Name: Inyección de huevos de Gryllus bimaculatus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: Aprende a inyectar huevos de Gryllus bimaculatus para estudios de interferencia de ARN y manipulación genómica. Esta técnica versátil permite investigar el desarrollo embrionario y larval en grillos.

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La investigación reportada en este proyecto fue apoyada por un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención P20GM10342 a HH3, y por el número de premio NSF IOS-1257217 a Cge.

1. Configuración de hardware y preparación de materiales
NOTA: Consulte la Tabla 1 y la Tabla de Materiales para la preparación de soluciones, reactivos y detalles del equipo.
<ol><li>Colocar un microscopio de disección para ver los huevos y guiar la aguja de inyección. (LaFigura 1A muestra un microscopio de disección equipado con fluorescencia.) La capacidad de fluorescencia es ventajosa pero no necesaria.</li>
	<li>Coloque un micromanipulador de 3 ejes para maniobrar la aguja de inyección en su lugar (Figura1A).</li>
	<li>Configure un microinyector con tubo y un porta agujas para inyectar pequeñas cantidades de material (Figura1A). Opcionalmente, utilice un pedal que no se muestra en la figura.</li>
	<li>Diseñe y cree un sello para crear pozos para huevos (Figura1C)imprimiendo la inversa del patrón deseado, ya sea con una impresora 3D o un grabador láser. NOTA: El sello de muestra impreso en 3D que se muestra es de 4,5 cm x 5 cm con protuberancias de 128, 3 cm x 1 cm x 1 cm para crear pozos individuales. Los detalles sobre cómo hacer una variedad de moldes personalizables se han publicado en otros lugares16.</li>
	<li>Preparar 10x Injection Buffer, HEPES buffered saline (HBS), y una solución en stock de Tetramethylrhodamine Dextran tinte y almacenar a 4 oC.</li>
	<li>Preparar soluciones experimentales a inyectar, como dsRNA, CRISPR/Cas912, elementos transposibles, ARNm tapado in vitro7,8, agentes farmacológicos17, ZFN s o TALENS9.</li>
	<li>Coloque cinta adhesiva doble en varias capas de cinta de laboratorio estándar en una diapositiva de microscopio de vidrio para crear una plataforma de 1 mm más o menos por encima de la diapositiva de vidrio, que se utilizará para sostener agujas para la evaluación.</li>
	<li>Preparar un recipiente de cricket de aproximadamente 40 cm x 60 cm de tamaño con una tapa que posee una abertura cubierta de malla para la circulación de aire.</li>
	<li>Agregue alimentos, agua y materiales de refugio.</li>
	<li>Añadir varias docenas de grillos masculinos y femeninos sanos para adultos. Identifique el críquet adulto por la presencia de alas. NOTA: Una gama de edades post-imaginales puede aumentar el rendimiento de los huevos. La densidad de los grillos debe ser relativamente alta para poder recoger suficientes huevos para un experimento, pero no tan lleno como que se produce el canibalismo. Por ejemplo, aproximadamente dos docenas de grillos sanos, con una proporción de macho a hembra aproximadamente igual, en un recipiente del tamaño mencionado anteriormente debe ser suficiente para recoger alrededor de 200 huevos en un período de uno a dos h. Los grillos se pueden mantener a temperatura ambiente, pero el desarrollo y el comportamiento serán óptimos si los grillos se mantienen en una incubadora cálida (23,5-26 oC), húmeda (40 - 60% de humedad relativa).</li>
</ol>2. Fabricación de agujas para inyección
<ol><li>Utilice capilares de vidrio borosilicato con filamento (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles de tamaño). Prepare las agujas de tracción el mismo día, o hasta unos días antes de que se completen las inyecciones.</li>
	<li>Coloque un vidrio capilar en el tirador, centre el vidrio en el filamento y apriete las perillas para fijar el vidrio en su lugar.</li>
	<li>Ajuste la temperatura del tirador cerca de la temperatura de la rampa de vidrio (-5 oC a +10 oC).</li>
	<li>Utilice un protocolo de un solo paso y alto calor para tirar de un cono largo con una pequeña abertura, pero evite fundir los extremos cerrados. NOTA: Por ejemplo, cuando utilice el tirador de micropipetas detallado en la Tabla de Materiales equipados con un filamento de caja, utilice los siguientes parámetros para vidrio con una temperatura de rampa de 478: Calor 478; Tire 45; Vel 75; Del 120. Las condiciones óptimas para producir una aguja con la forma mostrada en la Figura 2B deben ser determinadas empíricamente por cada usuario.</li>
	<li>Puntas de aguja biselada en preparación para las inyecciones.</li>
	<li>Humedezca el plano de la trituradora giratoria del biselador (Figura2A)con agua goteando. Utilice ósmosis inversa (RO) o agua destilada tratada con dietilpirocarbonato (DEPC).</li>
	<li>Coloque la aguja tirada en el biselador y gire a un ángulo de 20o.</li>
	<li>Baje la aguja hasta que toque el plano de molienda y bisele durante 2 a 3 minutos.</li>
	<li>Evalúe el bisel colocando la aguja biselada en cinta de doble palo que se haya adherido a un portaobjetos de microscopio de vidrio.</li>
	<li>Coloque la diapositiva sosteniendo la aguja en el escenario de un microscopio compuesto equipado con una cámara y un software de adquisición de imágenes.</li>
