Análisis de interacciones entre endobióticos y microbiota de tripa humana utilizando sistemas de fermentación de bañoin in vitro

Nuestro protocolo puede ser ampliamente utilizado para un alto rendimiento y un cribado rápido de las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana. Bajo costo y evitación de efectos de interferencia del metabolismo del huésped. Este procedimiento tiene el potencial de ser utilizado en el diagnóstico.

En primer lugar, disolver EPS BIF y almidón individualmente en agua caliente en un agitador magnético para hacer tanto la concentración de ocho gramos por litro. En el medio de cultivo básico preparado, VI, añada 100 mililitros de la solución BIF EPS para hacer la solución de cultivo VI BIF. Añadir 100 mililitros de la solución de almidón para hacer la solución de almidón VI de cultivo.

Autoclave los dos medios con fuente de carbono, y el medio sin fuente de carbono como control, a 121 grados Celsius durante 15 minutos. Deja que se enfríen a temperatura ambiente y agregue heno y cisteína. Transfiera una submuestra de cinco mililitros de cada medio a tubos de cultivo.

Y almacenar en una incubadora anaeróbica. Almacene los medios restantes en cuatro grados centígrados. Para preparar la muestra fecal humana, transfiera un gramo de muestra fecal fresca a 10 mililitros de 0,1 PBS anaeróbicos molares a pH siete en un vaso de precipitados de vidrio.

A continuación, utilice una varilla de vidrio para agitarlo y lograr una suspensión. En una cámara anaeróbica, añadir 500 microlitros de la suspensión fecal filtrada en los tres medios de fermentación preparados, individualmente. Luego, incubar a 37 grados centígrados.

Después de 24 horas y 48 horas, recoger dos mililitros de muestras fermentadas en la cámara anaeróbica. Y luego centrifugar fuera de la cámara a 6000 veces G, durante tres minutos. Transfiera cuidadosamente los sobrenadantes a nuevos tubos de centrífuga que se utilizarán para el análisis de degradación de polisacáridos y mediciones de ácidos grasos de cadena corta.

Almacene los pellets de centrifugación a 80 grados centígrados. Cargue 0,2 microlitros de los sobrenadantes fermentados en cada placa de aluminio pre-revestida de gel de sílice 60 TLC y gire para esparcir. Luego usa un secador de pelo con aire caliente para secar.

Sumergir un extremo de las placas muestreadas en 20 mililitros de ácido fórmico:n-butanol: solución de agua durante varios minutos, hasta que la electroforesis se extienda casi hasta el otro extremo. A continuación, saque los platos con fórceps y séquelos con un secador de pelo. A continuación, remoje los platos en el reactivo orcinol durante dos minutos para teñir.

Y seca otra vez. Transfiera los platos a un horno de horno a 120 grados Centígrados para calentar durante tres minutos. A continuación, tome fotografías de la placa para evaluar la degradación de LA EPS midiendo bandas TLC.

Para estudiar los efectos de la EPS en la producción de SCFA, añada un mililitro de sobrenadantes fermentados a tubos de centrífuga de dos mililitros y añada 0,2 mililitros de 25 peso/volumen por ciento de ácido metafosfórico a cada muestra. Vortex para mezclar a fondo las soluciones. Centrifugar las mezclas a 13.000 veces G durante 20 minutos.

Mientras tanto, preparar soluciones de 120 ácidos acéticos mili evolucionadosos, propiónicos, butíricos, isobutíricos, valericos e isovalericos en tubos. A continuación, agregue un mililitro de cada ácido preparado a un tubo que contenga 1,2 mililitros de 25 por ciento de peso/volumen por ácido metafosfórico. Y cárguelos en la botella de muestra del instrumento de cromatografía de gases como cócteles estándar.

Saque los tubos de la centrífuga y transfiera los sobrenadantes a tubos frescos. Utilice una jeringa equipada con filtro de 0,22 micras para filtrar los sobrenadantes en nuevos tubos para el análisis de la cromatografía de gases. En este estudio, la producción de EPS mucoide se observó en cultivos de bifidobacterium longum en placas PYG, después de la incubación anaeróbica durante 72 horas.

La centrifugación de los raspaduras de cultivo, seguida de la precipitación y el secado del etanol, dio lugar a la recolección de EPS similares a la celulosa. El análisis de TLC reveló que la tasa de degradación del almidón por microbiota fecal humana era más rápida que la de la EPS BIF. El Análisis de Coordenadas Principales muestra la cultura VI BIF, y los grupos de almidón de cultivo VI, agrupados por separado entre sí, lo que indica que la disponibilidad de EPS y almidón da forma diferencial a las comunidades bacterianas fecales humanas.

El análisis discriminante lineal sobre el tamaño del efecto muestra que los géneros collinsella, coprococcus, parabacteroides y rodopseudomonas fueron significativamente más abundantes en el cultivo DE muestras de BIF VI que en el cultivo VI muestras de almidón. Además, las mediciones de GC muestran SCFAs que se midieron a partir de cultivos de fermentación incluyeron ácidos acéticos, propionicos, isobutíricos, butíricos, isovalericos y valericos. Después de la fermentación durante 24 horas y 48 horas, cinco de las seis concentraciones de SCFA fueron similares y no estadísticamente diferentes entre el cultivo VI BIF, el almidón de cultivo VI y los grupos de cultivo VI.

Sin embargo, las concentraciones de ácido propriónico fueron significativamente más altas en el grupo de cultivo VI BIF que en el grupo de almidón VI de cultivo, después de 48 horas de fermentación. Realice este experimento en condiciones anaeróbicas y, a continuación, transfiera las muestras fijas a una incubadora anaeróbica lo antes posible. Algunos de los reactivos TLC son peligrosos.

Debes tener cuidado de usarlos.