Name: Micromanipulación de células tumorales circulantes para análisis molecular descendente y evaluación potencial metastásica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Aprenda a aislar células tumorales circulantes mediante micromanipulación robótica para análisis molecular de célula única. Este método permite evaluar la capacidad metastásica con alta pureza.

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Agradecemos a todos los pacientes que donaron sangre para nuestro estudio, así como a todos los médicos involucrados y enfermeras de estudio. Agradecemos a Jens Eberhardt, Uwe Birke y la Dra. Katharina Uhlig de ALS Automated Lab Solutions GmbH por su apoyo continuo. Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de aceto por sus comentarios y discusiones. La investigación en el laboratorio de aceto está respaldada por el Consejo Europeo de investigación, la Unión Europea, la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza, la liga suiza contra el cáncer, la Liga de cáncer de Basilea, los dos cantones de Basilea a través de la ETH Zürich, y la Universidad de Basilea.

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N.A. y B.M.S. se enumeran como inventores en las solicitudes de patente relacionadas con células tumorales circulantes y el tratamiento del cáncer. N.A. es un consultor de pago para las compañías farmacéuticas y de seguros con un interés en la biopsia líquida.

La caracterización molecular de los CTCs tiene la promesa de mejorar nuestra comprensión del proceso metastásico y guiar el desarrollo de nuevas terapias contra la metástasis. Aquí proporcionamos una descripción detallada de los protocolos que permiten la micromanipulación CTC y el análisis descendente, incluyendo tanto ensayos funcionales basados en células simples, análisis de expresión génica y trasplante in vivo para potencial metastásico evaluación20.
Entr...

