Micromanipulación de células tumorales circulantes para análisis molecular descendente y evaluación potencial metastásica

Este protocolo es particularmente relevante porque permite la detección y selección de celdas individuales de un grupo de celdas mixtas para el análisis posterior aguas abajo en una resolución de celda única. La principal ventaja de esta técnica es el potencial de separar las células tumorales circulantes individuales, o CTC, de las células sanguíneas para una gama de análisis que requieren alta pureza. Comience iniciando el software de micromanipulación y encendiendo el micromanipulador.

Conecte el micromaniprógrafo al ordenador y haga clic en Conectar e inicializar dispositivo para inicializar el brazo robótico en la etapa del microscopio. Limpie las superficies externas e internas del armario protector con etanol y cierre el armario protector después de cada manipulación de la máquina para poder maniobrar el dispositivo a través del ordenador. Instale un nuevo capilar de vidrio de 20 a 30 micrómetros en el brazo robótico y enjuague el aceite del sistema a través del sistema para eliminar cualquier burbuja en el tubo.

Llene el tanque de esterilización uno con 70%etanol, el tanque de esterilización dos con agua estéril libre de nucleasas y el tanque tampón con PBS estéril de Dulbecco. Esterilice el capilar dos veces con 70%etanol y reemplace el tanque de esterilización uno por el tanque de esterilización dos para utilizar la función de esterilización para lavar el capilar en agua al menos tres veces. En el software de micromanipulador, inicie un nuevo experimento y seleccione el tipo de experimento de selección en los modos de selección automática y manual.

Configure la bandeja de la cubierta para especificar las posiciones del tanque de esterilización, el tanque de amortiguación y la bandeja de depósito, y establezca la temperatura de los tanques líquidos en la bandeja de depósito seleccionada en cuatro grados centígrados. Coloque una placa de fijación ultrabajo que contenga la solución CTC liberada bajo el microscopio dentro del gabinete de micromaniprógrafo. Retire la tapa de la placa y cierre el armario.

Centrifugar una placa de 384 pozos que contenga 20 microlitros de medio de cultivo CTC por pozo para asegurar que el medio secuestre en la parte inferior de cada pozo y coloque la placa en la primera posición de la bandeja de depósito seleccionada de cuatro grados Celsius. Seleccione manualmente el objetivo del microscopio para la selección y el tiempo de exposición de todos los canales necesarios. Seleccione Mostrar navegador de pozos para visualizar y seleccionar el tipo de placa de recogida.

A continuación, calibre una posición de recogida en el centro del pozo que contiene la solución CTC sin celdas en el centro del campo de visión. Utilice el sensor para tocar suavemente la parte inferior de la placa con un capilar y ajuste la posición de recogida a 0,05 milímetros por encima de la parte inferior de la placa. Baje cuidadosamente el brazo robótico por 10 micrómetros a la vez para evitar dañar el capilar.

Seleccione el tipo de celda y los parámetros de selección. Para el picking de una sola celda, seleccione el modo manual. Utilice el joystick para navegar por el capilar de vidrio dentro del pozo y coloque el capilar encima de una sola célula de interés al menos un milímetro desde el borde del pozo.

A continuación, agregue manualmente partículas y seleccione Seleccionar partículas activadas para iniciar la selección. Cuando todas las células han sido recogidas, centrifugar la placa para sedimentar las células en el fondo de cada pozo. La tinción de bio-amino con anticuerpo de molécula de adhesión de células antiepíteles permite la visualización de células cancerosas en la suspensión con una distinción precisa de eventos positivos CD45.

El aislamiento preciso del CTC se caracteriza por la aspiración de sólo el objetivo deseado sin las células contaminantes circundantes. Como se sospecha, los grupos de CTC demuestran un aumento de la supervivencia en comparación con los CTC individuales, dando lugar a colonias celulares dentro de los 56 días de cultivo in vitro. En particular, los grupos de CTC también presentan una mayor tasa de proliferación y, por lo tanto, alcanzan un número final de células más altos, lo que indica que el contacto directo con otras células tumorales tiene un impacto tanto en la viabilidad de las células tumorales como en la tasa de proliferación.

La secuenciación de ARN de una sola célula de CTC directamente aislada de pacientes con cáncer de mama revela que un vecino estocástico distribuido en T incrustación de células individuales derivadas de CTC individuales, grupos de CTC o CTC grupos de glóbulos blancos. Recuerde instalar el capilar de vidrio para eliminar las burbujas de aire dentro del sistema fluido del micromaniprógrafo y calibrar la posición de recogida para garantizar una selección eficiente de una sola célula. Las células individuales se pueden sembrar o procesar posteriormente para la secuenciación de próxima generación para permitir el análisis ex-vivo y la caracterización CTC con una resolución de una sola célula para investigar el proceso metastásico.