila Core de la UDN. El flujo de trabajo comienza con la recopilación de información humana y MO de múltiples bases de datos públicas, utilizando el recurso web MARRVEL para evaluar si la variante es probable que contribuya a la condición de un paciente, así como diseñar experimentos eficaces basados en disponibles conocimientos y recursos. A continuación, se generan herramientas genéticas (por ejemplo, líneas de ADNc humanos T2A-GAL4 y UAS) para evaluar las funciones de las variantes de interés en Drosophila. Tras el desarrollo de estos reactivos, se pueden realizar ensayos funcionales de dos puntas basados en experimentos de rescate y sobreexpresión para evaluar la función de las variantes. En la rama de rescate, los genes de la mosca endógena se "humanizan" reemplazando el gen de la Drosophila ortopéloga por transgenes humanos de referencia o variante. En la rama de sobreexpresión, las proteínas humanas de referencia y variante se impulsan exógenamente en una variedad de tejidos. En ambos casos, cualquier fenotipo escorable (por ejemplo, letalidad, morfología ocular, electrofisiología) se puede utilizar como lectura, independientemente de la enfermedad de interés. Las diferencias observadas entre los alelos de referencia y de variante sugieren un efecto específico de la variante, y por lo tanto probablemente la patogenicidad. Este protocolo permite evaluaciones rápidas e in vivo de variantes putativas causantes de enfermedades humanas de genes con funciones conocidas y desconocidas.

Estudio funcional de la variante de novo Missense en EBF3 Vinculado a Fenotipos de Neurodesarrollo En un hombre de 7 años con fenotipos de neurodesarrollo incluyendo hipotonía, ataxia, retraso del desarrollo global y trastorno expresivo del habla, médicos y genetistas humanos en el Proyecto de Institutos Nacionales de Enfermedades No Diagnosticadas de Salud (UDP) identificó una variante de olfato de novo (p.R163Q) en EBF3 (Early B-Cell Factor 3)15, un...

El objetivo de este protocolo es esbozar el diseño y la realización de experimentos in vivo en Drosophila melanogaster para evaluar las consecuencias funcionales de las variantes genéticas raras asociadas con las enfermedades humanas.

En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Este protocolo nos permite determinar si las variantes de falta de sentido en los genes humanos que están vinculadas a enfermedades afectan la función proteica. Esto es difícil de lograr computacionalmente incluso con algoritmos de última generación. Esta técnica permite un análisis rápido de las variantes de missenidad en proteínas humanas utilizando un sistema in vivo Drosophila melanogaster que es más rápido y más rentable que los organismos modelo vertebrados.Demostrar que una variante específica afecta la función proteica contribuye directamente al diagnóstico de enfermedades raras y sirve como punto de partida para el análisis del mecanismo de la enfermedad y las terapias potenciales. Este protocolo es particularmente útil cuando se estudian variantes relacionadas con enfermedades raras, pero se puede aplicar a enfermedades más comunes como el autismo y el cáncer. Identificar fenotipos reproducibles en moscas que reflejen la función proteica puede ser un desafío.Los fenotipos pueden variar de un gen a un gen y pueden ser sutiles. Los estudios funcionales de variantes en proteínas humanas que utilizan Drosophila se pueden realizar sobre la base de experimentos de rescate o estudios de sobreexpresión. Antes de comenzar el procedimiento, recopile información sobre el gen humano de interés y sus ortologos del organismo modelo.Para probar la función variante mediante la sobreexpresación de proteínas humanas de referencia y variantes en el sistema visual de la mosca, generar moscas transgénicas que expresen la referencia o variante de los cDNAs humanos de interés bajo el control de la secuencia de activación ascendente Gal4 o el sistema UAS. Para seleccionar una línea específica Gal4 para expresar las proteínas humanas en un tejido de mosca específico, cruce de tres a cinco hembras vírgenes de la línea Gal4 con tres a cinco machos de cada una de las líneas transgénicas de ADNc humanos de la UAS en viales individuales o en duplicados. Transfiera las cruces cada dos o tres días para obtener el mayor número posible de animales que se crucen de una sola cruz y examine el animal eclosed bajo un microscopio de disección para identificar cualquier diferencia entre las cepas de referencia y variantes.Si hay un defecto visible, imagine las moscas para documentar los fenotipos. Para generar moscas para probar defectos funcionales en el sistema visual, cruce hembras vírgenes de la línea rhodopsin 1 Gal4 a los machos con referencia o variante UAS humano cDNA transgenes para expresar las proteínas humanas de interés en los fotorreceptores R1 a R6 en la retina de la mosca. Una vez que las moscas comiencen a eclose, recoja la progenie en viales frescos y devuelva los viales a una incubadora ajustada a la temperatura experimental adecuada durante tres días adicionales para permitir que el sistema visual madure.Al final de la incubación, inmovilizar las moscas con un método de anestesia adecuado y pegar suavemente un lado de cada mosca en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Después de instalar una plataforma de electroretinograma, coloque un capilar de vidrio de 1,2 milímetros en un tirador de aguja y rompa el tubo capilar para obtener dos electrodos cónicos huecos afilados con diámetros inferiores a 0,5 milímetros. Llene los capilares con 100 solución salina milimétrica teniendo cuidado de evitar burbujas de aire y deslice los capilares de vidrio sobre los electrodos de alambre de plata.Sujete los capilares en su lugar y aclimate a las moscas para completar la oscuridad durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la habituación, coloque la diapositiva que contiene las moscas sobre el aparato de grabación y mueva los micromanipuladores que llevan los electrodos de referencia y grabación cerca de la mosca de interés. Observando la punta del electrodo, coloque cuidadosamente el electrodo de referencia en el tórax de la mosca penetrando la cutícula y coloque el electrodo de grabación en la superficie del ojo.Para grabaciones exitosas de electrorretinogramas, tenga cuidado de aplicar una cantidad adecuada de presión al electrodo de grabación para que cause un pequeño hoyuelo sin penetrar en el ojo. Cuando se hayan colocado los electrodos, apague la luz primaria durante tres minutos para volver a aclimatarse a las moscas al ambiente oscuro. Al final del período de re-aclimatación, abra y cierre el obturador una vez por segundo durante 20 segundos registrando los electrorretinogramas de al menos 15 moscas por diapositiva por genotipo por condición utilizando los mismos electrodos.Cuando las grabaciones de las moscas de referencia y variantes estén completas, compare las grabaciones de electrorretinogramas de la referencia, variante y controles para evaluar las diferencias. A continuación, evalúe los datos del electrorretinograma para ver si hay cambios en los transitorios, la despolarización, los transitorios fuera y la repolarización. En este experimento representativo, se realizaron estudios basados en sobreexpresión para TBX2, ya que la referencia humana TBX2 no pudo reemplazar funcionalmente el gen ortólogo de la mosca haciendo imposibles las estrategias basadas en el rescate.Cuando la referencia TBX2 humana se sobreexpresó en el ojo en desarrollo y partes del cerebro usando Gal4 sin ojos, la sobreexpresión resulta en una letalidad de aproximadamente el 85% y una reducción significativa en el tamaño de los ojos. Por el contrario, la variante transgén es menos potente en la causa de la letalidad e induce un fenotipo ocular pequeño utilizando el mismo controlador en condiciones experimentales idénticas, lo que sugiere que la variante afecta a la función proteica. Además, cuando una referencia humana TBX2 se sobreexpresa en los fotorreceptores utilizando rodopsicina Gal4, la sobreexpresión causa una alteración significativa en el rastro del electroretinograma.Este fenotipo es más suave cuando se expresa la proteína variante, proporcionando más evidencia de que la variante de interés afecta la función proteica in vivo. Es importante tener en cuenta que cada gen es único, por lo que no hay un solo experimento que pueda evaluar el impacto de todas las variantes asociadas a la enfermedad. Además de trabajar con cDNas humanos, también se puede determinar si la variante tiene consecuencias funcionales mediante la introducción de variantes análogas en residuos conservados evolutivamente del gen de la mosca ortologosa.Usando este método, hemos contribuido a una serie de estudios de descubrimiento de genes de enfermedades humanas en colaboración con la Red de Enfermedades No Diagnosticadas y otros grupos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este protocolo describe la disección en vivo...

Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas

Se describen aquí los procedimientos para la extracción y purificación de ARNm y metabolitos...

Purificación de las transcripciones y los metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabezales

A continuación, presentamos un enfoque sistemático para desarrollar fisiológicamente relevante, sensible y...

En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

Presentamos un plan estratégico y un protocolo para identificar variantes genéticas no codificantes que afectan la unión al ADN del factor de transcripción (TF). Se proporciona un protocolo experimental detallado para el análisis del ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) y el ensayo de precipitación de afinidad del ADN (DAPA) de la unión al ADN TF dependiente del genotipo.

La detección de funcional no codificante-variantes genéticas Uso de movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA) y el ADN afinidad Precipitación Ensayo (DAPA)

Este protocolo se muestra cómo generar tumores clonales fluorescente marcada, genéticamente definidos en el ojo de Drosophila / discos imaginales de las antenas (EAD). En él se describe cómo diseccionar el EAD y el cerebro de la tercera fase larvaria y la forma de procesarlos para visualizar y cuantificar cambios de expresión génica y la invasividad tumoral.

los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Aquí, presentamos un protocolo para acceder y analizar muchas bases de datos de organismos humanos y modelo de manera eficiente. Este protocolo demuestra el uso de MARRVEL para analizar las variantes que causan la enfermedad candidata identificadas a partir de los esfuerzos de secuenciación de próxima generación.

Navegando por MARRVEL, una herramienta basada en la Web que integra la genómica humana y la información genética de organismos modelo

Presentamos un protocolo utilizando un enfoque genético directo para la detección de mutantes que exhiben neurodegeneración en Drosophila melanogaster. Incorpora un ensayo de escalada, análisis histológico, mapeo genético y secuenciación de ADN para identificar en última instancia nuevos genes relacionados con el proceso de neuroprotección.

En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster

El sistema ocular de Drosophila es una herramienta útil para estudiar diversos procesos biológicos, en particular las enfermedades neurodegenerativas humanas. Sin embargo, la cuantificación manual de los fenotipos de ojos ásperos puede ser sesgada y poco fiable. Aquí describimos un método por el cual ilastik y Flynotyper se utilizan para cuantificar el fenotipo del ojo de una manera imparcial.

Cuantificación de los fenotipos oculares de Drosophila melanogaster : un enfoque computacional que integra ilastik y flynotyper

Este protocolo describe la forma de evaluar la expresión de una gran variedad de genes a nivel clonal. Una sola célula de RT-qPCR produce resultados altamente fiables con una fuerte sensibilidad para cientos de muestras y los genes.

Una sola célula de la expresión génica utilizando multiplex RT-qPCR para caracterizar heterogeneidad de las poblaciones linfoides Raras

Aprende a evaluar variantes missense en genes humanos asociados a enfermedades usando Drosophila melanogaster in vivo. Este método permite diagnosticar enfermedades raras y estudiar mecanismos de proteínas de forma rápida y económica.

En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

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