Name: Método de inmunoprecipitación de reticulado mejorado (eCLIP) para la identificación eficiente de ARN ligado a proteínas en Testis del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprende el método eCLIP mejorado para identificar ARN ligado a proteínas en testículo de ratón. Esta técnica no radiactiva ofrece mayor especificidad y eficiencia en el estudio de la espermatogénesis.

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Agradecemos a Eric L Van Nostrand y gene W Yeo por su guía útil con el protocolo original. K.Z. fue apoyado por el programa nacional de la clave R & D de China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500), y la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31771653). L.Y. fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (81471502, 31871503) y el programa innovador y emprendedor de la provincia de Jiangsu.

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<li>Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+models+and+wavelet+transforms+reveal+high+confidence+RNA-protein+interaction+sites+in+MOV10+PAR-CLIP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e160(2012).</li>
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<li>Zheng, K., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+pachytene+piRNA+biogenesis+reveals+a+novel+requirement+for+maintaining+post-meiotic+germline+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity.</a> PLoS Genetics. 8 (11), e1003038(2012).</li>
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<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con el aumento de la comprensión del papel universal de la RBP en contextos biológicos y patológicos, los métodos de clip han sido ampliamente utilizados para revelar la función molecular de RBPs20,32,33, 34,35. El protocolo descrito aquí representa una aplicación adaptada del método eCLIP a los Testis del ratón.
Un desafío en la r...

