Grabación óptica de campo ancho de un solo fotón en cortes cerebrales con tinte sensible al voltaje
20 de junio de 2019
Introducimos un método de grabación óptica reproducible y estable para las rebanadas cerebrales utilizando tinte sensible al voltaje. El artículo describe la tinción de tinte sensible al voltaje y el registro de señales ópticas utilizando preparaciones convencionales de corte de hipocampo.
El método de grabación óptica con tinte sensible al voltaje se cree que es una tecnología ideal para visualizar cómo funciona el cerebro. Este método nos permitió registrar una dinámica neuropsíquica de forma estable y confiable durante 12 horas, nos dio una visión sobre la actividad psíquica. Estamos tratando de ampliar la aplicación para detectar los cambios de circuito causados por los productos químicos en todas las etapas de desarrollo, como la aplicación de ácido valioso a las madres.
La técnica ya está bien establecida. Por favor, intente reproducir los estudios siguiendo el método presentado aquí. Para iniciar este procedimiento, sumerja la cabeza decapitada en ACSF helada en una bandeja quirúrgica de acero inoxidable.
Extraiga el cerebro en un minuto y colóquelo en un vaso de precipitados que contenga ACSF refrigerado durante cinco minutos. A continuación, divide la sección cerebral en la línea media con un bisturí y coloca ambos hemisferios en un bloque de 4%agar. Luego, coloca el bloqueo cerebral con ambos hemisferios en un bloque de 4% de agar.
Limpie el exceso de ACSF del bloque con un papel de filtro. Posteriormente, aplicar superpegamento a la plataforma del vibratome. Coloque el bloque de agar sobre él y limpie el adhesivo excesivo con un papel de filtro.
Aplicar suavemente una pequeña cantidad de hielo frío ACSF desde la parte superior del bloque de agar cerebral para ayudar a solidificar el exceso de superpegamento y evitar que el pegamento cubra el cerebro y moleste el corte. Después, fije la plataforma a la bandeja vibratoria y vierta el ACSF modificado. Ajuste el vibratome a una velocidad lenta y tenga la frecuencia de la hoja en su ajuste máximo.
Entonces empieza a cortar. Coloque los rodajas en la esquina de la cámara de corte en secuencia para que el orden de las rebanadas se pueda distinguir fácilmente. Por lo general, se pueden obtener de tres a cinco rebanadas de un hemisferio.
A continuación, corte la porción del tallo cerebral con una aguja de calibre 30. Con un pequeño pincel con punta, coloque la rebanada en el filtro de membrana sostenido con un anillo de plexiglás. Coloque el anillo en una cámara de recuperación húmeda y asegure la cubierta para mantener la presión interna alta.
Al colocar la rebanada en el filtro de membrana, ajuste la dirección y la posición de la rebanada dentro del anillo para asegurarse de que está bien centrada y tiene una dirección consistente. Deje el espécimen a 28 grados centígrados durante 30 minutos y luego a temperatura ambiente durante al menos 10 a 30 minutos para su recuperación. Para manchar las rodajas, aplique suavemente 100 microlitros de la solución de tinción sobre cada rodaja e incubar a 20 minutos para la temperatura ambiente.
A continuación, prepare de 50 a 100 mililitros de ACSF en un recipiente. Coloque el anillo con la muestra para enjuagar la solución de tinción. Luego, transfiera las rodajas enjuagadas a otra cámara de incubación.
Espere más de una hora para la recuperación antes del experimento. Para comenzar este procedimiento, encienda el amplificador, el ordenador y el sistema de cámara y abra el software. Vierta ACSF en un tubo de 50 mililitros y burbujee con carbógeno.
Utilice una bomba peristáltica para hacer circular el ACSF y ajustar el caudal a aproximadamente un mililitro por minuto. A continuación, ajuste la altura de la pipeta de aspiración para que el nivel de líquido dentro de la cámara del experimento sea siempre constante. Coloque el electrodo de tierra en la cámara.
Posteriormente, llene el electrodo de vidrio con una pequeña cantidad de ACSF y colóquelo en el soporte del electrodo. Fije el soporte a la varilla del manipulador. Usando un amplificador, asegúrese de que la resistencia del electrodo es de aproximadamente un megaohm.
En la sesión de grabación, transfiera una rebanada de la cámara húmeda a una cámara experimental. Presione firmemente el borde del anillo en la junta tórica de silicona. Tenga cuidado de no romper la membrana o la parte inferior de la cámara del experimento.
