Name: Fluorescencia cuantitativa en hibridación situ (FISH) e inmunofluorescencia (IF) de productos genéticos específicos en células infectadas por KSHV (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Aprende a visualizar ARN virales de herpesvirus en células humanas mediante hibridación FISH cuantitativa. Este protocolo permite cuantificar la fluorescencia y combinarla con inmunofluorescencia para estudiar interacciones hospedador-virus.

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Agradecemos a Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski y Johanna B. Withers por su asesoramiento sobre el análisis de datos. También agradecemos a G. Hayward por el anticuerpo anti-SSB. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones T32GM007223 y T32AI055403 de los Institutos Nacionales de Salud (TKV) y la subvención NIH (CA16038) (a JAS). JAS es investigador del Instituto Médico Howard Hughes. Las figuras 1-3 y 1 se reprodujeron con permiso de la Sociedad Americana de Microbiología bajo una licencia Creative Commons Attribution de la siguiente publicación: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi's Sarcoma-Associated La acumulación de ARNm de herpesvirus en foci nucleares está influenciada por la replicación del ADN viral y el ARN nuclear no denilado no codificador viral. Revista de Virología. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).

<ol><li>Amen, M. A., Griffiths, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+of+Non-Coding+RNAs+into+Herpesvirus+Virions%3A+Comparisons+to+Coding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs.</a> Frontiers in Genetics. 2, 81(2011).</li>
<li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+virus+replication+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">DNA virus replication compartments.</a> Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li>
<li>Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+microRNA+transcript+retention+at+sites+of+transcription+leads+to+enhanced+microRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production.</a> Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).</li>
<li>Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+nuclear+noncoding+RNA+binds+re-localized+poly%28A%29+binding+protein+and+is+required+for+late+KSHV+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression.</a> Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300(2011).</li>
<li>Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+a+triple-helix-forming+RNA+stability+element+in+noncoding+and+genomic+RNAs+of+diverse+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses.</a> Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).</li>
<li>Weinberg, R. A., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecular+weight+monodisperse+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Small molecular weight monodisperse nuclear RNA.</a> Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).</li>
<li>Myoung, J., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+doxycycline-inducible+KSHV+producer+cell+line+of+endothelial+origin%3A+maintenance+of+tight+latency+with+efficient+reactivation+upon+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction.</a> Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).</li>
<li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li>
<li>Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-derived+cell+line+SLK+is+not+of+endothelial+origin%2C+but+is+a+contaminant+from+a+known+renal+carcinoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line.</a> International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).</li>
<li>Chiou, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+%28ORF74%29+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).</li>
<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
<li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+changes+in+Kaposi%27s+sarcoma-associated+virus+gene+expression+patterns+following+expression+of+a+tetracycline-inducible+Rta+transactivator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator.</a> Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).</li>
<li>Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+structure+and+expression+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+ORF56%2C+ORF57%2C+ORF58%2C+and+ORF59%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59.</a> Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).</li>
<li>Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyadenylylated+nuclear+RNA+encoded+by+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).</li>
<li>Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+mRNA+Accumulation+in+Nuclear+Foci+Is+Influenced+by+Viral+DNA+Replication+and+Viral+Noncoding+Polyadenylated+Nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA.</a> Journal of Virology. 92 (13), (2018).</li>
<li>Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+expression+and+subcellular+localization+of+RNA+and+protein+species+using+high-throughput+single+cell+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry.</a> RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).</li>
<li>Bruce, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+KSHV+Transcriptome+Following+Primary+Infection+of+Blood+and+Lymphatic+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells.</a> Pathogens. 6 (1), (2017).</li>
<li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> Journal of Virology. 91 (11), (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El protocolo descrito en este informe se puede adaptar a diferentes tipos de células e incluye pasos para el doble ARN FISH y el ARN FISH con IF utilizando anticuerpos primarios monoclonales y policlonales. Aunque las diapositivas preparadas se suelen crear imágenes con un microscopio confocal, las imágenes se pueden realizar con un microscopio STED (agotamiento de emisiones estimulada) después de modificaciones del aumento de la concentración de anticuerpos y un medio de montaje diferente. Para un análisis mejorado de c...

