Name: Preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Aprende a preparar criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica usando dissección ocular, fijación en paraformaldehído y crioseccionado. Este protocolo preserva estructuras celulares para análisis detallado en neurociencia.

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Este trabajo fue apoyado por fondos de NIH (RO1-GMO97327) y la University Research Foundation (UPenn). Agradecemos especialmente a Svetlana Savina por su ayuda en el desarrollo del protocolo de inmunohistoquímica, Gordon Ruthel (Universidad de Pensilvania) y Penn Vet Imaging Core por su ayuda con la microscopía y Leslie King, Ph.D. por la lectura crítica de este manuscrito .

Todos los métodos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía de Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio proporcionada por el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania.
Todas las herramientas y equipos para los métodos se muestran en la Figura 1 y se enumeran en la Tabla de materiales.
1 . Enucleación del ojo del ratón, disección de la copa del ojo, y la incrustación
<ol><li>Ratones eutanasiados con dióxido de carbono (CO2) seguidos de decapitación (ratones postnatales P0 - P11) o luxación cervical (adultos > ratones P11). Para ratones P0-P14, los ojos están cubiertos por la piel. Asegúrese de retirar la piel antes de los pasos posteriores.</li>
	<li>Marque la parte temporal del ojo (Figura2A)quemando ligeramente la córnea usando un cauterizador de cola. Evite quemar un agujero en la córnea tocando la córnea muy ligeramente y durante no más de una fracción de segundo con el cauterizador.</li>
	<li>Inmediatamente enuclea los ojos del ratón usando #5 Dumont curvado/45 fórceps. Incubar durante 15 minutos en un tubo criotubo de 1,5 ml con 1 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina con fosfato (PBS) sobre hielo.</li>
	<li>Después de 15 minutos en 4% pfa, transfiera el ojo fijo utilizando los fórceps curvos Dumont #5/45 a una placa de disección modificada de 35 mm (ver Tabla de Materiales y Figura 1C)llena de PBS y colóquela bajo el microscopio de disección.</li>
	<li>Hacer una pequeña incisión en la marca de quemadura, perpendicular y justo por encima del limbo (borde de la córnea) usando el micro cuchillo.</li>
	<li>Inserte las tijeras curvas en la incisión y realice un corte circunferencial de la córnea después del limbo (Figura 2B).</li>
	<li>Retire la córnea y extraiga la lente con un Dumont delgado #5 fórceps, (Figura2B)y levántela delicadamente de la parte posterior del ojo. El cuerpo vítreo, el gel transparente que llena el espacio entre la lente y la retina, saldrá con la lente (Figura2B)y la retina será visible como una superficie blanca que cubre el interior de la copa ocular posterior. Asegúrese de que no haya ningún daño visible a la retina, como agujeros o desgarros (Figura2C).</li>
	<li>Lave los vasos oculares dos veces en 1 ml de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cryoprotect los vasos oculares equilibrando en una solución de 15% de sacarosa en PBS durante la noche a 4oC hasta que el ocular se hunda</li>
	<li>Transfiera los vasos oculares a una sacarosa del 30% en PBS durante 2-3 h hasta que la copa del ojo se hunda.</li>
	<li>Incruste los oculares en OCT en criomoldes de 10 x 10 mm (Figura3A). Usando un microscopio de disección, oriente el ojo en el criomold a lo largo de su eje dorsal-ventral (Figura2D, Figura 3A) girando el ojo hasta que la marca de quemadura esté en la parte superior, el nervio óptico esté a la izquierda y la parte recortada del molde se dirija hacia la derecha ( Figura 2D). Tenga cuidado de evitar burbujas cerca del tejido. NOTA: Para manipular la copa del ojo, utilice una sonda de titanio hecha de un alambre de titanio unido a una punta de pipeta.</li>
	<li>Para congelar a presión el tejido de la retina, sumerja el criomold durante al menos 5 minutos en un vaso de precipitados metálicos que contenga isopentano y coloque el vaso de precipitados en nitrógeno líquido o en el baño de etanol seco/100% (hasta 1/3 de la altura del vaso de precipitados metálicos). NOTA: El criomold debe sumergirse en isopentano a más de la mitad de su altura, pero no tiene que estar completamente sumergido.</li>
	<li>Retire el bloque congelado y envuélvalo en papel de aluminio.</li>
