Name: Evaluación de la capacidad de respuesta del tono vascular utilizando arterias mesentérica aisladas con un enfoque en la modulación por tejidos adiposo perivasculares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a evaluar la respuesta vascular en arterias mesentéricas aisladas de ratones mediante miografía de alambre. Este método permite estudiar la modulación del tono vascular por tejido adiposo perivascular y su relación con la hipertensión.

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Este trabajo fue el apoyo financiero de las becas del Consejo de becas de investigación de Hong Kong [17124718 y 17121714], el fondo de investigación sanitaria y médica de Hong Kong [13142651 y 13142641], el fondo de investigación colaborativa de Hong Kong [C7055-14G], y el National Basic Programa de investigación de China [973 Program 2015CB553603].

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aparte de las células endoteliales, las señales derivadas de la PVAT juegan un papel importante en la regulación de la reactividad del tono muscular suave30. La pvat sana libera no y la adiponectina antiinflamatoria para ejercer un efecto anticontráctil en las arterias, que se pierde en condiciones patológicas como la obesidad y el síndrome metabólico31,32. En los Estados de enfermedad, pvat contribuye al desarrollo de la disfunción endote...

Las dilataciones y constricciones de las arterias se logran mediante relajaciones y contracciones, respectivamente, de sus células musculares lisas vasculares. Los cambios en la capacidad de respuesta vascular de las arterias pequeñas contribuyen a la regulación homeostática de la presión arterial por los nervios y las hormonas autonómicas presentes en la sangre (p. ej., catecolaminas, angiotensina II, serotonina, vasopresina). A nivel local, las respuestas vasculares de las células musculares lisas son modulada por las señales de las células endoteliales de la íntima y el tejido adiposo que rodea las arterias (figura 1).
El endotelio no es sólo una barrera pasiva, sino que también sirve como una superficie para intercambiar señales entre la sangre y las células musculares lisas vasculares subyacentes. Al liberar varias sustancias vasoactivas, el endotelio desempeña un papel fundamental en el control local de las respuestas del tono vascular1. Por ejemplo, en respuesta a la acetilcolina, óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) se activa en el endotelio para producir óxido nítrico (NO), que induce la relajación del músculo liso vascular subyacente mediante la activación soluble guanylyl ciclasa (sGC) 2. otras sustancias vasoactivas incluyen los productos de ciclooxigenasas (p. ej., prostaciclina y tromboxano A2), lipoxigenasa (por ejemplo, ácidos 12-hidroxieicosatetraenoico, 12-hete) y monooxigenasas del citocromo P450 (HETES y ácidos epoxieicosatrienoicos, EETs), especies reactivas de oxígeno (ROS) y péptidos vasoactivos (p. ej., endotelina-1 y angiotensina II) y factores hiperpolarizantes derivados del endotelio (EDHF)3. Un delicado equilibrio entre los vasodilatadores derivados del endotelio y vasoconstrictores mantienen el tono vasomotores local4,5.
La disfunción endotelial se caracteriza por el deterioro de la vasodilatación dependiente del endotelio6, un sello distintivo del envejecimiento vascular7. Con la edad, la capacidad del endotelio para promover la vasodilatación se reduce progresivamente, debido en gran parte a una disminución NO biodisponibilidad, así como la expresión anormal y función de eNOS en el endotelio y sGC en las células musculares lisas vasculares8 , 9 , 10. la reducción de la biodisponibilidad no potenciúa la producción de vasoconstrictores dependientes del endotelio11,12. En las arterias envejecidas, la disfunción endotelial causa hiperplasia en los medios, como se refleja en los aumentos marcados en el espesor de la pared, número de núcleos mediales, que son una reminiscencia del engrosamiento arterial en la hipertensión y la aterosclerosis observada en humanos pacientes13,14. Además, condiciones fisiopatológicas como la obesidad, diabetes o hipertensión aceleran el desarrollo de la disfunción endotelial15,16.
El tejido adiposo perivascular (pvat) libera numerosos Adipocinas para regular la estructura vascular y la función17. El efecto anticontráctil de la pvat está mediado por factores relajantes, como adiponectina, no, peróxido de hidrógeno y sulfuro de hidrógeno18,19,20. Sin embargo, dependiendo de la ubicación y la condición fisiopatológica, PVAT también puede mejorar las respuestas contráctiles en varias arterias21. Las sustancias procontráctiles producidas por pvat incluyen angiotensina-II, leptina, resistin y Ros22,23.  En la mayoría de los estudios sobre los vasos sanguíneos aislados, PVAT se ha considerado como un simple apoyo estructural para la vasculatura y así eliminado durante la preparación de los segmentos de anillo de los vasos sanguíneos. Dado que la disfunción adiposa representa un factor de riesgo independiente para la hipertensión y las complicaciones cardiovasculares asociadas24, la pvat que rodea los vasos sanguíneos debe tenerse en cuenta al investigar la respuesta vascular de diferentes arterias.
Los sistemas de miografía de alambre múltiple han sido ampliamente utilizados para investigar las funciones vasomotoras de una variedad de vasos sanguíneos, incluyendo las arterias aorta, mesentérica, renal, femoral, cerebral y coronaria25,26. Los protocolos descritos en este documento utilizarán la miografía por cable para evaluar la capacidad de respuesta vascular en las arterias mesentérica aisladas de los modelos de ratones modificados genéticamente, con un enfoque especial en la modulación por PVAT.