En su fase lítica (activa), los herpesvirus secuestran la célula huésped, causando cambios en la morfología celular y la localización de moléculas biológicas, para producir viriones. La base de las operaciones es el núcleo, donde el genoma viral del ADN de doble cadena se replica y empaqueta en una cáscara de proteína, llamada cápside1. Para empezar, el virus expresa sus propias proteínas, secuestrando maquinaria huésped y previniendo la expresión de genes de host no esenciales, un proceso llamado efecto de cierre del huésped. La mayor parte de esta actividad se localiza en regiones nucleares específicas libres de 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)llamadas compartimentos de replicación viral, compuestos por proteínas huésped y virales, ARN y ADN viral 2. La célula se revisa para proporcionar espacio y recursos para los compartimentos de replicación y, por lo tanto, el montaje de cápsides virales. Una vez que la cápside sale del núcleo, no está claro cómo la cápside está envuelta en el citoplasma para producir una partícula viral ligada a la membrana, también conocida como virión. La comprensión de la localización y los cambios espaciales de las biomoléculas víricas y del huésped durante la fase lítica proporciona una visión mecanicista más profunda de la disposición del compartimiento de replicación, el efecto de cierre del host, la vía de virión-salida y otros procesos relacionados con la infección y replicación del herpesviral.
Actualmente el mejor método para detectar y estudiar estos cambios es la visualización de proteínas y ARN en células infectadas con inmunofluorescencia (IF) e hibridación fluorescente in situ (FISH), respectivamente. El uso de un curso de tiempo con estas técnicas revela la localización de biomoléculas en puntos clave de la fase lítica o, simplemente, datos espaciotemporales. FISH y IF complementan otras técnicas bioquímicas, como la inhibición de un proceso celular (por ejemplo, la inhibición de la replicación del ADN viral), RT-qPCR (reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real), la secuenciación de ARN, las manchas del norte, la espectrometría de masas, la hinchazón occidental y análisis de la producción de ADN viral, que puede proporcionar una imagen más global de las actividades celulares.
Desarrollamos estrategias de ARN FISH para examinar los productos de ARN a partir de genes específicos y un análisis computacional que calcula cuantitativamente la relación nucleocitotoplasmática de un producto genético específico. La preparación de la muestra, modificada a partirde publicaciones anteriores de Steitz y sus colegas 3,4, es relativamente fácil y se puede utilizar tanto para células adherentes como suspendidas. El protocolo también es adaptable para el uso simultáneo de múltiples estrategias de ARN FISH (doble ARN FISH) o RNA FISH con estrategias IF. El desarrollo de una estrategia específica de FISH es un reto, pero se describen sugerencias para mejorar el éxito. El análisis de datos descrito aquí es cuantitativo si se utilizan cuentas fluorescentes y marcadores fuertes de los límites del compartimiento y ofrece información adicional sobre las micrografías, información que elimina el sesgo de observación. El protocolo detallado está diseñado tanto para células latentes como líticas infectadas por el herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV) y se puede utilizar con células no infectadas o células infectadas por otros herpesvirus5. Los métodos de cuantificación son aplicables a estudios sobre desplazamientos nucleocitotoplásmicos o relocalización entre compartimentos subcelulares en la mayoría de las células.

<table><tbody><tr><td>AlexaFluor594-5-dUTP</td><td>Life Technologies</td><td>C1100</td><td></td></tr><tr><td>anti-DIG FITC&nbsp;</td><td>Jackson Lab Immunologicals</td><td>200-092-156</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Conejo Secundario AlexaFluor594 Anticuerpo Monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anticuerpo Anti-SMB</td> N<td>/A</td><td>N/A</td><td>Ref. Chiou et al. 2002</td></tr><tr><td>BLASTn</td><td>NIH NCBI</td><td>N/A</td><td>Software de alineación de secuencia libre</td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8906</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Kit de relaves de oligonucleótidos DIG</td><td>Sigma Roche</td><td>#03353583910</td><td>2nd Gen</td></tr><tr><td>Eight-Chamber Slides</td><td>Nunc Lab Tek II</td><td>#154453</td><td>El sello azul promueve la tensión superficial, pero también está disponible la separación por gel transparente.</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9037</td><td>Sondas</td></tr><tr><td>GAPDH</td> de grado de biología molecular <td>Stellaris</td><td>SMF-2019-1</td><td>Compatible con el protocolo, Quasar 670</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>NIH, Bethesda, MD</td><td>N/A</td><td>Software gratuito de análisis de imágenes, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]</td></tr><tr><td>OligoAnalyzer</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Analizador gratuito de oligonucleótidos&nbsp;</td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>A-150228</td><td></td></tr><tr><td>pmaxGFP</td><td>Amaxa</td><td>VDF-1012</td><td></td></tr><tr><td>Poly L-Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Terminal Transferasa Sigma</td><td>Roche</td><td>#003333574001</td><td></td></tr><tr><td>Vanadyl Ribonucleoside Complexes&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>H-1000</td><td>DAPI dentro del medio de montaje dispersa la luz y reduce el contraste.</td></tr></tbody></table>