Los testículos de mamífero representan un excelente modelo de desarrollo en el que un intrincado programa de diferenciación celular se ejecuta cíclicamente para producir numerosos espermatozoides. Un valor único de este modelo radica en la aparición de la inactivación transcripcional en ciertas etapas de la espermatogénesis, típicamente cuando la inactivación cromosómica del sexo meióticos (MSCI) ocurre1,2 y cuando los spermatidos redondos se someten a compactación nuclear drástica durante la espermiogénesis3. Estos eventos transcripcionales inconsecutivos requieren la regulación del gen post-transcripcional, en el cual las proteínas de unión al ARN (RBP) desempeñan un papel crucial, dando forma al transcriptoma y manteniendo la fertilidad masculina.
Para identificar los objetivos de ARN Bona fide de un RBP individual in vivo, el método de inmunoprecipitación reticulante (clip) se desarrolló4,5, basado en pero más allá de la inmunoprecipitación de ARN regular (RIP)6,7 , mediante la incorporación de pasos clave, incluyendo la reticulación ultravioleta (UV), el lavado estricto y la transferencia de gel para mejorar la especificidad de la señal. La aplicación avanzada del CLIP combinado con la secuenciación de alto rendimiento ha provocado un gran interés en el perfilado de la interacción proteína-ARN a niveles de genoma amplio8. Además de los estudios genéticos sobre la función de la RBP, estos métodos bioquímicos que identifican la interacción directa de la proteína endógena y el ARN han sido indispensables para dilucidar con precisión las funciones reguladoras de ARN de los RBPs. Por ejemplo, MOV10L1 es una helicasa de ARN específica de testis necesaria para la fertilidad masculina y la biogénesis9del ARN interactuante Piwi (Pirna). Su MOV10 de parálogo es conocido como un ARN helicogenamente expresado y multifuncional con funciones en múltiples aspectos de la biología de ARN10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18. mediante el empleo de los clip-SEQ convencionales, descubrimos que MOV10L1 une y regula los precursores primarios de Pirna para iniciar el procesamiento temprano de Pirna19,20, y que MOV10 une mRNA 3 ' UTRs y así como ARN no codificante especies en células germinales testiculares (datos no mostrados).
Sin embargo, CLIP es originalmente un laborioso, procedimiento radiactivo seguido por secuenciación de preparación de la biblioteca con una notable pérdida de etiquetas CLIP. En el CLIP convencional, se prepara una biblioteca cDNA utilizando adaptadores ligados en ambas extremidades del ARN. Después de la digestión proteica, los polipéptidos cortos reticulados permanecen Unidos a los fragmentos de ARN. Esta marca reticulante bloquea parcialmente la progresión de la transcriptasa inversa (rtasa) durante la síntesis de cDNA, resultando en cDNAs truncados que representan alrededor del 80% de la biblioteca de cDNA21,22. Por lo tanto, sólo fragmentos de cDNA resultantes de la Rtasa omitiendo el sitio de reticulación (lectura a través) están secuenciados. Recientemente, varios enfoques CLIP, tales como PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP y uvCLAP, se han empleado para identificar sitios de enlace cruzado de RBPs en las células vivas. PAR-CLIP involucra la aplicación de radiación UV de 365 nm y análogos de nucleótidos fotoactivables y, por lo tanto, es exclusivo de las células vivas en cultivo, y la incorporación de análogos de nucleósidos en transcripciones recién sintetizadas es propensa a producir sesgo donde el ARN interactúa físicamente con la proteína23,24. En iCLIP, sólo un adaptador se ligaba a la extremidad 3 ' de los fragmentos de ARN reticulado. Después de la transcripción inversa (RT), las cDNAs truncadas y de lectura a través se obtienen mediante la circularización intramolecularmente y la relinearización seguida de la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)25,26. Sin embargo, la eficiencia de la circularización intramolecular es relativamente baja. Aunque los protocolos CLIP más antiguos necesitan etiquetar ARN reticulada con un radioisótopo, la reticulación ULTRAVIOLETA y la purificación de afinidad (uvCLAP), con un proceso de purificación de afinidad en tándem estricta, no dependen de la radioactividad27. Sin embargo, uvclap se limita a las células cultivadas que deben ser transfectadas con el vector de expresión que lleva la etiqueta 3x Flag-HBH para la purificación de afinidad en tándem.
En eCLIP, los adaptadores fueron ligados primero en la extremidad 3 ' de ARN seguido por RT, y al lado de la 3 ' extremidad de cDNAs en un modo intermoleculares. Por lo tanto, eCLIP es capaz de capturar todos truncados y leídos-a través de cDNA28. Además, no está restringido al etiquetado radioactivo, ni al uso de líneas celulares basadas en su principio, manteniendo al mismo tiempo la resolución de un solo nucleótido.
Aquí, proporcionamos una descripción paso a paso de un protocolo eCLIP adaptado para los Testis del ratón. Brevemente, este protocolo eCLIP comienza con la reticulación UV de los túbulos testiculares, seguidos por la digestión parcial de la RNase e inmunoprecipitation usando un anticuerpo específico de proteína. A continuación, el ARN ligado a proteínas está desfosforilado, y el adaptador se ligaba a su extremo 3 '. Después de la electroforesis de gel de proteína y la transferencia de gel a membrana, el ARN se aísla cortando el área de la membrana de un rango de tamaño esperado. Después de RT, el adaptador de ADN está ligado al extremo 3 ' de cDNA seguido por la amplificación de PCR. El cribado de subclones antes de la secuenciación de alto rendimiento se toma como un control de calidad de la biblioteca. Este protocolo es eficiente en la identificación de las principales especies de ARN ligado a proteínas de RBP, ejemplificado por los dos ARN que expresan las helicasas MOV10L1 y MOV10.