Bajo el microscopio coloque la punta del electrodo estimulante y el electrodo de grabación potencial de campo en la rebanada. Compruebe la respuesta evocada mediante la entrega de un estímulo. Confirme que el campo de visión cubre el circuito neural correcto en el sistema de grabación óptica.
A continuación, ajuste la intensidad de la luz de excitación a aproximadamente 70 a 80% de la capacidad máxima en la cámara. Con la fuente de luz fluorescente, ajuste el enfoque con el sistema de adquisición. A continuación, inicie la grabación y analice los datos en un software de adquisición de imágenes después de la adquisición.
Esta figura muestra la señal óptica representativa sobre la estimulación eléctrica del Schaffer collaterol en el área CA1 de una rebanada de hipocampo de ratón. Estas imágenes consecutivas muestran la señal óptica antes de que se aplicaran filtros espaciales y temporales, mientras que estas imágenes muestran los mismos datos después de aplicar un filtro cúbico de cinco por cinco por cinco dos veces. Debido a la alta velocidad de fotogramas y la alta resolución espacial, la aplicación del filtro no cambió la señal, sino que filtró el ruido que también se puede observar en el curso de tiempo registrado en píxeles en una sola prueba.
Aquí está la comparación de las respuestas típicas en el área CA1 de las rebanadas del hipocampo entre el ratón y la rata. La pequeña respuesta hiperpolarizante se observa en el lado distal de la CA1 después de 24 milisegundos en la rebanada del hipocampo del ratón, pero una respuesta hiperpolarizante más masiva superó la respuesta despolarizante en la rebanada del hipocampo de rata. Una vez que las rebanadas están manchadas, deben durar más de 12 horas y puede realizar otras grabaciones electrofisiológicas en ellos.
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Descripción general
Este estudio presenta un método estable de registro óptico mediante colorante sensible al voltaje para cortes cerebrales, centrándose en la señalización de neuronas del hipocampo. La técnica ofrece una visión confiable de la dinámica neuropsíquica durante períodos prolongados, facilitando investigaciones sobre cambios en los circuitos debidos a aplicaciones químicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Imagen óptica
Antecedentes
- El colorante sensible al voltaje es crucial para visualizar las actividades cerebrales.
- Las preparaciones convencionales de cortes de hipocampo sirven como modelo biológico.
- El estudio explora las dinámicas neuropsíquicas y las alteraciones en los circuitos.
- Los métodos anteriores carecían de fiabilidad durante tiempos prolongados de grabación.
Objetivo del estudio
- Introducir un método reproducible para la grabación óptica en cortes cerebrales.
- Proporcionar información sobre los efectos de productos químicos en la dinámica de los circuitos cerebrales.
- Permitir la observación a largo plazo de la actividad neuronal y las respuestas.
Métodos Utilizados
- La plataforma utilizada consiste en cortes cerebrales ex vivo preparados a partir del hipocampo de ratón.
- El modelo clave incluye cortes hipocampales, lo que facilita los estudios sobre la actividad eléctrica.
- No se mencionan flujos de trabajo de multiómica; el enfoque está en técnicas ópticas y electrofisiológicas.
- La preparación implica pasos minuciosos, como enfriar, teñir e incubar los cortes.
- Las sesiones de registro se realizan en una cámara experimental con requisitos precisos de configuración.
Resultados principales
- El método óptico permite la recopilación confiable de datos durante un período de 12 horas.
- La comparación de respuestas entre cortes hipocampales de ratón y rata muestra perfiles neurofisiológicos distintos.
- Los cambios electrofisiológicos, como las respuestas hiperpolarizantes, están respaldados por grabaciones ópticas.
- La técnica mejora nuestra comprensión de la dinámica de los circuitos neuronales bajo diversas condiciones.
Conclusiones
- Este método ofrece un avance significativo para el estudio de circuitos cerebrales y fenómenos neuropsíquicos.
- Permite a los investigadores observar cambios en tiempo real en la señalización neuronal.
- Comprender estos mecanismos podría proporcionar información sobre la plasticidad y posibles aplicaciones terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La imagen de voltaje mediante colorante sensible a un solo fotón de campo amplio permite una evaluación funcional estable y a largo plazo de circuitos neuronales en cortes cerebrales, abordando un desafío clave en la validación de dianas en neurociencia. El método facilita la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar lecturas ópticas cuantitativas y de alta resolución de la actividad neuronal durante períodos prolongados, lo cual es fundamental para evaluar los efectos de compuestos sobre la dinámica de circuitos en descubrimiento preclínico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización de la dinámica de la señalización neuronal en tiempo real en circuitos del hipocampo.
