Generación de células madre neuronales inducidas a partir de células mononucleares periféricas y diferenciación hacia precursores de neuronas dopaminérgicas para estudios de trasplante

Este protocolo describe un método para reprogramar la sangre y las células mononucleares a las células madre neurales que se pueden utilizar para tratar enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson. Ofrece una fuente celular autóloga para tratar enfermedades neurodegenerativas. Además, el período de tiempo necesario para la conversión a células madre neurales inducidas y la diferenciación a los tipos de células deseadas es más corto que para las células madre pluripotentes inducidas.

Las células madre neurales inducidas poseen una buena capacidad proliferativa y se pueden escalar antes de la aplicación. Dado que los iNSC se pueden especificar en diferentes células neuronales específicas de la región, como las neuronas de la médula espinal o las neuronas motoras, este método puede extenderse para el tratamiento de otras enfermedades neurológicas. Todo el procedimiento toma mucho tiempo, con todos los pasos relacionados y críticos, por lo que la demostración visual da una idea sobre cómo se ven las celdas y proporciona algunos consejos para asegurar una generación exitosa de las células deseadas.

Para comenzar, transfiera sangre venosa periférica previamente aislada a un tubo cónico de 50 mililitros, y diluya con un volumen igual de PBS estéril de Dulbecco. En otro tubo cónico de 50 mililitros, prepare 15 mililitros de medio de gradiente de densidad esterilizada. Incline el tubo en un ángulo de 45 grados, y coloque lentamente y cuidadosamente 30 mililitros de sangre periférica diluida en el medio de gradiente de densidad.

Centrifugar el tubo a 800 veces g durante 15 minutos a temperatura ambiente con el freno centrífugo en la posición de apagado. Aspirar la capa amarilla del plasma superior y desecharla. Utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir la capa de película delgada blanca y turbia que contiene células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.

Añadir 30 mililitros de D-PBS al tubo con MNC, y centrifugar a 600 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de descartar el sobrenadante, agregue 45 mililitros de D-PBS y resuspend las células. Después de centrifugar el tubo a 400 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, deseche el sobrenadante.

Resuspender las células con cinco mililitros de D-PBS, contar las células vivas con el método de exclusión azul trypan, dejar a un lado los MNC necesarios para la expansión y congelar las células restantes para su uso futuro. En el día menos 14, MNC de semilla a una densidad de dos a tres millones de células por mililitro por pozo de placa de seis pozos con 1,5 mililitros de 37 grados Celsius, medio MNC precalentado. Incubar a 37 grados centígrados, 5% dióxido de carbono durante dos días.

El día menos 11, utilice una pipeta esterilizada para recoger las células con el medio y transferir a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar a 250 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y resuspender las células en un mililitro de medio MNC precalentado. Después de contar las células viables con azul tripano, siembra los MNC a una densidad de un millón de células por mililitro en medio MNC precalentado en una placa de seis pozos.

Incubar a 37 grados centígrados, 5% dióxido de carbono durante tres días, y repetir la recolección, centrifugación y enchapado de células en medio de la MNC en días menos ocho y menos cuatro. El virus Sendai en este procedimiento es peligroso, y todos los procedimientos que involucran el virus Sendai deben realizarse en un gabinete de seguridad. Y todas las puntas y tubos expuestos al virus Sendai deben tratarse con etanol o lejía antes de su eliminación.

En el día cero, recoja las células en medio MNC y transfiera a un tubo cónico de 15 mililitros. Después de centrifugar las células a 200 veces g durante cinco minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender las células con un mililitro de medio MNC precalentado. Contar las células viables con tripano azul, y luego resuspenderlas con medio MNC precale calentado a una concentración de 200.000 células por pozo en placas de 24 pozos.

Descongelar los tubos retirados de menos 80 grados Celsius almacenamiento que contiene el virus Sendai en un baño de agua Celsius de 37 grados durante cinco a 10 segundos, y luego dejarlos descongelarlos a temperatura ambiente. Una vez descongelados, colóquelos inmediatamente sobre hielo. Añadir el virus Sendai descongelado a los pozos de la placa de 24 pozos con MNC a una multiplicidad de infección de 10.

Para facilitar la unión de las células, centrifugar las placas a 1.000 veces g durante 30 minutos y después colocar las placas en la incubadora a 37 grados Celsius, 5%dióxido de carbono. En el primer día, transfiera las células con el medio a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Para separar aún más las células restantes, enjuague los pozos con un mililitro de medio MNC por pozo y agregue las células con medio al tubo.

Después de centrifugar la suspensión celular a 200 veces g durante cinco minutos, aspirar el sobrenadante, resuspender las células con 500 microlitros de medio MNC precalentado fresco, y añadir a un pozo de una placa de 24 pozos. En el segundo día, utilice un mililitro por pozo de 50 microgramos previamente diluidos por microlitro de poli-lisina en D-PBS para recubrir placas de seis pocillos durante al menos dos horas a temperatura ambiente. Aspirar poli-D-lisina de las placas de seis pocillos, y secar en el banco limpio vertical durante unos 10 minutos.