	<li>Conservar a -80oC.</li>
	<li>Marque el bloque congelado con un lápiz o un punzón para registrar la orientación del bloque (Figura3B).</li>
</ol>2 . Seccionamiento con un criostato
<ol><li>Después de ajustar la temperatura del criostato (entre -20 y -25 oC), permita que los moldes que contienen los vasos oculares incrustados se equilibren a la temperatura del criostato durante 1 h.</li>
	<li>Instale el bloque con orientación dorso-ventral (Figura3C)y corte secciones seriales de 10 m de espesor. Coloque cuidadosamente las secciones de la retina en diapositivas de microscopio anotadas y numeradas.</li>
	<li>Almacene las diapositivas en cajas deslizantes a -20 oC o -80 oC hasta los procedimientos de IHC.</li>
</ol>3 . Inmunomanchado de fluorescencia con el rack deslizante
NOTA: El sistema Slide Rack (p. ej., Sequenza) sostiene las guías del microscopio de vidrio con una placa de cubierta, creando un espacio capilar de 100 l entre la corredera y la placa.
<ol><li>Descongelar las criosecciones a temperatura ambiente (RT) durante 2 h a 4 h para permitir que se sequen y se adhieran a los portaobjetos del microscopio. NOTA: También es posible secarlos a 30-37 oC durante 30 min a 1 h.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en el portaobjetos y lave las secciones de la retina dos veces en 100-200 l de PBS durante 2 min.</li>
	<li>Permeabilizar las secciones de la retina incubando en 0.25% Tritón-X / 0.05% NaN3en PBS durante 5 min a RT.</li>
	<li>Añadir 100 sl de solución de bloqueo a las diapositivas.</li>
	<li>Añadir 100 s de anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo a las diapositivas.</li>
	<li>Incubar secciones de retina durante la noche a 4 oC. NOTA: Durante este tiempo, cubra el portaobjetos para evitar la desecación de las secciones.</li>
	<li>Lavar las secciones de la retina 3 veces, cada una durante 15 minutos, utilizando 200 s de PBS. NOTA: La adición de 0.001- 0.002% Triton-X100 a PBS (PBS-T) permite un lavado más estricto, pero puede interrumpir algunas membranas y estructuras celulares.</li>
	<li>Incubar secciones de retina en anticuerpos secundarios con etiqueta fluorescente durante 1 h a RT. A partir de ahora, protéjase de la luz.</li>
	<li>Lave las secciones de la retina 3 veces, cada una durante 15 minutos.</li>
	<li>Incubar las secciones de retina a RT durante 5 minutos con un marcador nuclear como Hoechst 33342 o solución DAPI.</li>
	<li>Lave las secciones de la retina 1 vez durante 15 min.</li>
	<li>Coloque una cubierta encima de una toalla de papel en el banco de laboratorio.</li>
	<li>Agregue 2 gotas de soporte de montaje antidecoloración al centro de la cubierta.</li>
	<li>Gire la diapositiva para tener la criosección de la retina hacia abajo.</li>
	<li>Monte con cuidado el cubreobjetos lentamente, en un ángulo de 45o, incline la corredera sobre el soporte de montaje. NOTA: Evitar la formación de burbujas a medida que baja la diapositiva en su lugar.</li>
	<li>Aplique una presión uniforme, utilizando un libro o catálogo pesado (ver más abajo), a la combinación de deslizamiento deslizante para eliminar el exceso de medios de montaje. NOTA: Para garantizar la coherencia en la preparación de la muestra, utilice siempre el mismo objeto (es decir, el mismo libro o catálogo) para aplicar una presión uniforme al cubreobjetos durante el montaje de la diapositiva.</li>
	<li>Manténgase plano y deje que se endurezca durante la noche en RT en la oscuridad. Almacene los portaobjetos planos a 4oC indefinidamente.</li>
	<li>Imagen mediante campo ancho o microscopía de fluorescencia confocal (Figura4).</li>
</ol>

<ol><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelled+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li>
<li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li>
<li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113(1945).</li>
<li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li>
<li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li>
<li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina%3A+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li>
<li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+%28Muller%29+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).</li>
<li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li>
</ol>

Sin revelaciones.