La manifestación clínica de la metástasis en órganos distantes representa la etapa final de la progresión del cáncer y supone más del 90% de las muertes relacionadas con el cáncer1. La transición de la enfermedad localizada a la metastásica es un proceso de varios pasos, a menudo mediado por células tumorales circulantes (CTCS)2,3,4. Estas células son derramadas del tumor primario en la circulación sanguínea y son transportadas a órganos distantes, donde pueden extravasar y establecer lesiones metastásicas5,6. Aunque los tumores sólidos pueden liberar un número relativamente alto de CTCs, la mayoría de los CTCs están destinados a morir, debido a las altas fuerzas de cizallamiento en circulación, la muerte celular mediada por anoikis, el ataque inmune o capacidades limitadas para adaptarse a un microambiente externo7. Por lo tanto, es fundamental establecer herramientas que permitan la disección de las características moleculares de los CTCs que están dotados de capacidad de propagación de metástasis. Estudios preclínicos y clínicos recientes sugieren que la presencia y la cantidad de los grupos de CTCS y CTC individuales se asocia con un resultado peor en pacientes con varios tipos de tumores sólidos8,9,10 , 11 , 12 , 13 , 14 . Los clusters CTC son grupos de dos o más CTCS Unidos entre sí durante la circulación y son más eficientes en la formación de metástasis en comparación con los únicos CTCS3,15,16. Las células dentro de un racimo mantienen una fuerte adherencia de las células celulares a través de los desmosomas y los cruces adherentes, lo que puede ayudar a vencer a los anoikis17,18. Recientemente, observamos que la agrupación de CTCs está ligada a la hipometilación de sitios de Unión para factores de transcripción asociados a la proliferación y a la proliferabilidad, lo que lleva a una mayor capacidad para iniciar con éxito la metástasis19. La disociación del clúster CTC da lugar a la remodelación de sitios clave de enlace y, en consecuencia, a la supresión de su potencial metastásico19. Adicionalmente a los grupos de células cancerosas, los CTCs también pueden asociarse a glóbulos blancos (con mayor frecuencia neutrófilos) para mantener altos niveles de proliferación en circulación y aumentar su capacidad metastásica20. Sin embargo, la biología de los CTCs se entiende sólo en parte y varias preguntas permanecen abiertas, incluyendo las características moleculares subyacentes y las vulnerabilidades de las células individuales y agrupadas.
En los últimos años, se han establecido varias estrategias que explotan los patrones de expresión de superficie celular, así como las propiedades físicas de los CTCs para su aislamiento21,22,23,24, 25. los métodos de aislamiento dependientes del antígeno dependen principalmente de la expresión de la superficie celular de la molécula de adhesión de células epiteliales (epcam)26. El más frecuentemente utilizado y (actualmente) la única plataforma aprobada por la FDA para la enumeración CTC, es el sistema CellSearch, que se basa en un procedimiento de dos pasos para aislar CTCs21. En el primer paso, los componentes de plasma se eliminan por centrifugación, mientras que los CTCs se capturan con ferrofluidos magnéticos acoplados a anticuerpos anti-EpCAM. En el segundo paso, la solución enriquecida con CTC se mancha para las células nucleadas (DAPI-positivas) que expresan citoqueratina (CK)8,18,19, mientras que los glóbulos blancos (WBCs) se identifican utilizando el marcador de panleucocitos CD45. Por último, las celdas capturadas se colocan en una plataforma de cribado integrada y los CTCs se identifican a través de la expresión de EpCAM, CKs y DAPI, mientras que son negativos para CD45. Aunque esto es considerado como el estándar de oro para la enumeración CTC, el análisis molecular descendente es desafiante con esta tecnología debido a las restricciones inherentes en la recuperación CTC. Adicionalmente, dado su procedimiento de aislamiento, CellSearch puede favorecer el enriquecimiento de CTCs con mayores niveles de EpCAM en comparación con los CTCs con una expresión EpCAM menor, debido, por ejemplo, a la heterogeneidad del cáncer27 o a la regulación descendente de los marcadores epiteliales 28,29. Para superar estas limitaciones, han surgido tecnologías independientes del antígeno para el enriquecimiento de los CTCs. Por ejemplo, el CTC-iChip integra la separación hidrodinámica de las células nucleadas, incluidos los CTCs y los glóbulos blancos de los componentes sanguíneos restantes, seguidos de un agotamiento inmunomagnético de los glóbulos blancos etiquetados con anticuerpos, lo que permite la purificación de CTCs no etiquetados y viables en solución25. Además, el hecho de que la mayoría de los CTCS son ligeramente más grandes que los glóbulos rojos (RBCs) o WBCs condujo al desarrollo de tecnologías de enriquecimiento CTC basadas en el tamaño23,30 (por ejemplo, el sistema parsortix (ángulo)) que hace uso de un tecnología basada en microfluidos, que comprende un canal de estrechamiento a través del cassette de separación, que lleva a las células a una brecha terminal de 10, 8, 6,5 o 4,5 μm (diferentes tamaños están disponibles dependiendo del diámetro esperado de las células cancerosas de destino). La mayoría de las células sanguíneas pasan a través de la estrecha brecha, mientras que los CTCs quedan atrapados debido a su tamaño (pero también debido a su menor deformabilidad) y, por lo tanto, se retienen en el cassette. Revertir la dirección del flujo permite la liberación de los CTCs capturados, que están en un Estado viable y adecuados para el análisis descendente. Sin embargo, independientemente del protocolo elegido para el aislamiento de CTC, los procedimientos típicos de post-enriquecimiento todavía producen CTCs que se mezclan con un número relativamente pequeño de glóbulos rojos y glóbulos blancos, lo que hace que el análisis de los CTCs puros o masivos sean un desafío. Para abordar este problema, establecimos un flujo de trabajo que permite la manipulación CTC sin sesgo potencial introducido por los contaminantes de las células sanguíneas. La adición de inmunostato previo, con combinaciones de anticuerpos variables, distingue los CTCs de las células sanguíneas e incluso permite identificar subgrupos CTC con perfiles de expresión de marcadores de superficie distintos. Este procedimiento altamente personalizable puede combinarse más adelante con aplicaciones derivadas específicas.
Aquí, describimos un flujo de trabajo que comienza desde un producto enriquecido CTC (obtenido con cualquier tecnología de enriquecimiento CTC de elección) y combina varios enfoques para obtener información sobre la biología CTC en la resolución de una sola célula. En pocas palabras, nuestro flujo de trabajo permite la identificación de los CTCs únicos, los clústeres CTC y los clústeres CTC-WBC por inmunostenación en vivo, seguidos por la micromanipulación de una sola célula y el análisis descendente utilizando protocolos de cultivo ex vivo , célula única secuenciación, y los ensayos de metástasis in vivo .