fluorescencia cuantitativa en hibridación situ (fish) e inmunofluorescencia (if) de productos genéticos específicos en células infectadas por kshv

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

La visión mecanicista proviene de un estudio cuidadoso y la cuantificación de ARN y proteínas específicas. Las ubicaciones relativas de estas biomoléculas en toda la célula en momentos específicos se pueden capturar con hibridación in situ por fluorescencia (FISH) e inmunofluorescencia (IF). Durante la infección por herpesvirus lítico, el virus secuestra la célula huésped para expresar preferentemente genes virales, causando cambios en la morfología celular y el comportamiento de las biomoléculas. Las actividades líticas se centran en fábricas nucleares, denominadas compartimentos de replicación viral, que sólo son discernibles con FISH y IF. Aquí describimos un protocolo adaptable de las técnicas de ARN FISH y IF para las células infectadas por el herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV), tanto adherentes como en suspensión. El método incluye pasos para el desarrollo de oligonucleótidos específicos antisentido, DOBLE ARN FISH, RNA FISH con IF y cálculos cuantitativos de intensidades de fluorescencia. Este protocolo se ha aplicado con éxito a múltiples tipos de células, células no infectadas, células latentes, células líticas, cursos de tiempo y células tratadas con inhibidores para analizar las actividades espaciotemporales de ARN y proteínas específicos tanto del huésped humano como de Kshv.

Los métodos FISH y IF detallados en este manuscrito se muestran en la Figura 1 junto con la cuantificación de los resultados por trazas de línea de intensidad fluorescente. Los resultados presentados aquí son semicuantitativos y ofrecen información sobre la localización, en lugar de en comparaciones entre las intensidades de diferentes manchas fluorescentes porque los experimentos no incluyeron un cordón fluorescente en la preparación de la diapositiva. <stro...

Describimos un protocolo que utiliza la hibridación in situ por fluorescencia (FISH) para visualizar múltiples ARN herpesvirales dentro de células humanas infectadas lyéticamente, ya sea en suspensión o adherente. Este protocolo incluye la cuantificación de la fluorescencia produciendo una relación nucleocitotoplasmática y se puede extender para la visualización simultánea de proteínas huésped y virales con inmunofluorescencia (IF).

Fluorescencia cuantitativa en hibridación situ (FISH) e inmunofluorescencia (IF) de productos genéticos específicos en células infectadas por KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

El protocolo es útil para obtener información cuantitativa sobre la regulación temporal de los productos génicas virales, en el contexto de las células huésped, especialmente en relación con los virus del herpes. Esta técnica puede ayudar a abordar preguntas de investigación relacionadas con los ARN y las proteínas tanto del huésped como de los RÁN virales. Además, esta técnica es compatible con ensayos bioquímicos simultáneos.Para adherir las células a ocho portaobjetos de cámara, aplique 200 microlitros de una suspensión celular inherente a cada cámara de un portaobjetos estéril de ocho cámaras y permita el crecimiento de semillas durante 12-24 horas, a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al final de la incubación, aspirar las células sobrenadantes y no conectadas, e inmediatamente fijar las células con 4% de formaldehído pre-enfriado en PBS sobre hielo, durante 30 minutos. Al final de la fijación, lave las células con tres lavados de cinco minutos en 200 microlitros de 4 grados Celsius PBS por lavado.Después del último lavado, permeabilizar las células fijas con 200 microlitros de pre-enfriado 0.5%Triton-X en PBS por pozo, durante 10 minutos en hielo. Al final de l

quantitative-fluorescence-situ-hybridization-fish-immunofluorescence

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Una técnica que combina en la tinción de tetrámero situ e hibridación in situ (ISTH) permite la visualización, la cartografía y el análisis de la proximidad espacial de virus específicos de células T CD8 + a sus infectados por el virus objetivos y la determinación de las relaciones cuantitativas entre estos efectores inmunes y los objetivos a los resultados de la infección.

