En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

Este protocolo nos permite determinar si las variantes de falta de sentido en los genes humanos que están vinculadas a enfermedades afectan la función proteica. Esto es difícil de lograr computacionalmente incluso con algoritmos de última generación. Esta técnica permite un análisis rápido de las variantes de missenidad en proteínas humanas utilizando un sistema in vivo Drosophila melanogaster que es más rápido y más rentable que los organismos modelo vertebrados.

Demostrar que una variante específica afecta la función proteica contribuye directamente al diagnóstico de enfermedades raras y sirve como punto de partida para el análisis del mecanismo de la enfermedad y las terapias potenciales. Este protocolo es particularmente útil cuando se estudian variantes relacionadas con enfermedades raras, pero se puede aplicar a enfermedades más comunes como el autismo y el cáncer. Identificar fenotipos reproducibles en moscas que reflejen la función proteica puede ser un desafío.

Los fenotipos pueden variar de un gen a un gen y pueden ser sutiles. Los estudios funcionales de variantes en proteínas humanas que utilizan Drosophila se pueden realizar sobre la base de experimentos de rescate o estudios de sobreexpresión. Antes de comenzar el procedimiento, recopile información sobre el gen humano de interés y sus ortologos del organismo modelo.

Para probar la función variante mediante la sobreexpresación de proteínas humanas de referencia y variantes en el sistema visual de la mosca, generar moscas transgénicas que expresen la referencia o variante de los cDNAs humanos de interés bajo el control de la secuencia de activación ascendente Gal4 o el sistema UAS. Para seleccionar una línea específica Gal4 para expresar las proteínas humanas en un tejido de mosca específico, cruce de tres a cinco hembras vírgenes de la línea Gal4 con tres a cinco machos de cada una de las líneas transgénicas de ADNc humanos de la UAS en viales individuales o en duplicados. Transfiera las cruces cada dos o tres días para obtener el mayor número posible de animales que se crucen de una sola cruz y examine el animal eclosed bajo un microscopio de disección para identificar cualquier diferencia entre las cepas de referencia y variantes.

Si hay un defecto visible, imagine las moscas para documentar los fenotipos. Para generar moscas para probar defectos funcionales en el sistema visual, cruce hembras vírgenes de la línea rhodopsin 1 Gal4 a los machos con referencia o variante UAS humano cDNA transgenes para expresar las proteínas humanas de interés en los fotorreceptores R1 a R6 en la retina de la mosca. Una vez que las moscas comiencen a eclose, recoja la progenie en viales frescos y devuelva los viales a una incubadora ajustada a la temperatura experimental adecuada durante tres días adicionales para permitir que el sistema visual madure.

Al final de la incubación, inmovilizar las moscas con un método de anestesia adecuado y pegar suavemente un lado de cada mosca en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Después de instalar una plataforma de electroretinograma, coloque un capilar de vidrio de 1,2 milímetros en un tirador de aguja y rompa el tubo capilar para obtener dos electrodos cónicos huecos afilados con diámetros inferiores a 0,5 milímetros. Llene los capilares con 100 solución salina milimétrica teniendo cuidado de evitar burbujas de aire y deslice los capilares de vidrio sobre los electrodos de alambre de plata.

Sujete los capilares en su lugar y aclimate a las moscas para completar la oscuridad durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la habituación, coloque la diapositiva que contiene las moscas sobre el aparato de grabación y mueva los micromanipuladores que llevan los electrodos de referencia y grabación cerca de la mosca de interés. Observando la punta del electrodo, coloque cuidadosamente el electrodo de referencia en el tórax de la mosca penetrando la cutícula y coloque el electrodo de grabación en la superficie del ojo.

Para grabaciones exitosas de electrorretinogramas, tenga cuidado de aplicar una cantidad adecuada de presión al electrodo de grabación para que cause un pequeño hoyuelo sin penetrar en el ojo. Cuando se hayan colocado los electrodos, apague la luz primaria durante tres minutos para volver a aclimatarse a las moscas al ambiente oscuro. Al final del período de re-aclimatación, abra y cierre el obturador una vez por segundo durante 20 segundos registrando los electrorretinogramas de al menos 15 moscas por diapositiva por genotipo por condición utilizando los mismos electrodos.

Cuando las grabaciones de las moscas de referencia y variantes estén completas, compare las grabaciones de electrorretinogramas de la referencia, variante y controles para evaluar las diferencias. A continuación, evalúe los datos del electrorretinograma para ver si hay cambios en los transitorios, la despolarización, los transitorios fuera y la repolarización. En este experimento representativo, se realizaron estudios basados en sobreexpresión para TBX2, ya que la referencia humana TBX2 no pudo reemplazar funcionalmente el gen ortólogo de la mosca haciendo imposibles las estrategias basadas en el rescate.

Cuando la referencia TBX2 humana se sobreexpresó en el ojo en desarrollo y partes del cerebro usando Gal4 sin ojos, la sobreexpresión resulta en una letalidad de aproximadamente el 85% y una reducción significativa en el tamaño de los ojos. Por el contrario, la variante transgén es menos potente en la causa de la letalidad e induce un fenotipo ocular pequeño utilizando el mismo controlador en condiciones experimentales idénticas, lo que sugiere que la variante afecta a la función proteica. Además, cuando una referencia humana TBX2 se sobreexpresa en los fotorreceptores utilizando rodopsicina Gal4, la sobreexpresión causa una alteración significativa en el rastro del electroretinograma.

Este fenotipo es más suave cuando se expresa la proteína variante, proporcionando más evidencia de que la variante de interés afecta la función proteica in vivo. Es importante tener en cuenta que cada gen es único, por lo que no hay un solo experimento que pueda evaluar el impacto de todas las variantes asociadas a la enfermedad. Además de trabajar con cDNas humanos, también se puede determinar si la variante tiene consecuencias funcionales mediante la introducción de variantes análogas en residuos conservados evolutivamente del gen de la mosca ortologosa.

Usando este método, hemos contribuido a una serie de estudios de descubrimiento de genes de enfermedades humanas en colaboración con la Red de Enfermedades No Diagnosticadas y otros grupos.