<table><tbody><tr><td><Anticuerpos > fuerte< / ></td><td></td><td></td><td></td>fuerte</tr> <tr><td>anti-ratón MOV10 &nbsp; anticuerpo</td><td>Proteintech, China</td><td>10370-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo MOV10L1 de ratón</td><td>Zheng et al.20109</td> <td>antisueros policlonales UP2175</td><td>proporcionado por P. Jeremy Wang lab, Universidad de Pensilvania</td></tr><tr><td>HRP Goat Anti-Rabbit IgG&nbsp;</td><td>ABclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>Conejo IgG</td><td>Beyotime, China</td><td>A7016</td><td></td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemania</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>Sonificador digital</td><td>BRANSON, EE. UU.</td><td>BBV12081048A</td><td>450 vatios; 50/60 Hz</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Imán</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini Módulo de transferencia</td><td>Invitrogen,EE. UU.</td><td>B1000</td><td></td></tr><tr><td>Mini tanque de gel</td><td>Invitrogen,EE. UU</td>. <td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitación</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemania</td><td>Thermomixer comfort&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trituradora de tejidos, Dounce</td><td>PYREX, EE. UU</td>. <td>1234F35</td><td>solamente&nbsp; el mortero "suelto" se utiliza en este protocolo</td></tr><tr><td>Estándar profesional 96 Gradient</td><td>Biometra, Alemania</td><td>n.º de serie: 2604323</td><td></td></tr><tr><td>Revólver de tubo&nbsp;</td><td>Cristal,</td><td>n.º de serie de EE. UU.: 3406051</td><td></td></tr><tr><td>reticulante de luz UVP</td><td>UVP, EE. UU</td>. <td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td><Materiales fuertes> < / tratado con ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>TC</td><td>Corning, EE. UU</td>. <td>430167</td><td>100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos</td><td>Corning, EE. UU</td>. <td>430791</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Microtubos</td><td>tubos AXYGEN , EE. UU</td><td>. MCT-150-C</td><td>1.5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td><reactivos fuertes> </fenol ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ácido fuerte/cloroformo/alcohol isoamílico&nbsp;</td><td>Solarbio, China</td><td>P1011</td><td>25:24:01</td></tr><tr><td>AffinityScript Enzima</td><td>Agilent, EE. UU.</td><td>600107</td><td></td></tr><tr><td>Antioxidante</td><td>Invitrogen, EE. UU</td>. <td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>DH5 y bacterias alfa; competentes</td><td>Thermo Scientific, EE. UU.</td><td>18265017</td><td>estas células económicas producen >1 x 106 transformantes/&micro; g control de ADN por 50 y micro; L reacción.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>10416014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A&nbsp;</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo ECL</td><td>Vazyme, China</td><td>E411-04</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA</td><td>Roche, EE. UU</td>. <td>04693132001</td><td>agregar reactivo de</td>limpieza</tr> de <tr>productos<td>Exo-SAP-IT Affymetrix Exo-SAP-IT</td><td></td><td>78201</td><td>PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Enzima FastAP</td><td>Thermo Scientific, EE. UU.</td><td>EF0652</td><td></td></tr><tr><td>LDS Tampón de muestra</td><td>Thermo Scientific, EE. UU</td>. <td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MetaPhor Agarose&nbsp;</td><td>lonza, Suiza</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Extracción de gel MiniElute</td><td>QIAGEN, Alemania</td><td>28604</td><td>almacén de columna a 4 ?; tampón QG=tampón de disolución de gel; tampón PE= tampón de lavado (para el paso 14)</td></tr><tr><td>MyONE Perlas de silano</td><td>Thermo Scientific, EE. UU.</td><td>37002D</td><td>perlas magnéticas de extracción de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen,EE. UU</td><td>. AM9759 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, EE. UU.</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Protein Gels</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>NP0336BOX</td><td>4%&ndash; 12 %, 1,5 mm, 15 pocillos</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit&nbsp;</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>NP0050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, EE. UU</td>. <td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Gel de bloqueo de fase (PLG) tubo pesado&nbsp; &nbsp;</td><td>TIANGEN, China</td><td>WM5-2302831</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems, EE. UU.</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>NEB, Nueva Inglaterra &nbsp;</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Mezcla maestra de PCR &nbsp;</td><td>NEB, Nueva Inglaterra &nbsp;</td><td>Tampón M0492L</td><td></td></tr><tr><td>RLT</td><td>QIAGEN, Alemania</td><td>79216</td><td>Tampón de lisis de purificación de ARN&nbsp;</td></tr><tr><td>ARN limpio & Concentrador-5 columnas&nbsp;</td><td>ZYMO RESEARCH, EE. UU</td>. <td>R1016</td><td>Columnas de concentración y purificación de ARN</td></tr><tr><td>RNasa I&nbsp;</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de RNasa</td><td>Promega, EE. UU</td>. <td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNasa</td><td>Promega, EE. UU.</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Agente reductor de muestra</td><td>Invitrogen, EE. UU</td>. <td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>SDS Solución</td><td>Invitrogen, EE. UU</td>. <td>15553027</td><td>10%</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU</td>. <td>30970</td><td>proteger de enzima</td></tr><tr><td>ligera T4 PNK</td><td>NEB, Nueva Inglaterra &nbsp;</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 ARN ligasa 1 alta conc</td><td>NEB, Nueva Inglaterra &nbsp;</td><td>M0437M</td><td></td></tr><tr><td>TA / Blunt-Zero Cloning Mix</td><td>Vazyme, China</td><td>C601-01</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCI Buffer</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A600198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Películas de rayos X</td><td>Caresteam, Canadá</td><td>6535876</td><td></td></tr></tbody></table>