Una técnica para visualizar simultáneamente específica para el virus las células CD8 + T y células infectadas por virus In situ</em

Factores de la célula huésped juegan un papel crítico en el establecimiento y mantenimiento de sarcoma de Kaposi (SK). Resumimos los métodos para identificar los factores de la célula huésped alterada en las células infectadas por HVSK DMVEC, y en el tejido tumoral KS. Genes celulares alteradas por el virus servirá como posible objetivo (s) de nuevas terapias.

La identificación de genes inducida por la desregulación de Sarcoma de Kaposi asociado al virus del herpes (HVSK)

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

En este vídeo, las células infectadas con viriones MCPyV fueron sometidas a una reacción en cadena de hibridación in situ para detectar genomas específicos de MCPyV. Además, la técnica de ADN-HCR se combinó con FISH para visualizar el ADN MCPyV en células de piel humana infectadas.

HCR-DNA FISH: Una técnica de hibridación fluorescente in situ para detectar ADN viral en células infectadas

Fuente: Shah, R., et al. Imagen de fluorescencia multiplexada en célula individual para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear la infección por VIH, HTLV, VHB, VHC, virus Zika e influenza. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra la visualización simultánea de ADN, ARN y proteína de cápside del VIH-1 en linfocitos humanos infectados mediante hibridación de ADN ramificado e inmunofluorescencia, lo que permite un análisis detallado de las etapas de replicación viral dentro de...

Imágenes de fluorescencia multiplexadas de ácidos nucleicos virales y proteínas en linfocitos humanos infectados

Fuente: Vallery, T. K. &amp; Steitz, J. A. Hibridación fluorescente in situ cuantitativa (FISH) e inmunofluorescencia (IF) de productos génicos específicos en células infectadas con KSHV. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la hibridación fluorescente in situ para visualizar ARN viral en células infectadas por virus. Describe los pasos involucrados en la hibridación de sondas, la amplificación de la señal y la imagen confocal.

Determinación de la distribución del ARN viral en células huéspedes mediante hibridación in situ fluorescente

Hemos establecido un fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para la detección de un genoma del virus de ADN persistente dentro de las secciones de tejido de modelos animales. Este protocolo permite el estudio de proceso de infección por codetection del genoma viral, sus productos de ARN, y proteínas virales o celulares dentro de las células individuales.

Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor inducido por infección con el virus oncogénico herpesvirus-8/KS el herpesvirus humano (HHV-8/KSHV). El modelo de cultura de célula endotelial descrito aquí está especialmente preparado para el estudio de los mecanismos por los cuales KSHV transforma las células del huésped.

Un modelo In Vitro para el estudio de transformación celular por Herpesvirus del Sarcoma de Kaposi

Fábricas transcripcionales virales son estructuras discretas que se enriquecen con celular polimerasa de ARN II para aumentar la transcripción de genes virales durante la reactivación. Aquí, se describe un método para localizar sitios de transcripción activamente de cromatina viral en el espacio 3D nuclear por una combinación de la hibridación de RNA en situ y tinción de inmunofluorescencia.

Proyección de imagen funcional de fábricas de transcripción Viral mediante microscopia de fluorescencia 3D

Este protocolo describe un sistema in vitro para modelar la infección lítica de novo del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi utilizando viriones derivados de BAC16. El método permite la investigación de la replicación y diseminación viral temprana. La producción de virus infecciosos se cuantifica mediante ensayos de unidades infecciosas basadas en GFP y PCR en tiempo real de genomas virales encapsulados.

Establecimiento y cuantificación de la infección lítica de novo por herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi libre

Aprende a visualizar ARN virales de herpesvirus en células humanas mediante hibridación FISH cuantitativa. Este protocolo permite cuantificar la fluorescencia y combinarla con inmunofluorescencia para estudiar interacciones hospedador-virus.

Fluorescencia cuantitativa en hibridación situ (FISH) e inmunofluorescencia (IF) de productos genéticos específicos en células infectadas por KSHV (Video) | JoVE Journal

Fluorescencia cuantitativa en hibridación situ (FISH) e inmunofluorescencia (IF) de productos genéticos específicos en células infectadas por KSHV

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