- Valor operativo: Proporciona grabaciones estables y reproducibles durante más de 12 horas, lo que permite la evaluación longitudinal del acoplamiento al blanco y la modulación de vías.
- Valor predictivo: Facilita la detección de cambios en los circuitos inducidos por aplicaciones químicas, ayudando en la identificación temprana de los efectos de compuestos neuroactivos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para el ensayo: Alcanza una frecuencia de cuadros de 10 kHz y una resolución de 100x100 píxeles, lo que permite un análisis temporal y espacial de alto rendimiento de las respuestas neuronales.
- Calidad de la señal: El filtrado posterior a la grabación mejora la relación señal-ruido, permitiendo la detección confiable de cambios subumbral en los circuitos, esenciales para la sensibilidad del ensayo.
- Reproducibilidad: Protocolos estables de manipulación y tinción de cortes minimizan los artefactos mecánicos, asegurando datos consistentes entre réplicas y sesiones experimentales.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Apoya la evaluación de alteraciones en circuitos de redes hipocampales, una región implicada en trastornos cognitivos y neuropsiquiátricos.
- Continuidad traslacional: Permite grabaciones ópticas y electrofisiológicas paralelas, fortaleciendo la validación de resultados funcionales a través de distintas modalidades de medición.
- Avance ajustado al riesgo: Los perfiles de respuesta distintos entre cortes de ratón y rata informan sobre la traslación entre especies y ayudan a reducir riesgos en la selección de candidatos preclínicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar lecturas funcionales de circuitos que conectan la validación de dianas con la identificación de compuestos iniciales, especialmente para compuestos neuroactivos que requieren evaluación fenotípica a nivel de circuito.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre dinámicas neuropsíquicas y la aclaración de vías mediante la visualización directa de señales ópticas evocadas en circuitos neuronales definidos.
- Tamizaje: Proporciona salidas ópticas cuantitativas y de alta resolución adecuadas para el análisis automatizado y la comparación de cambios inducidos por compuestos en la actividad neuronal.
- Análisis: Permite la aplicación de filtros espacio-temporales para extraer la señal del ruido, facilitando la cuantificación objetiva de las respuestas del circuito y la evaluación de la variabilidad.
- Investigación Traducional: Conecta las observaciones de circuitos en fase de descubrimiento con la validación preclínica al permitir grabaciones repetidas durante períodos prolongados para evaluar la estabilidad y reproducibilidad de los efectos de los compuestos.
- Reutilización Empresarial: La preparación estandarizada de cortes y la plataforma de imagenología favorecen la reutilización en múltiples proyectos y series de compuestos, reduciendo la variabilidad metodológica en cascadas de tamizaje en neurociencia.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona información mecanicista sobre la función de los circuitos neuronales, reduce la ambigüedad en la validación de objetivos y fortalece la confianza predictiva en la selección neurofarmacológica.
- Valor operativo: Mantiene las condiciones fisiológicas y previene el movimiento del corte, asegurando una adquisición de datos estable y libre de artefactos para un cribado fiable de compuestos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la detección temprana de efectos adversos o fuera del blanco en los circuitos, reduciendo el riesgo de fracaso en fases avanzadas del desarrollo de fármacos para el sistema nervioso central.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en perfiles funcionales de circuitos, mejorando la eficiencia del capital en las etapas preclínicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología, imagen óptica y manejo de tejidos para asegurar la viabilidad adecuada de los cortes y la eficiencia de la tinción.
- Depende de sistemas de cámaras de alta velocidad, fuentes de luz fluorescente y configuraciones de perfusión capaces de mantener condiciones fisiológicas durante grabaciones prolongadas.
- Necesita la estandarización de la orientación de los cortes, la duración de la tinción y los protocolos de recuperación entre diferentes equipos para minimizar la variabilidad en la línea base de la señal óptica y su respuesta.
- La adaptación a otras regiones cerebrales o modelos de enfermedad puede requerir la validación de la eficiencia de tinción y la expresión de la señal específica del circuito.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de una cuidadosa optimización de la intensidad de la luz de excitación para prevenir la fototoxicidad, al tiempo que se mantiene una amplitud de señal suficiente para su detección.