método de inmunoprecipitación de reticulado mejorado (eclip) para la identificación eficiente de arn ligado a proteínas en testis del ratón

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

La espermatogénesis define un proceso altamente ordenado de diferenciación de células germinales masculinas en mamíferos. En los Testis, la transcripción y la traducción están desacopladas, subrayando la importancia de la regulación post-transcripcional de la expresión génica orquestada por las RBP. Para dilucidar las funciones mecanicistas de un RBP, la metodología de reticulación inmunoprecipitation (CLIP) se puede utilizar para capturar sus objetivos de ARN directo endógeno y definir los sitios de interacción reales. El CLIP mejorado (eCLIP) es un método desarrollado recientemente que ofrece varias ventajas sobre los CLIPs convencionales. Sin embargo, el uso de eCLIP hasta ahora se ha limitado a las líneas celulares, pidiendo aplicaciones ampliadas. Aquí, empleamos a eCLIP para estudiar MOV10 y MOV10L1, dos helicasas de unión a ARN conocidas, en Testis de ratón. Como era de esperar, encontramos que MOV10 se une predominantemente a 3 ' regiones no traducidas (UTRs) de mRNA y MOV10L1 se une selectivamente a las transcripciones de precursores de ARN interactuante de Piwi (piRNA). Nuestro método eCLIP permite la rápida determinación de las principales especies de ARN vinculadas por diversos RBPs mediante la secuenciación a pequeña escala de subclones y, por lo tanto, la disponibilidad de bibliotecas calificadas, como una orden de proceder con secuenciación profunda. Este estudio establece una base aplicable para la eCLIP en los testículos de mamífero.

El procedimiento eclip y los resultados se ilustran en la figura 1, figura 2, figura 3, figura 4. Los ratones fueron eutanizados con dióxido de carbono y se hizo una pequeña incisión en la parte inferior del abdomen usando tijeras quirúrgicas (figura...

Aquí, presentamos un protocolo eCLIP para determinar los principales objetivos de ARN de los candidatos a RBP en Testis.

Método de inmunoprecipitación de reticulado mejorado (eCLIP) para la identificación eficiente de ARN ligado a proteínas en Testis del ratón