La disección de la retina del ratón es un proceso delicado debido al pequeño tamaño y forma de los ojos del ratón y la fragilidad del tejido de la retina. A pesar de que realizar disección de alta calidad es una cuestión de práctica, tener un protocolo detallado, proporcionar métodos y consejos eficientes es una necesidad para obtener secciones de retina e IHC. Además de los protocolos descritos aquí, hay varios consejos que permiten secciones de retina consistentes de alta calidad que son adecuadas para IHC reproducible...

La inmunohistoquímica (IHC) es una poderosa técnica para localizar proteínasespecíficas y estructuras celulares en tejidos in situ 1,2,3. Los métodos de fijación inapropiados y la sección subóptima de tejidos complejos pueden alterar la estructura tisular, generar manchas de fondo alto o disminuir las interacciones entre anticuerpos y epítopos, lo que resulta en artefactos de tinción y la consiguiente interpretación errónea de Datos IHC4. Como la retina vertebrada es un órgano neural complejo y altamente organizado compuesto por estratos de fotorreceptores interconectados, interneuronas y células ganglionares, es muy frágil y puede ser fácilmente interrumpida durante la disección y seccionamiento. Un protocolo detallado, estandarizado y validado desde la disección de ojos del ratón y la orientación hasta la inmunomancha ayudará a reducir significativamente los artefactos IHC, aumentando así la fiabilidad de los resultados y permitiendo datos comparativos más precisos Análisis.
Hay muchos protocolos para la preparación de tejidos para IHC, sin embargo, no todos son adecuados para el tejido de la retina. Fijadores fuertes como 10% de formalina o solución de Bouin preservan la estructura de la retina durante la disección y seccionamiento5. Desafortunadamente, los fijadores fuertes a menudo conducen a la fluorescencia de fondo mejoraday el enmascaramiento de epítopos debido a la modificación química de los epítopos 6. Por otro lado, fijadores más suaves, como 4% paraformaldehído (PFA) pueden aliviar algunos de estos artefactos, pero requieren disección meticulosa y seccionamiento para preservar la estructura óptima de la retina. La PFA penetra rápidamente en el tejido, pero relatifica las proteínas muy lentamente, reduciendo el riesgo de enmascaramiento de epítopos. Dado que la incubación de PFA de poco tiempo es una fijación relativamente leve, los tejidos a menudo requieren una congelación rápida para preservar los antígenos. Es importante evitar la formación de cristales de hielo durante la congelación de tejidos, ya que distorsionan y dañan la integridad de las células y tejidos7.
Aquí describimos protocolos detallados y estandarizados para la disección, fijación y crioprotección de copas posteriores oculares de ratón que producen datos De IHC consistentes y confiables.

