Control espacial y temporal de la iniciación del melanoma murino a partir de células madre de melanocitos mutantes

El melanoma es ampliamente diagnosticado en todo el mundo, con una incidencia creciente. Estos protocolos permiten controlar cuidadosamente las primeras etapas de iniciación del melanoma, facilitando el estudio de su desarrollo. Al controlar el tiempo y la ubicación de la activación de células madre de melanocitos, tenemos la capacidad de discernir los cambios dentro de la población de células madre y su nueva iniciación de melanoma de cepa.

Demostrando el procedimiento serán Dahihm Kim y Luye An, estudiantes graduados del laboratorio. Dos o tres días antes de comenzar el procedimiento, utilice una recortadora eléctrica para afeitar la piel dorsal de cada ratón anesthetizado de siete semanas de edad. El día del experimento, usa un hisopo de algodón para aplicar una fina capa de crema depilatoria sobre la piel expuesta.

Una vez que la crema se haya aplicado uniformemente, use hisopos de algodón limpios para eliminar la crema, seguidos de una limpieza suave con un paño húmedo para eliminar cualquier crema residual. A continuación, devuelva cada ratón a su jaula de inicio con monitoreo hasta la recuperación completa. Para la irradiación UV-B, cubra la piel dorsal con material protector UV-B para que solo se exponga la región deseada, y cubra la cámara UV con una tapa resistente a los rayos UV.

A continuación, encienda la lámpara UV-B para irradiar el ratón durante el período de tiempo experimental adecuado antes de devolver el ratón a una jaula vacía con supervisión hasta la recuperación completa. Para aislar las muestras de piel, utilice una recortadora eléctrica para eliminar cualquier vello de la zona de la piel dorsal de los ratones irradiados eutanizados, y cepille ligeramente la piel expuesta con un tejido libre de pelusas para limpiar el área. Haga una pequeña incisión con tijeras afiladas justo por encima de la base de la cola e inserte tijeras grandes y contundentes en la incisión para separar los tejidos conectivos subdérmicos.

Usando tijeras afiladas, corte cuidadosamente a lo largo del borde de la región de la piel de interés para aislar la muestra de tejido y colocar el tejido de la piel extirpado en una toalla de papel limpia. Luego usa fórceps apagados para estirar la piel de modo que se adhiera a la toalla y esté tensa. Una vez que todas las muestras hayan sido cosechadas, coloque una muestra de piel y una toalla de papel en un pedazo de papel de filtro doblado inmediatamente adyacente al pliegue, teniendo cuidado de que la muestra esté lisa y no doblada o arrugada.

Cierre los lados del papel de filtro con grapas y recorte el papel. A continuación, sumerja completamente las muestras en formalina tamponada 10% neutral durante tres a cinco horas a temperatura ambiente antes de lavar los tejidos con dos lavados de cinco minutos en agua desionizada. Después del segundo lavado, retire cuidadosamente cualquier material residual de los tejidos de la piel y recorte los bordes de las muestras para que no sean irregulares.

A continuación, realice tres cortes sagitales en cada muestra para que el ancho de las tiras no sea superior a cinco milímetros, y haga cortes transversales para que las muestras no sean más de 20 milímetros de ancho. Coloque un molde crio que contenga una temperatura de corte óptima o un medio OCT en una orientación vertical y coloque de cuatro a cinco piezas de piel encima del OCT. Cuando todas las piezas estén en su lugar, utilice dos pares de fórceps finos para llevar el borde largo de cada pieza de piel a la parte inferior del molde crio para que las muestras sean verticales dentro del OCT y perpendiculares a la base del molde.

A continuación, llene el molde con OCT adicional al segundo labio y coloque el molde sobre una superficie plana de un pedazo de hielo seco, usando fórceps para ajustar las piezas de la piel que puedan haber cambiado durante la transferencia a medida que el bloque comienza a congelarse según sea necesario. Cuando los ratones son siete semanas postnatal, su piel dorsal está en telógeno. Durante el telógeno, folículo piloso y células madre de melanocitos son conocidos por estar en un estado de reposo en reposo, y la piel no debe mostrar un crecimiento significativo del cabello después del afeitado.

La depilación química, sin embargo, puede inducir la activación de las células madre del folículo piloso, induciendo un crecimiento significativo del cabello dentro de la región de interés. Como la depilación química puede inducir significativamente la activación tanto del folículo piloso como de las células madre de melanocitos, las células madre de melanocitos propensas al melanoma en un estado activo pueden formar tumores y la iniciación del melanoma microscópico se puede observar dentro de las dos semanas de la depilación química. La irradiación UV-B también puede inducir la iniciación tumoral a partir de células madre de melanocitos en reposo propensas a tumores.

Es importante destacar que uv-B induce la translocación directa de las células madre de melanocitos desde su nicho de células madre foliculares a la epidermis interfolicular. Además, uv-B puede inducir la formación de melanoma cutáneo originado por células madre de melanocitos a lo largo de la epidermis interfolicular. Al igual que la piel dorsal, la iniciación del melanoma inducido por UV-B se puede observar notablemente en otras áreas de la piel, como la piel del oído.

De hecho, en comparación con el control de la piel del oído, cubierto por un paño resistente a los rayos UV, la piel del oído expuesta a uv-B demuestra una pigmentación más alta debido a una mayor carga de iniciación del melanoma. Diferentes dosis de UV-B pueden tener diferentes efectos sobre la piel del ratón y la actividad de los melanocitos. Por lo tanto, es importante determinar y optimizar la dosis de irradiación antes de comenzar el experimento.