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

Las proteínas de unión al ARN son esenciales para la fisiología celular. Es importante destacar que el RBP está muy expresado a través de la espermatogénesis y han sido bien documentados como reguladores post-transcripción esenciales durante todas las etapas de las células germinales. La identificación de objetivos vinculantes es fundamental para dilucidar los roles mecánicos de RBP.Este protocolo representa una aplicación adaptada del método eCLIP para capturar objetivos endógenos de ARN directo y establece una base aplicable para eCLIP en testículos de mamíferos. La principal ventaja de este método es que no es radioactivo, consume menos tiempo y proporciona una relación señal-ruido más fuerte porque la entrada de tamaño coincidente servirá como un fondo adecuado para objetivos auténticos. Por último, creemos que la secuenciación a pequeña escala de subclones es útil para seguir la secuenciación profunda.Demostrar el procedimiento estará Xu Qiushi, mi colega. Para comenzar este procedimiento, cosechar alrededor de 100 miligramos de testículos de ratones de edad adecuada para cada experimento de inmunoprecipitación. Coloque los tejidos en PBS helado.Con un par de pinzas de punta fina, retire suavemente la tunica albuginea. Agregue tres mililitros de PBS helado a una trituradora de tejido, y use un pestillo de vidrio suelto para triturar el tejido por fuerza mecánica leve. A continuación, transfiera la suspensión de tejido a un plato de cultivo celular y agregue PBS helado hasta seis mililitros.Agitar la placa rápidamente para que el líquido cubra la parte inferior del plato uniformemente. Entrentice la suspensión sobre hielo tres veces con 400 milijoules por centímetro cuadrado a 254 nanómetros. Asegúrese de mezclar la suspensión entre cada irradiación.A continuación, recoja la suspensión en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugar a 1.200 veces g y a cuatro grados durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en un mililitro de PBS. Después de esto, transfiera la suspensión a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros.Centrifugar a 1.000 veces g y a cuatro grados centígrados durante dos minutos, y deseche el sobrenadante. En primer lugar, añadir 125 microlitros de proteína Una perla magnética por muestra a un tubo de centrífuga fresca. Coloque el tubo en el imán para separar las perlas de la solución.Después de 10 segundos, retire el sobrenadante y lave las cuentas dos veces con un mililitro de tampón de lelisis helada. Resuspender las perlas en 100 microlitros de tampón de lysis fría con 10 microgramos de anticuerpo eCLIP. Gire los tubos a temperatura ambiente durante 45 minutos.Luego, lave las cuentas dos veces con un mililitro de tampón de lelisis helada. Para empezar, resuspender los pellets de tejido en un mililitro de tampón de lisis fría que contiene 22 microlitros de 50x cóctel inhibidor de proteína libre de EDTA y 11 microlitros de inhibidor de la RNase. Mantenga las muestras en hielo durante 15 minutos.Sonicar cada muestra como se describe en el protocolo de texto. A continuación, agregue cuatro microlitros de DNase a cada tubo y mezcle bien. Incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos mientras se agita a 1.200 rpm.Después de esto, añadir 10 microlitros de RNase diluido y mezclar bien. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos mientras agita a 1.200 rpm. Luego, centrifugar a 15.000 veces g y a cuatro grados celsius durante 20 minutos para despejar el izado.Recoja cuidadosamente el sobrenadante y guarde las muestras de entrada para las muestras RWB y RRI. Primero, agregue un mililitro del izado a las cuentas preparadas, y gire las muestras a cuatro grados Centígrados durante dos horas o durante la noche. Después de esto, recoger las cuentas con un soporte magnético, y descartar el sobrenadante.Lave las cuentas dos veces con 900 microlitros de tampón de sal alta, y luego lave las cuentas dos veces con 900 microlitros de tampón de lavado. A continuación, lave las cuentas una vez con 500 microlitros de 1x tampón de desfosforilación. En primer lugar, deseche el sobrenadante y use puntas finas de pipeta para eliminar