<table><tbody><tr><td>Tecnología de señalización celular</td> <td>antihumana EpCAM-AF488</td> clon <td>CST5198</td><td>: VU1D9</td></tr><tr><td>1X DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td>sin calcio, sin magnisio</td></tr><tr><td>6 pocillos Placa de fijación ultra baja</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Antihumano CD45-BV605</td><td>Biolegend</td><td>304041</td><td>clon: HI30</td></tr><tr><td>Anti-humano EGFR-FITC&nbsp;</td><td>Clon de GeneTex</td><td>GTX11400</td><td>: ICR10</td></tr><tr><td>Anti-humano HER2-AF488&nbsp;</td><td>Clon de Biolegend</td><td>324410</td><td>: 24D2</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD45-BV605</td><td>clon de 103139 Biolegend</td><td></td><td>: 30-F11</td></tr><tr><td>BD Vacutainer K2EDTA</td><td>BD</td><td>366643</td><td>para la extracción de sangre humana</td></tr><tr><td>Cell Celector</td><td>ALS</td><td>CC1001</td><td>core unit&nbsp;</td></tr><tr><td>Software CellD</td><td>ALS</td><td></td><td>versión 3.0</td></tr><tr><td>Cultrex PathClear Factor de Crecimiento Reducido BME, Tipo 2</td><td>R& D Systems</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubo 1,3 mL K3EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>41.3395.005</td><td>para extracción de sangre</td></tr><tr><td>de ratón Tubos de PCR</td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>RLT Plus</td><td>Quiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase&nbsp; En inhibidor de ARNasa</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2696</td><td>&nbsp; 1 U/&micro; L&nbsp;</td></tr></tbody></table>

micromanipulación de células tumorales circulantes para análisis molecular descendente y evaluación potencial metastásica

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

La metástasis transmitida por la sangre representa la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer e involucra células tumorales circulantes (CTCs) que tienen éxito en el establecimiento de nuevos tumores en sitios distantes. Los CTCs se encuentran en el torrente sanguíneo de los pacientes como células individuales (CTCs individuales) o como agregados multicelulares (clusters CTC y cúmulos de glóbulos blancos), con este último mostrando una mayor capacidad metastásica. Más allá de la enumeración, el análisis fenotírico y molecular es extraordinariamente importante para diseccionar la biología CTC y para identificar vulnerabilidades accionables. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de un flujo de trabajo que incluye inmunostinalización CTC y micromanipulación, cultura ex vivo para evaluar las capacidades proliferativas y de supervivencia de las células individuales, y los ensayos de formación de metástasis in vivo . Adicionalmente, proporcionamos un protocolo para lograr la disociación de los clústeres CTC en células individuales y la investigación de la heterogeneidad intra-cluster. Con estos enfoques, por ejemplo, cuantificamos con precisión la supervivencia y el potencial proliferativo de los CTCs únicos y las células individuales dentro de los clústeres CTC, lo que nos lleva a la observación de que las células dentro de los clústeres muestran una mejor supervivencia y proliferación en ex vivo en comparación con los únicos CTCS. en general, nuestro flujo de trabajo ofrece una plataforma para diseccionar las características de los CTCS a nivel de célula única, con el objetivo de identificar vías relevantes para la metástasis y una mejor comprensión de la biología CTC.

El flujo de trabajo presentado permite la preparación de CTCs individuales, ya sea desde un único CTCs o separado de los clústeres CTC. Los CTCs de pacientes o ratones portadores de tumores se enriquecen a partir de sangre entera con métodos de enriquecimiento CTC disponibles y luego se tiñen con anticuerpos contra marcadores asociados al cáncer (p. ej., EpCAM, verde) y marcadores específicos de WBC (p. ej., CD45, rojo) (figura 1A ). El producto CTC manchado ...

Aquí, presentamos un flujo de trabajo integrado para identificar rasgos fenotíricos y moleculares que caracterizan las células tumorales circulantes (CTCs). Combinamos la inmunostalización en vivo y la micromanipulación robótica de los CTCs individuales y agrupados con técnicas basadas en una célula para el análisis y la evaluación de la capacidad de la metastasis-siembra.

Micromanipulación de células tumorales circulantes para análisis molecular descendente y evaluación potencial metastásica

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Este protocolo es particularmente relevante porque permite la detección y selección de celdas individuales de un grupo de celdas mixtas para el análisis posterior aguas abajo en una resolución de celda única. La principal ventaja de esta técnica es el potencial de separar las células tumorales circulantes individuales, o CTC, de las células sanguíneas para una gama de análisis que requieren alta pureza. Comience iniciando el software de micromanipulación y encendiendo el micromanipulador.Conecte el micromaniprógrafo al ordenador y haga clic en Conectar e inicializar dispositivo para inicializar el brazo robótico en la etapa del microscopio. Limpie las superficies externas e internas del armario protector con etanol y cierre el armario protector después de cada manipulación de la máquina para poder maniobrar el dispositivo a través del ordenador. Instale un nuevo capilar de vidrio de 20 a 30 micrómetros en el brazo robótico y enjuague el aceite del sistema a través del sistema para eliminar cualquier burbuja en el tubo.Llene el tanque de esterilización uno con 70%etanol, el tanque de esterilización dos con agua estéril libre de nucleasas y el tanque tampón con PBS estéril de Dulbecc

micromanipulation-circulating-tumor-cells-for-downstream-molecular

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Células tumorales circulantes son aislados de la sangre de pacientes con cáncer sin causar daño celular. El aislamiento de las células tumorales se logra usando una superficie bimolecular de E-selectina además de anticuerpos contra marcadores epiteliales. Un recubrimiento de nanotubos específicamente promueve la adhesión de las células cancerosas que resulta en purezas de captura altas.

