Fluorescencia cuantitativa en hibridación situ (FISH) e inmunofluorescencia (IF) de productos genéticos específicos en células infectadas por KSHV

El protocolo es útil para obtener información cuantitativa sobre la regulación temporal de los productos génicas virales, en el contexto de las células huésped, especialmente en relación con los virus del herpes. Esta técnica puede ayudar a abordar preguntas de investigación relacionadas con los ARN y las proteínas tanto del huésped como de los RÁN virales. Además, esta técnica es compatible con ensayos bioquímicos simultáneos.

Para adherir las células a ocho portaobjetos de cámara, aplique 200 microlitros de una suspensión celular inherente a cada cámara de un portaobjetos estéril de ocho cámaras y permita el crecimiento de semillas durante 12-24 horas, a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al final de la incubación, aspirar las células sobrenadantes y no conectadas, e inmediatamente fijar las células con 4% de formaldehído pre-enfriado en PBS sobre hielo, durante 30 minutos. Al final de la fijación, lave las células con tres lavados de cinco minutos en 200 microlitros de 4 grados Celsius PBS por lavado.

Después del último lavado, permeabilizar las células fijas con 200 microlitros de pre-enfriado 0.5%Triton-X en PBS por pozo, durante 10 minutos en hielo. Al final de la permeabilización, retire cuidadosamente las cámaras sin romper el portaobjetos y enjuague las células con PBS preenfriado. Bloquear las células enjuagadas con 4%BSA preenfriado en PBS durante 30 minutos a cuatro grados Celsius, seguido de incubación con anticuerpo primario policlonal adecuado de interés en 0.1%BSA en PBS durante una hora, a cuatro grados Celsius.

Al final de la incubación, lavar las células tres veces con PBS fresco e incubar las células con un anticuerpo secundario adecuado conjugado con un fluorofórico compatible con el FISH detectando anticuerpos durante una hora, a cuatro grados centígrados. Después de tres lavados de PBS como se ha demostrado, vuelva a fijar las muestras en 4%formaldehído en PBS durante 10-15 minutos antes de una segunda permeablización como se ha demostrado. A continuación, cubra la diapositiva con papel de aluminio para preservar la señal fluorescente y evitar el fotoblandiamiento.

Y lavar las células con 2x citrato de sodio salino, antes de aplicar 45 microlitros de solución de hibridación. Después de una hora a 37 grados centígrados en una cámara humidificada, agregue agua destilada a los oligonucleótidos antisrés de interés para llevar el volumen de desnaturalización a 10 microlitros. Desnaturalizar los oligonucleótidos a 95 grados celsius durante cinco minutos, antes de añadir 35 microlitros de solución de hibridación fresca por diapositiva.

Luego incubar las muestras de 10-24 horas en la cámara humidificada a 37 grados Celsius, protegidas con papel de aluminio. Al día siguiente, lave las células con dos, 10 minutos. 2X citrato de sodio salino se lava a temperatura ambiente, seguido de un lavado en citrato de sodio salino 1X durante 10 minutos, a 25 grados centígrados.

Después del último lavado, fijar las células con 4%formaldehído pre-enfriado en PBS, durante 10-15 minutos en hielo, seguido de tres lavados con PBS fresco. A continuación, permeabilizar las muestras como se ha demostrado, seguido de la incubación con ANTI-dioxigenina FTC y pre-enfriamiento 0.1%BSA en PBS, durante una hora a cuatro grados Celsius. Al final de la incubación, lave los portaobjetos tres veces en PBX fresca y fije las muestras con 4%paraformaldehído pre-enfriado en PBS, durante 10-15 minutos a cuatro grados centígrados.

Después de tres lavados en PBS, etiquete los núcleos con 0,4 microgramos por mililitro de DAPI y pre-enfriado 0.5%Triton-X en PBS durante 15 minutos en hielo, seguido de tres lavados finales en PBS. Monte las correderas con perlas fluorescentes, según sea experimentalmente relevante y en el medio de montaje adecuado. Después de eliminar el exceso de medio de montaje con toallitas estériles, selle una cubierta a cada diapositiva con múltiples capas de esmalte de uñas transparente, y utilice un microscopio fluorescente para confirmar la ejecución exitosa del experimento.

Las imágenes pueden ser tomadas en un microscopio confocal para recoger imágenes de las muestras dentro de una hora a una semana de montaje, a un aumento 630 veces. Estos resultados representativos de FISH e inmunofluorescencia son semicuantitativos y ofrecen una visión de la localización de oligonucleótidos, en lugar de en comparaciones entre las intensidades de las diferentes manchas fluorescentes, ya que estos experimentos no incluían un cordón fluorescente en la preparación de la diapositiva. En estos experimentos, las áreas citoplasmáticas y nucleares y sus proporciones fueron diferentes para las células infectadas KSHV latentes y líticas.

Como se ilustra en esta figura, el área se controla en la relación nucleocitoplasmica. Cuando la replicación del ADN KSHV se inhibe en la fase lítica, la proteína lítica temprana de la transcripción del oligonucleótido KSHV cambia a una localización predominantemente citoplasmática. El ARN poliadenilado KSHV, sin embargo, se localiza en sitios nucleares específicos a pesar de la inhibición de la replicación del ADN viral.

Al retirar las cámaras de los portaobjetos, tenga cuidado de que haya muy poco residuo adhesivo en la herramienta, y use etanol para permeablar las células y debilitar el adhesivo. Los ensayos bioquímicos como QPCR, Western blot y secuenciación de alto rendimiento se pueden realizar en conjunto para aumentar los datos cuantitativos recopilados de los micrografías.