<table><tbody><tr><td>Acetilcolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6625</td><td><fuerte>Concentración de existencias</fuerte>: 10-1 M <fuerte>Concentración de trabajo</fuerte>: 10-10 a 10-5 M</td></tr><tr><td>L-NOMBRE (N&omega;-nitro-L-arginina metil éster)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5751</td><td><fuerte>Concentración de existencias</fuerte>: 3 x 10-2 M <fuerte>Concentración de trabajo</fuerte>: 10-4 M</td></tr><tr><td>Phenylephrine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6126</td><td><fuerte>Concentración de existencias</fuerte>: 10-2 M <fuerte>Concentración de trabajo</fuerte>: 10-10 a 10-5</td></tr><tr><td>M U46619 (9,11-dideoxi-9&alfa;,11&alfa; prostaglandina de metanoepoxi F2&alpha;)</td><td>Enzo</td><td>BML-PG023-0001</td><td><fuerte>Concentración de existencias</fuerte>: 10-5 M <fuerte>Concentración de trabajo</fuerte>: 1-3 x 10-8 M</td></tr><tr><td>Micógrafo multihilo</td><td>Danish MyoTechnology (DMT)</td><td>620M</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 4/26</td><td>ADInstruments</td><td>ML848</td><td></td></tr><tr><td>Labchart7</td><td>ADInstruments</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ratones de tipo salvaje Adipo-SIRT1</td><td>Unidad de Animales de Laboratorio, Universidad de Hong Kong</td><td>Nº CULATR: 4085-16</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri recubiertas de silicona</td><td>Miotecnología danesa (DMT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alambres de tungsteno Miotecnología</td><td>danesa (DMT)</td><td>300331</td><td></td></tr><tr><td>Herramientas</td><td></td><td></td><td></td> quirúrgicas</tr></tbody></table>

evaluación de la capacidad de respuesta del tono vascular utilizando arterias mesentérica aisladas con un enfoque en la modulación por tejidos adiposo perivasculares

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

La respuesta alterada del tono vascular a los estímulos fisiopatológicos contribuye al desarrollo de una amplia gama de enfermedades cardiovasculares y metabólicas. La disfunción endotelial representa un importante causante de la reducción de la vasodilatación y una mayor vasoconstricción de las arterias. Los tejidos adiposo (grasa) que rodean las arterias desempeñan un papel importante en la regulación de la relajación y/o contracción dependiente del endotelio de las células musculares lisas vasculares. Las conversaciones cruzadas entre el endotelio y los tejidos adiposos perivasculares pueden evaluarse ex vivo utilizando vasos sanguíneos montados por un sistema de miografía por cable. Sin embargo, se deben establecer ajustes óptimos para las arterias derivadas de animales de diferentes especies, edades, antecedentes genéticos y/o condiciones fisiopatológicas.

Examen de las relaciones de longitud/tensión para obtener el factor de normalización k
La cantidad de estiramiento aplicada a un segmento de recipiente influye en la extensión de la interacción actina-miosina y, por tanto, en la fuerza activa máxima desarrollada. Por lo tanto, para cada tipo de vaso sanguíneo, se requiere determinar la cantidad de estiramiento necesaria para la fuerza activa máxima para...