cualquier líquido residual.Agregue 25 microlitros de mezcla maestra de ligadura de tres prime a cada muestra, y pipetee cuidadosamente para mezclar. Agregue 2,5 microlitros del adaptador de ARN X1A y 2,5 microlitros del adaptador de ARN X1B a cada muestra. Mezclar cuidadosamente pipeteando o parpadeando.Incubar a 25 grados centígrados durante 75 minutos, asegurándose de mover el tubo para mezclar cada 10 minutos. Lave las cuentas una vez con 500 microlitros de tampón de lavado en frío. A continuación, lave las cuentas una vez con 500 microlitros de tampón frío con alto contenido de sal y luego con 500 microlitros de tampón de lavado en frío.Repita ambos lavados una vez más. Separe magnéticamente las perlas y use puntas finas de pipeta para eliminar cualquier líquido residual. Resuspender las perlas en 100 microlitros de tampón de lavado en frío, y mover 20 microlitros a nuevos tubos como muestras RWB.Agregue 7,5 microlitros de 4x búfer de muestra SUD y tres microlitros de agente reductor de muestra 10x a las muestras restantes. Incubar a 70 grados centígrados durante 10 minutos mientras se agita a 1.200 rpm. Después de esto, enfríe las muestras sobre hielo durante un minuto, y centrifugar a 1.000 veces g y a cuatro grados centígrados durante un minuto.Para el gel RWB, coloque los tubos en un imán y separe eluido de proteína de las cuentas. Cargue 15 microlitros de muestra en cada pozo. A continuación, agregue 500 microlitros de antioxidantes a 500 mililitros de 1x tampón de funcionamiento SDS.Ejecute el gel a 200 voltios, 1x sdS amortiguador de funcionamiento durante 50 minutos o hasta que el frente del tinte esté en la parte inferior. Transfiera los complejos de ARN proteico del gel a una membrana de nitrocelulosa a 10 voltios durante 70 minutos en tampón de transferencia 1x con 10% de metanol. Bloquear la membrana RWB en 5% de leche en TBST a temperatura ambiente durante una hora.Enjuague la membrana en TBST e incubar con anticuerpo primario en TBST durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de esto, lavar dos veces con TBST, con cada lavado que dura cinco minutos. Incubar con anticuerpos secundarios en TBST a temperatura ambiente durante una hora.A continuación, lave la membrana tres veces con TBST. A continuación, mezcle volúmenes iguales de tampón ECL A y tampón B.Agregue esta mezcla a la membrana, e incubar durante un minuto. Cubra la membrana con una envoltura de plástico y exponga a una película de rayos X a temperatura ambiente durante dos o tres minutos antes de desarrollar la película.En este estudio, MOV10 eCLIP en testículos de ratones adultos de tipo salvaje con RNase I tratando el lesato reticulado, la proteína diana, que es de aproximadamente 114 kilodaltones, se enriquece con éxito. Los resultados qPCR de cDNA diluidos de uno a 10 de varias muestras revelan que las muestras no reticuladas muestran una disminución de la recuperación de ARN. Se observa que los valores Ct del grupo no reticulado son generalmente cinco veces más que el grupo reticulado UV.Los resultados representativos para la amplificación de PCR y la selección de tamaño a través de la electroforesis de gel de agarosa se muestran aquí. El producto de imprimación-dimer aparece en unos 140 pares base. La vista navegador del genoma UCSC de dos secuencias representativas de subclone muestra que las etiquetas eCLIP enlazadas a MOV10 se encuentran dentro de la UTR de tres primos del gen Fto.La tasa aproximada de objetivos UTR de tres primos representa el 75% es consistente con la mayoría de los objetivos MOV10 en células HEK293 y en testículos. Por el contrario, se encuentra que las etiquetas eCLIP enlazadas a MOV10L1 se encuentran dentro de un clúster de piRNA, lo que indica que MOV10L1 se dirige a los precursores de piRNA. La tasa aproximada de objetivos precursores de piRNA representa el 42%, que reflejan una tendencia de estudios anteriores.MOV10L1 eCLIP con una digestión RNase I de 40 unidades por mililitro produce relativamente más secuencias con menos de 20 pares de bases. Este protocolo descrito aquí representa un empleo del método eCLIP en la reproducción, un área en la que el conocimiento de interacción ARN-RBP es bastante insuficiente.