A continuación, agregue un mililitro por pozo de un cinco microgramos previamente diluido por mililitro de laminina a las placas de seis pozos, e incubar durante cuatro a seis horas a 37 grados centígrados para cubrir. Lave las placas con D-PBS antes de su uso. En el tercer día, placa de todos los MNC transducidos por el virus Sendai en medio de células madre neurales inducidas en las placas de seis pocillos recubiertas de poli-D-lisina/laminina.

En los días cinco y siete, agregue suavemente un mililitro de 37 grados Celsius, medio iNSC precalentado a cada pozo de las placas de seis pozos. Desde el día nueve hasta el día 28, sustituya el medio por un medio iNSC precalentó al día. Monitorear la aparición de colonias iNSC, y en aproximadamente dos a tres semanas recoger colonias con morfología apropiada usando pipetas de vidrio quemado y transferir cada colonia a un pozo separado de una placa de seis pozos para su expansión.

Para establecer modelos unilaterales de ratón lesionados por 6-hipoxidopamina, afeite la cabeza de un ratón anestesiado, adulto, masculino, SCID-beige, y aplique pomada ocular de eritromicina. Coloque el ratón en el aparato estereotaxico y fije el ratón con barras incisivas. Inserte los auriculares correctamente para colocar la cabeza del ratón de forma segura y adecuada.

Esterilice la cabeza con yodo povidona y alcohol isopropílico, y luego use una cuchilla de bisturí para hacer una incisión sagital de aproximadamente 1,5 centímetros en la piel de la cabeza, exponiendo el cráneo. Ajuste la barra incisiva y las barras de los oídos para reducir la diferencia de altura entre bregma y lambda a menos de 0,1 milímetros. Mueva y baje lentamente la punta de la aguja de la microjeringa hacia el bregma, y trate el bregma como el punto cero.

Mueva la punta a una posición con coordenadas anteriores de 0,5 milímetros y laterales de 2,1 milímetros en relación con el bregma. Retirar la punta, marcar el punto con un rotulador y, con un taladro electrónico, rebabar un pequeño agujero en el cráneo. Extraiga dos microlitros de cinco microgramos por mililitro de 6-hiproxidopamina solución en la microsyringe.

Vuelva a colocar la aguja en el punto marcado e inserte la aguja en dorsal/ventral 3,2 milímetros. Inyecte la solución de 6-hiroxidopamina de la jeringa a una velocidad de un microlitro por minuto, deje la aguja de inyección en su lugar durante otros cinco minutos y luego retraiga lentamente. Después de cerrar la incisión con suturas, aplique de nuevo la pomada del ojo de eritromicina en los ojos.

Retire el ratón del aparato estereotaxico, colótelo en la jaula de recuperación y permita el acceso a los alimentos y al agua hasta que recupere la conciencia. Después de que los PBMC se infectaron con SeV, su morfología estaba cambiando y las células sufrieron una muerte drástica hasta el quinto día. Las colonias del INSC surgieron el día 12.

Después de recoger y transferir clones de iNSC para su expansión para una serie de pasajes, mostraron una buena morfología y podrían auto-renovarse establemente en el medio iNSC, ya sea en forma monocapa o como esferas. Después de 24 días de diferenciación, iNSCs fueron identificados como neuronas dopaminérgicas como la mayoría de ellos expresado tirosina hidroxilasa, caja de cabeza de bifurcación A2, y marcadores de beta-tubulina clase III específica de neuronas. Después del establecimiento de modelos unilaterales de ratón por enfermedad de Parkinson con 6-hiroxidopamina, se llevó a cabo una evaluación del comportamiento para estimar los síntomas de la enfermedad de Parkinson.

Los ratones que habían recibido trasplante celular mostraron una mejora significativa en la función motora. La extensión de la lesión inducida por 6-hiroxidopamina fue verificada por la tinción inmunofluorescente post mortem para TH en el estriado, el haz de forebrain medial y la sustancia nigra pars compacta. Las señales TH positivas se recuperaron en gran medida en el estriado, donde las células fueron implantadas y también ligeramente recuperadas en SN. Tres meses después del trasplante, entre las células supervivientes, alrededor del 13,84% fueron neuronas dopaminérgicas TH positivas.

Alrededor del 91,72% de las células TH positivas expresaron receptor nuclear huérfano, alrededor del 86,76% expresó FOXA2, y alrededor del 98,77% fueron co-etiquetados con potasio rectificador interno acoplado a proteínas G. Cuando coloque 30 mils de sangre periférica diluida en el medio de gradiente de densidad, há hacerlo lentamente y cuidadosamente, para no perturbar la interfaz de gradiente. Se debe tener cuidado para evitar la descongelación repetida y la congelación del virus De Sendai para garantizar una alta actividad del virus.

Al reprogramar células mononucleares de sangre periférica a células madre neurales inducidas, por favor observe atentamente la morfología de las células todos los días. Además, la 6-hidroxidopamina es sensible a la luz y a la temperatura. Tenga cuidado de proteger la solución de la luz y manténgala en hielo antes de usarla.

Después de este procedimiento, uno puede continuar estudiando los mecanismos de la enfermedad mediante el uso de p. de rendimiento familiar de las neuronas dopaminérgicas derivadas del paciente en el cultivo. También se puede continuar investigando cómo las células trasplantadas influyen en los circuitos neuronales dañados.