El protocolo describe el uso de la miografía por cable para evaluar la tensión isométrica transmural de las arterias mesentérica aisladas de los ratones, con especial consideración de la modulación por factores liberados de las células endoteliales y los tejidos adiposo perivasculares.

Evaluación de la capacidad de respuesta del tono vascular utilizando arterias mesentérica aisladas con un enfoque en la modulación por tejidos adiposo perivasculares

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Se requiere un protocolo muy estricto para que podamos comparar válidamente preparaciones de los mismos animales o de diferentes animales o arterias en presencia o ausencia de la grasa que los rodea o en presencia o ausencia del endotelio. La principal ventaja de esta técnica experimental es que podemos comparar anillos de la misma arteria bajo condición isométrica y así sacar conclusiones válidas sobre el impacto de los factores experimentales que investigamos. Este protocolo proporciona información sobre la modulación de la capacidad de respuesta vascular por tejidos adiposos perivasculares de diferentes animales modificados genéticamente.Las disfunciones del tejido adiposo representan un factor de riesgo independiente para la hipertensión y sus complicaciones cardiovasculares asociadas. Nuestro miógrafo implica múltiples pasos complicados que requieren extrema precaución en cada punto para evitar dañar el recipiente, especialmente durante el montaje, y para asegurarse de que el recipiente responde adecuadamente a varios estímulos. Comience este procedimiento con preparaciones y disección de los anillos arteriales mesentéricos como se describe en el protocolo de texto.Encienda el ordenador y abra el software de grabación de datos. Guarde el experimento como un archivo de datos de gráfico de laboratorio con un nuevo nombre para evitar sobrescribir el archivo de configuración original. Abra la ventana de configuración de normalización y establezca el factor K en uno.Acepte los valores predeterminados para la calibración de direcciones IP, la presión objetivo, el tiempo de promediación en línea y el tiempo de retardo. Haga clic en Aceptar para guardar la configuración. Seleccione los canales de interés e introduzca el diámetro del cable, los puntos finales del tejido y la lectura inicial del micrómetro en la ventana de normalización.Para iniciar el procedimiento de normalización, aplique el primer estiramiento pasivo al vaso sanguíneo girando el tornillo micrómetro en sentido antihorario. Después de esperar tres minutos para que el recipiente se estabilice, introduzca la nueva lectura del micrómetro en la ventana de normalización. La tensión de la pared se calcula automáticamente y se muestra como un punto en el gráfico.Después de cada estiramiento pasivo, reemplace el tampón de krebs de control por un krebs iso-osmóticos altos en potasio que contengan cloruro de potasio de 150 mililitrolares. Cuando la contracción alcance una meseta en unos tres minutos, registre la fuerza activa restando la fuerza pasiva en cada tramo de la fuerza activada por potasio. Calcular la tensión de la pared, así como los valores de circunferencia interna.Elimine la condición alta de potasio reemplazando el tampón de potasio alto con un tampón de krebs fresco. Repita el lavado tres veces durante cinco minutos. Repita los pasos de normalización induciendo estiramientos pasivos seguidos de contracción activa en giros alternativos hasta que la tensión activa comience a disminuir.Lave a fondo el tampón de krebs de potasio alto y equilibre las preparaciones durante otros 30 a 45 minutos. Restablezca las tensiones basales a cero para que solo se registren las respuestas contráctiles activas durante el experimento posterior. Preparar y montar anillos arteriales emparejados como se describe en el protocolo de texto de las secciones adyacentes de cada arteria.Prepare un anillo arterial con PVAT intacto y el otro con PVAT eliminado. Después de la normalización, precontrate los segmentos arteriales con alto tampón de krebs de potasio añadiendo 115 solución de cloruro de potasio milimolar a la cámara que contiene krebs. Después de la contracción al período de la meseta, lave el potasio alto y reemplace el tampón con un tampón de krebs aireados frescos.Repita el lavado tres veces durante cinco minutos. Repita la estimulación del cloruro de potasio y el lavado tres veces y registre la respuesta máxima contráctil al cloruro de potasio restando la tensión basal de la tensión debida a la estimulación del cloruro de potasio. Después de la última contracción y lavado, rellene la cámara con un tampón de krebs caliente