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Investigación

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Biología

La disposición espacial de ARN-proteínas de unión en una transcripción es un determinante clave de la regulación post-transcripcional. Por lo tanto, hemos desarrollado cada nucleótido reticulación UV resolución y inmunoprecipitación (iClip) que permite que precisa todo el genoma de mapeo de los sitios de unión de una proteína de unión al ARN.

iClip - transcriptoma en todo el mapeo de la proteína-ARN interacciones con la Resolución de nucleótidos individuales

Un paso a paso el protocolo para aislar e identificar los complejos de ARN asociados a través de RIP-Chip.

Método para el aislamiento e identificación de mRNAs, microRNAs y componentes proteicos de ribonucleoprotein complejos de extractos celulares usando RIP-Chip

Este video muestra el método mejorado de inmunoprecipitación reticulante (eCLIP) para identificar proteínas de unión al ARN en testículos de ratón. eCLIP permite la identificación precisa de los sitios de unión donde las proteínas de unión al ARN (RBP) interactúan con sus ARN objetivo.

Un método mejorado de inmunoprecipitación de reticulación para la identificación eficiente del ARN unido a proteínas en testículos de ratón

Este manuscrito describe un enfoque para aislar RNPs afines seleccionados formados en células eucariotas a través de un enriquecimiento específico dirigido a oligonucleótidos. Demostramos la aplicabilidad de este enfoque mediante el aislamiento de un RNP afín unido a la región no traducida retroviral 5' que está compuesta por DHX9/ARN helicasa A.

El aislamiento de los complejos de ARN-proteína afín a partir de células usando elución dirigida por oligonucleótidos

Se describe un protocolo para identificar proteínas RNA-que atan y mapa de sus regiones de unión de ARN en células vivas usando photocrosslinking mediada por la UV y espectrometría de masas.

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Se describe un procedimiento de aislamiento de RNA tándem (viaje) para la recuperación de complejos proteicos de ARNm endógeno formado. Específicamente, complejos RNA-proteína son reticulado en vivo, cofia RNAs son aislados de los extractos con los granos oligo(dT) y particular mRNAs son capturados con oligonucleótidos antisentido de RNA modificados. Proteínas a mRNAs son detectadas por el análisis de immunoblot.

Un procedimiento de aislamiento de RNA tándem basada en oligonucleótidos recuperar complejos eucariotas ARNm-proteína

Aquí, presentamos un protocolo para enriquecer los sitios endógenos de unión al ARN o "huellas" de los complejos de ARN:proteína (RNP) de células de mamíferos. Este enfoque implica dos inmunoprecipitaciones de subunidades RNP y por lo tanto se denomina inmunoprecipitación de ARN en tándem (RIPiT).

Identificación de Huellas de ARN:Complejos proteicos a través de la inmunoprecipitación de ARN en tándem seguido de secuenciación (RIPiT-Seq)

Aquí presentamos un protocolo CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq con purificación en tándem FLAG-biotina para determinar los objetivos de ARN de proteínas de unión al ARN (RPP) en células de mamíferos.

Perfilado en todo el transcriptoma de las interacciones entre proteínas y ARN por enlace cruzado e inmunoprecipitación mediada por la purificación en tándem FLAG-Biotin

Aquí, describimos la inmunoprecipitación de ribosomas y el ARN asociado de poblaciones selectas de células germinales macho adultas utilizando el sistema RiboTag. La cría estratégica y la cuidadosa inmunoprecipitación dan como resultado resultados limpios y reproducibles que informan sobre el traducto de células germinales y proporcionan información sobre los mecanismos de los fenotipos mutantes.

RiboTag Inmunoprecipitación en las células germinales del ratón macho

Aquí, presentamos un método in vitro optimizado para descubrir, cuantificar y validar interactores de proteínas de secuencias específicas de ARN, utilizando extracto de proteína total de células humanas, perlas de estreptavidina recubiertas con ARN biotinilado y análisis de espectrometría de masas.

Un análisis extraíble cuantitativo optimizado de proteínas de unión al ARN utilizando ARN biotinilado corto

Un método ChIRP basado en UV para identificar interacciones directas entre ARNN y proteína.

Un método de chiIRP basado en UV para la identificación verificable de proteínas que interactúan directamente con el ARNnc: desde células cultivadas hasta testículo de ratón

Aprende el método eCLIP mejorado para identificar ARN ligado a proteínas en testículo de ratón. Esta técnica no radiactiva ofrece mayor especificidad y eficiencia en el estudio de la espermatogénesis.

Método de inmunoprecipitación de reticulado mejorado (eCLIP) para la identificación eficiente de ARN ligado a proteínas en Testis del ratón (Video) | JoVE Journal

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