Rápido aislamiento de células tumorales viables de circulación de muestras de sangre del paciente

Las células tumorales circulantes (CTC) son pronóstico en varios tipos de cáncer metastásico. Este manuscrito describe el sistema de patrón oro CellSearch (CSS) plataforma enumeración CTC y destaca los errores de clasificación errónea comunes. Además, dos protocolos adaptados se describen, por definido por el usuario caracterización marcador de CTCs y CTC enumeración en modelos de ratones preclínicos de metástasis que utilizan esta tecnología.

Adaptación de semiautomatizado de células tumorales circulantes (CTC) Ensayos para aplicaciones clínicas y de investigación preclínica

Se ha demostrado que las células tumorales circulantes (CTC) desempeñan un papel importante en la metástasis tumoral. En este artículo, se describe un método para el aislamiento y la propagación de CTC a partir de la sangre total de un modelo tumoral singénico de ratón con metástasis de carcinoma hepatocelular (CHC).

El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

Un protocolo para utilizar un poli (N-iso propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro recubierto para la captura eficaz y la liberación de respuesta térmica de las células tumorales circulantes viables (CTC) se presenta. Este método permite la captura de CTC de la sangre de los pacientes y la posterior liberación de CTC viables para el cultivo aguas abajo fuera del chip, análisis y caracterización.

Captura y Liberación de viables células tumorales circulantes de la sangre

Describimos el establecimiento de tumores colorrectales ortotópicos mediante la inyección de células tumorales o organoides en el ciego de ratones y el subsiguiente aislamiento de células tumorales circulantes (CTC) de este modelo.

Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Este protocolo es recuperar y preparar dianocitos rara de una mezcla con las células de distintos antecedentes caracterización genética molecular a nivel unicelular. Calidad de ADN es igual a las células no tratadas y permite aplicación unicelular (ambos proyección base y objetivo análisis).

Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.

Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

El cultivo de CTC permite una caracterización funcional más profunda del cáncer, a través del ensayo de la expresión de marcadores específicos, y la evaluación de la resistencia a los medicamentos y la capacidad de colonizar el hígado, entre otras posibilidades. En general, el cultivo de CTC podría ser una herramienta clínica prometedora para la medicina personalizada para mejorar el resultado del paciente.

Líneas celulares tumorales circulantes: una herramienta innovadora para la investigación fundamental y traslacional

El chip microfluídico clínico es una importante técnica de análisis biomédico que simplifica el preprocesamiento clínico de las muestras de sangre de los pacientes y tiñe inmunofluorescentemente las células tumorales circulantes (CTC) in situ en el chip, lo que permite la rápida detección e identificación de una sola CTC.

Plataforma de chip microfluídico clínico para el aislamiento de células tumorales circulantes versátiles

Las células tumorales circulantes (CTC) son fundamentales para el estudio de la progresión y la metástasis del cáncer. Este artículo presenta un protocolo integrado de alto rendimiento para el enriquecimiento de CTC y la secuenciación de CTC única, mejorando la eficiencia de captura y la pureza de CTC al tiempo que reduce la contaminación y los costos de secuenciación, avanzando así en la investigación oncológica de precisión y las aplicaciones clínicas.

Tecnología de clasificación de células tumorales circulantes de alto rendimiento basada en microfluidos y secuenciación de células individuales

Aquí presentamos un protocolo para ilustrar el aislamiento de células cancerosas raras a partir de una muestra artificial que contiene sangre entera y con células de cáncer de pulmón con picos. El protocolo utiliza una plataforma de aislamiento celular semiautomatizada y sin etiquetas. Las células enriquecidas son posteriormente analizadas en busca de mutaciones en los receptores del factor de crecimiento epidérmico mediante PCR digital de gotas.

Perfilado de mutaciones del ADN del receptor del factor de crecimiento epidérmico en células raras circulantes utilizando un sistema de aislamiento celular y PCR digital de gotas

Aprenda a aislar células tumorales circulantes mediante micromanipulación robótica para análisis molecular de célula única. Este método permite evaluar la capacidad metastásica con alta pureza.

Micromanipulación de células tumorales circulantes para análisis molecular descendente y evaluación potencial metastásica

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