y aireado y permita que la arteria se recupere durante unos 30 minutos antes de realizar la siguiente tarea.A cada cámara, añadir cantidades acumuladas de fenilefrina para inducir los aumentos dependientes de la concentración y la tensión isométrica de los preparados de reposo. Después de añadir la última dosis de agonista, lavar el medicamento a fondo y rellenar la cámara con tampón de krebs frescos. Trazar las respuestas dependientes de la concentración como porcentajes crecientes de las contracciones máximas inducidas por cloruro de potasio.Para evaluar la contribución del óxido nítrico, incubar los preparados con el inhibidor de la síntesis de óxido nítrico L-NAME durante 30 minutos antes de la adición de fenilefrina. Para realizar una segunda curva de respuesta de concentración secuencialmente, lave la cámara completa y repetidamente para eliminar todos los agonistas anteriores hasta que no se observen más cambios de tono. Se realizó la normalización de la relación longitud-tensión para las arterias mesentéricas aisladas de modelos de ratón alimentados con comida estándar o una dieta alta en grasas.Se estableció una relación longitud-tensión pasiva mediante el estiramiento incremental de los segmentos de la arteria hasta que se obtuvo una circunferencia interna correspondiente a 100 milímetros de presión transmural de mercurio, o IC100. Después de cada estiramiento, se aplicó cloruro de potasio militimario de 115 mililitros para estimular las contracciones. Las curvas de tensión de longitud activa se trazaron a partir de los datos de fuerza activa en el eje Y y los valores IC calculados a partir de los datos del micrómetro en el eje X.Un valor IC que se encuentra dentro de la meseta del pico es IC1. El factor de normalización, K, se calculó como la relación de IC1 e IC100, que luego podría aplicarse a muestras del mismo tipo de recipiente en el experimento posterior. Aquí se muestran grabaciones de salida de las respuestas vasoconstrictoras a fenilefrina en arterias mesentéricas con o sin PVAT circundante.Se aplicaron concentraciones acumuladas de fenilefrina para estimular las contracciones de las arterias mesentéricas recogidas de 16 semanas de edad adiposet un ratones. Las respuestas contráctiles se registraron y calcularon como un porcentaje de 150 contracción máxima inducida por cloruro de potasio milimétrico. El área bajo las curvas de contracción se trazaron para la comparación.Tenga en cuenta que PVAT de adiposet un ratone provocó un efecto anticontráctil en la respuesta a la fenilefrina. Al obtener contracciones inducidas por KCL, las respuestas tienen que ser estables y estables. Si la respuesta sigue aumentando después de tres administraciones incrementales de KCL, puede ser necesaria la estimulación de KCL.Para lograr condiciones óptimas de las tensiones, el paso de normalización es muy importante, ya que esto determina la fuerza para abrir los vasos sanguíneos. Si no se hace correctamente, afectará a todo el experimento. Este protocolo se puede aplicar a otros entornos además de la contracción o relajación inducida por fenilefrina.Por ejemplo, en presencia o ausencia de tejido adiposo perivascular, nervios autónomos o endotelio. Con este protocolo, los investigadores pueden examinar pequeños vasos sanguíneos a partir de modelos animales enfermos bajo diferentes condiciones fisiopatológicas, como obesidad, diabetes y enfermedades cardiovasculares.

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Investigación

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Biología

Un método automatizado para miografía las medidas de fuerza en las arterias mesentéricas aisladas se describe. Se emplea un miografía Auto Mulvany-Halpern alambre doble 510A para determinar las respuestas a la fenilefrina y el calcio extracelular. El método permite la determinación constante de respuestas a los agonistas isométricos en los pequeños vasos de diámetros de 60 a 300 micras, de forma independiente.

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Miografía de presión se utiliza para evaluar vasoactividad de las pequeñas arterias que se desarrollan constricción sostenida cuando se presuriza. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para evaluar en segmentos aislados de pequeñas arterias mesentéricas de ratas, vasoactividad y el efecto de la presión intraluminal del diámetro vascular.

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Evaluación de la capacidad de respuesta del tono vascular utilizando arterias mesentérica aisladas con un enfoque en la modulación por tejidos adiposo perivasculares

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