<table><tbody><tr><td>Vaso de precipitados de acero inoxidable de 6 cuartos (185 x 218 mm)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>#MA-48</td><td>Para nitrógeno líquido (Figura 1E)</td></tr><tr><td>Papel de aluminio&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cauterizador&nbsp;</td><td>Bovie</td><td>#AA01</td><td>Para marcar la orientación de los ojos (Figura 1A)</td></tr><tr><td>Pinzas curvas, pinzas Dumont #5/45, dobladas 45 grados&nbsp;</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td> <td># 72703-D</td><td>Para la enucleación y el mantenimiento del ojo del ratón (Figura 1A)</td></tr> <tr><td>Tijeras curvas, tijeras de resorte Vannas - borde de corte de 2,5 mm&nbsp;</td><td>Herramientas de Bellas Ciencias&nbsp;</td><td>#15002-08</td><td>Para cortar circunferencialmente la córnea (Figura 1B)</td></tr><tr><td>Plato</td><td></td><td></td> de disección de 35 mm recubierto de cera dental <td>Para la disección de la copa del ojo (Figura 1C)</td></tr><tr><td>Microscopio de disección&nbsp;</td><td>Leica, Houston, Estados Unidos&nbsp;</td><td>MZ12.5 Micro cuchillos de microscopio estereoscópico</td><td></td>de alto rendimiento</tr><tr><td>- Mango de plástico&nbsp;</td><td>Herramientas de Bellas Ciencias&nbsp;</td><td>#10315-12</td><td>Para hacer una pequeña incisión en la marca de la quemadura (Figura 1A)</td></tr><tr><td>Cera dental rosa&nbsp;</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica&nbsp;</td><td>#72660</td><td>Para recubrimiento de plato de disección</td></tr><tr><td>Slide Rack y cubierta</td><td>Ted Pella</td><td>#36107</td><td>Para retinal IHC (Figura 1G)</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de acero inoxidable (89 x 114 mm)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>#MA-40</td><td>Para baño de isopentano (Figura 1E)Caja</td></tr><tr><td></td><td></td> de <td>espuma de poliestireno</td><td>Para enfriador aislado</td></tr><tr><td>Pinzas delgadas Dumont # 5&nbsp; &nbsp;</td><td>Herramientas de Bellas Ciencias&nbsp;</td><td>#11254-20</td><td>Para extraer la córnea y extraer el cristalino (Figura 1B)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek cryomold&nbsp; (10 mm x 10 mm x 5 mm)</td><td>Ciencias de la Miscroscopia Electrónica&nbsp;</td><td>#62534-10</td><td>Molde para</td></tr> <tr><td>< >tampones y re<activos de OCT / fuerte></td><td><fuerte> Compañía</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> bloqueante <td>2% Suero de caballo normal, 1,5% Gelatina de piel de pescado fría (al 40-50% en H2O, #G7765 de gato), 5% de albúmina sérica bovina (cat #AK1391-0100) en tampón de permeabilización.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Gelvatol (medio de montaje antidecoloración)</td>Bajo la campana extractora, <td></td><td></td><td>disuelva 0,337 g de DABCO (Sigma cat #D2522-25G) en 10 ml de Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&nbsp; Ajuste a pH 8-8.5 con 12N HCl (~ 5 gotas).&nbsp; Almacene en una botella de gota ámbar a 4 & grados; C&nbsp; (8).&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 1000x Stock</td><td>Thermo Scientific</td><td>#62249</td><td>1 mg/ml en PBS (1000x). Alícuota y almacenamiento en la oscuridad, a 4&deg; C hasta por 1 año o a -20 grados; C para almacenamiento a largo plazo. Preparar fresco&nbsp; a 1 ug/mL (1x)&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopentano, 99%&nbsp;</td><td>GFS Chemicals</td><td>#2961</td><td></td></tr><tr><td></td> Paraformaldehído de nitrógeno <td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>(PFA) en ciencias de</td><td>microscopía electrónica PBS&nbsp;</td><td>#15710</td><td>Preparado fresco 4% PFA a partir de 16% de stock de PFA. Almacene el 16% de PFA restante a 4 grados; C en la oscuridad.&nbsp;</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td><td>de permeabilización</td><td>PBS + 0,25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0,05% NaN3. Prepáralo fresco.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Bioworld&nbsp;</td><td>#41620015-20</td><td>0,02 g/L KCl, 0,02 g/L KH2PO4, 0,8 g/L NaCl, 0,216 g/L Na2HPO4 , pH 7,4. Preparado a partir de 10x stock &nbsp;</td></tr><tr><td>Soluciones de sacarosa</td><td>Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>#S-5-500</td><td>Disuelva la cantidad adecuada de sacarosa en&nbsp; 37&nbsp; C PBS (tarda ~15 min en disolverse). Puede almacenarse durante unos días a 4&nb;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Compuesto Tissue-Tek OCT&nbsp;</td><td>Sakura</td><td>&nbsp;#4583</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>anti-calbindin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8666</td><td>Para etiquetar células horinzotales&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-GAD65</td><td>Chemicon</td><td>AB5082</td><td>Para etiquetar GABAcélulas amacrinas érgicas</td></tr><tr><td>anti-GS</td><td>BD Transduction 610517</td><td></td><td>Para etiquetar M&uuml; células ller</td></tr><tr><td>anti-rodopsina</td><td>Millipore MAB5316</td><td></td><td>Para etiquetar cañas</td></tr></tbody></table>

preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

La preparación de secciones oculares de ratón de alta calidad para la inmunohistoquímica (IHC) es fundamental para evaluar la estructura y la función de la retina y para determinar los mecanismos subyacentes a las enfermedades de la retina. Mantener la integridad estructural en toda la preparación del tejido es vital para obtener datos reproducibles de IHC de la retina, pero puede ser difícil debido a la fragilidad y complejidad de la citoarquitectura de la retina. Los fijadores fuertes como el 10% de la formalina o la solución de Bouin preservan de manera óptima la estructura de la retina, a menudo impiden el análisis de IHC al mejorar la fluorescencia de fondo y/o disminuir las interacciones entre anticuerpos y epítopos, un proceso conocido como enmascaramiento de epítopos. Los fijadores más leves, por otro lado, como el 4% de paraformaldehído, reducen la fluorescencia de fondo y el enmascaramiento de epítopos, se deben utilizar técnicas de disección meticulosas para preservar la estructura de la retina. En este artículo, presentamos un método integral para preparar vasos posteriores oculares de ratón para IHC que es suficiente para preservar la mayoría de las interacciones entre anticuerpos y epítopos sin pérdida de integridad estructural de la retina. Incluimos IHC representativo con anticuerpos a varios marcadores de tipo célula de la retina para ilustrar la preservación y orientación del tejido en condiciones óptimas y subóptimas. Nuestro objetivo es optimizar los estudios IHC de la retina proporcionando un protocolo completo de la disección ocular posterior de la copa a IHC.

Para ilustrar cómo estos protocolos, aseguran una preservación óptima de la retina para IHC, sondeamos secciones de retina de ratones P28 WT (C57BL/6N) con anticuerpos contra la rodopesina (un marcador de fotorreceptor)8, ácido glutámico descarboxilasa 65 (Gad65, una célula de amacrina 9, glutamina sintetasa (GS, un marcador de célula de M'ller)10, y calbindina (un marcador de celda horizontal)11</su...

Este informe describe métodos completos para preparar secciones de retina de ratón congeladas para inmunohistoquímica (IHC). Los métodos descritos incluyen disección de la copa ocular posterior, fijación de paraformaldehído, incrustación en la temperatura de corte óptima (OCT) orientación de medios y tejidos, seccionamiento e inmunomancha.

Preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

La disección de la retina del ratón es un proceso muy delicado debido al tamaño y la forma de los ojos y la fragilidad de la sección de la retina. Imperativo para la práctica, tener un protocolo detallado que proporcione un método y consejos eficientes es la clave para la disección y sección de la retina de alta calidad. Proporcionamos consejos y consejos para ayudar a los investigadores a evitar escollos comunes y obtener algunas secciones de retina de alta calidad adecuadas para la inmunohistoquímica.Marque la parte temporal del ojo de un ratón eutanizado usando un cauterizador de cola tocando la córnea muy ligeramente y durante no más de una fracción de segundo para quemar ligeramente la córnea y evitar hacer un agujero. Inmediatamente después se utilizó púas curvadas Dumont 545 para enuclear los ojos del ratón. Coloque los ojos en un criotubo de 1,5 mililitros con un mililitro de 4%PFA y PBS e incubar durante 15 minutos sobre hielo.Luego, transfiera los ojos fijos usando los fórceps curvos Dumont 545 a una placa de disección de 35 milímetros modificada llena de PBS y colóquelas bajo microscopio de disección. Utilice una microknife para hacer una pequeña incisión en la marca de quemadura perpendicular y justo por encima del borde del limbo de la córnea. Inserte tijeras curvas en la incisión y realice un corte circunferencial de la córnea después del limbo.Luego, usando fórceps delgados de Dumont 5, retire la córnea, extraiga la lente y levántela delicadamente lejos de la parte posterior del ojo. El cuerpo vítreo saldrá con la lente y la retina será visible como una superficie blanca que cubre el interior de la copa del ojo posterior. Lave las copas de los ojos aisladas dos veces en un mililitro de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.Para proteger las copas de los ojos, equilibrelas en 15% de sacarosa y PBS durante la noche a cuatro grados centígrados hasta que se hundan. Luego transfiera las copas de los ojos a 30%sucrose y PBS durante dos a tres horas hasta que se hundan. Coloque las copas de los ojos en OCT en criomoldeos de 10 por 10 milímetros para incrustar.Bajo un microscopio diseccionador, oriente el ojo en el criomodo a lo largo de su eje ventral dorsal girando el ojo hasta que la marca de quemadura esté en la parte superior. El nervio óptico es uno a la izquierda y la parte cortada del molde mira hacia la derecha. Para congelar el tejido de la retina, sumerja el criomodo durante al menos cinco minutos en un vaso de precipitados metálicos que contenga isopentano y luego coloque el vaso de precipitados en nitrógeno líquido hasta un tercio de la altura del vaso de precipitados.Retire el bloque congelado, envuélvalo en papel de aluminio y guárdelo a menos 80 grados Centígrados. Utilice un bolígrafo o Sharpie para marcar el bloque congelado para registrar su orientación. Después de ajustar la temperatura del criostato entre menos 20 y menos 25 grados Celsius, coloque los moldes que contienen las copas de los ojos incrustadas en el interior y permita que se equilibren a la temperatura del criostato durante una hora.Instale el bloque en el criostato con la orientación ventral dorsal y comience a cortar secciones seriales de 10 micrómetros de espesor. Coloque cuidadosamente las secciones de la retina en diapositivas de microscopio anotadas y numeradas y luego guárdelas a menos 20 grados Celsius o menos 80 grados Celsius hasta que estén listas para la inmunosudera. Inmunohistoquímica con anticuerpos contra la rodopsina, un marcador de fotorreceptor, descarboxilasa 65 de ácido glutámico y marcador de células de amacrina, sintetasa de glutamina y marcador celular Muller, y calbindina, un marcador celular horizontal en secciones de la retina.Los resultados indican que este protocolo produce secciones de retina de alta calidad y bien conservadas a diferencia de las secciones de retina de mala calidad obtenidas de un protocolo diferente. Los segmentos internos y externos ricos de Rhodopsin permanecen verticales e intactos con poca o ninguna separación del epitelio pigmentado de la retina. Las interneuriones, como las células de amacrina positivas Gad65, permanecen correctamente estratificadas dentro de la capa nuclear interna y la capa plexiforme interna.Además, las células De Muller permanecen bien conservadas con soma correctamente alineado en procesos citoplasmáticos que abarcan desde la capa celular ganglionar hasta la capa nuclear externa. Además, las células horizontales bien definidas son detectables en la capa nuclear interna y el borde exterior de la capa plexiforme. Es importante marcar la región topper de los ojos y mantener la orientación durante la incrustación.Prepare siempre el paraformaldehído bajo el capó con el equipo de protección personal adecuado.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describe un protocolo para la perfusión transcardiaca de los ratones, la eliminación y la sección del cerebro, así como la tinción con inmunoperoxidasa, la incrustación de resina, y ultrafinas de seccionamiento de las secciones del cerebro. Al término de estos procedimientos, el material immunostained está listo para el examen con microscopio electrónico de transmisión.

Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

La retina murino neonatal proporciona un modelo bien caracterizado fisiológica de la angiogénesis, que permite que las investigaciones de las funciones de los diferentes genes o fármacos que modulan la angiogénesis en...

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

El protocolo descrito aquí es para la evaluación estructural de una preparación de retina de montaje completo. Esto incluye descripciones de la disección de tejidos, el montaje en un inserto de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) hidrofilizado, la carga en bolo con marcadores fluorescentes y una comparación de la fijación con carbodiimida y paraformaldehído para el análisis inmunohistoquímico de componentes celulares y sinápticos.

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

Demostrar técnicas de preparación de tres tejidos diferentes para la visualización de immunohistochemical del pericitos microvasculares retina de rata, es decir, cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica aislamiento de la red vascular.

Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares

El objetivo de este informe es describir el protocolo para la detección de immunohistochemical robusto de marcadores epigenéticos, 5-METILCITOSINA (5mC) y 5-hidroximetilcitosina (5hmC) en el desarrollo y postmitotic retina de ratón.

La detección de Immunohistochemical de la 5-METILCITOSINA y 5-hidroximetilcitosina en desarrollo y en la Retina de ratón Postmitotic

Aquí presentamos un protocolo para adaptar el método de la CLARIDAD de los tejidos cerebrales para las retinas del entero-montaje para mejorar la calidad de la coloración immunohistochemical estándar y de la proyección de imagen de alta resolución de neuronas retinianas y de sus estructuras subcelulares.

Inmunostaining De Retinas De Montaje Completo Con El Método De Claro De Tejido CLARITY

Los modelos de ratón pueden ser herramientas útiles para investigar la biología del epitelio pigmentado de la retina (EPR). Se ha establecido que los ratones pueden desarrollar una serie de patologías del EPR. Aquí, describimos un protocolo de fenotipado para dilucidar y cuantificar patologías de EPR en ratones utilizando luz, electrones de transmisión y microscopía confocal.

Un protocolo para evaluar y cuantificar patologías del epitelio pigmentado retiniano en modelos murinos de degeneración macular relacionada con la edad

Este protocolo describe los pasos detallados de la microscopía inmunoelectrónica previa a la incorporación, con un enfoque en la exploración de los circuitos sinápticos y la localización de proteínas en la retina.

Investigación de circuitos retinianos y localización molecular mediante microscopía inmunoelectrónica previa a la inclusión

Los pericitos de la vasculatura de la retina se examinaron mediante tinción inmunofluorescente con receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas β después de la inyección retroorbitaria de lectina fluorescente de tomate. La retina marcada se trató posteriormente con el método de limpieza de tejidos y se montó completa para visualizar las vistas tridimensionales de los pericitos que rodean la vasculatura de la retina bajo un microscopio confocal.

Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción 

Se describe un protocolo para preparar criosecciones de retina en ratones y realizar inmunotinción en fotorreceptores. Este artículo permite a los investigadores producir de forma consistente secciones congeladas de retina de ratón con una morfología bien conservada y resultados de inmunotinción de alta calidad.

Criosección e inmunotinción de retina de ratón

La retina exhibe una organización espacial compleja a través de su estructura laminar. La transcriptómica espacial moderna y las técnicas de secuenciación requieren secciones de tejido &lt; 20 μm de grosor, lo que limita su aplicabilidad en la investigación de la retina. Este método de criosección recién congelada produce secciones delgadas en la cara de la retina del ratón al tiempo que preserva las relaciones espaciales planas, lo que permite un mapeo molecular completo a través de las...

En la cara Crioseccionamiento de retina de ratón para análisis molecular espacial de alta dimensión

Aprende a preparar criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica usando dissección ocular, fijación en paraformaldehído y crioseccionado. Este protocolo preserva estructuras celulares para análisis detallado en neurociencia.

Preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica

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