	<li>Adquiera una imagen de la punta de la aguja utilizando un objetivo de 20x.</li>
	<li>Utilice el software de imágenes para medir el diámetro de los lúmenes interiores de la aguja sólo proximal a la abertura biselada (Figura2C). El tamaño óptimo es de 10 m + 2 m.</li>
	<li>Deseche las agujas que tengan una abertura por debajo de 8 m y por encima de 12 m.</li>
	<li>Guarde las agujas en un recipiente con una tapa para evitar que se enpolvoree. Utilice una tira de cera o material similar para elevar las agujas de la parte inferior del recipiente para evitar romper las puntas (Figura2D).</li>
</ol>3. Recogida y preparación de huevos
<ol><li>Maximizar el número de huevos puestos privando a los grillos de cualquier material de puesta de humedad (viales de agua, platos de huevo) durante la noche o durante al menos 8-10 h antes de intentar recoger los huevos. NOTA: Dado que las hembras tienen la capacidad de almacenar internamente espermatozoides, un procedimiento cronometrado diferente puede ser necesario si la fertilización cuidadosamente cronometrada es experimentalmente esencial18.</li>
	<li>Hacer 40 ml de agarosa al 1% en agua y verter en un plato de petri de 10 cm.</li>
	<li>Coloque un sello de pozo de huevo en la superficie de la agarosa antes de que se solidifique.</li>
	<li>Retire el sello, una vez que la agarosa se solidifica, para revelar los pozos (Figura1C).</li>
	<li>Llene la placa de pozo de agarosa con HBS que contiene 1% Penicilina/Estreptomicina.</li>
	<li>Colocar la tapa en el plato, envolver en parafilm y almacenar a 4oC. NOTA: Los platos se pueden almacenar durante unos días a 4 oC, pero deben calentarse a temperatura ambiente antes de su uso para evitar la condensación.</li>
	<li>Haga un plato de recolección de huevos para que los grillos pongan huevos llenando un plato de petri de 35 mm con arena blanca del patio de recreo (Figura1B). NOTA: La arena especificada en la Tabla de Materiales es del tamaño de grano adecuado. Si los granos de arena son demasiado grandes, la arena dañará los huevos.</li>
	<li>Cubra el plato de huevo con un cuadrado de toalla de papel cortado para ser de aproximadamente 18 cm x 18 cm, y colóquelo en la parte superior del plato con arena. A través de esta toalla de papel cubra el plato lleno con agua del grifo.</li>
	<li>Incline el plato de petri y apriete suavemente la parte superior para eliminar el exceso de agua.</li>
	<li>Coloque las esquinas del cuadrado de la toalla de papel debajo del plato y coloque el plato de huevo en la tapa invertida, lo que ayudará a mantener la toalla de papel en su lugar.</li>
	<li>Coloque el plato de huevo en el recipiente de cricket y deje que las hembras adultas ovipositen huevos durante uno a dos h. NOTA: El tiempo relativamente corto aquí asegura que todos los huevos serán similares en la etapa de desarrollo en el momento de la inyección. Si la inyección antes de la celularización es importante, las inyecciones deben ocurrir dentro de 14 h de la puesta de óvulos19.</li>
	<li>Mientras tanto, deje que el plato de agarosa (desde el paso 3.6) se caliente a temperatura ambiente en preparación para la retención de los huevos para la inyección.</li>
	<li>Retire el plato de recolección de huevos, que ahora contiene huevos recién puestos, del cubo de cricket, y retire la toalla de papel. Coloque un colador con un tamaño de poro de 0,5-1 mm sobre un vaso de precipitados de al menos 500 ml de capacidad (Figura1B).</li>
	<li>Enjuague el contenido del plato de puesta de huevos (arena y huevos) en el colador bajo el agua del grifo que corre suavemente dejando que los granos de arena caigan a través de la malla del colador en el agua en el vaso de precipitados de abajo, pero dejando los huevos de grillo en la cesta del colador.</li>
	<li>Llene un recipiente con agua RO y colóquelo en una bandeja. Invierta el colador sobre el recipiente y tóquelo contra el plato para desalojar los huevos en el agua. Los huevos se hundirán en el fondo del recipiente.</li>
	<li>Corte la punta de una punta de pipeta P1000 con tijeras para hacer una abertura de aproximadamente 3 mm de diámetro. Coloque esta punta en un pipeteador P1000 y úsela para transferir los huevos del recipiente al plato de molde de huevo de agarosa, transfiriendo la menor agua posible.</li>
	<li>Use pinzas de plástico para alinear los huevos en pozos de agarosa llenos de HBS más 1% Penicilina/Estreptomicina. Cada huevo se hundirá en el fondo de un pozo individual. Cubra con la tapa del plato de petri hasta que esté listo para inyectar.</li>
</ol>4. Prepare el microinyector
<ol><li>Conecte el microinyector a una fuente de aire comprimido o gas (este protocolo se optimizó utilizando aire comprimido o N2). NOTA: Si utiliza un tanque de aire portátil, llene a por lo menos 75 psi. El tanque perderá presión de aire durante todas las inyecciones y puede necesitar ser rellenado; las inyecciones se vuelven difíciles por debajo de 40psi.</li>
	<li>Encienda el microinyector. Ajuste el tiempo de inyección a 0,17 s y la presión a 10-15 psi. NOTA: La presión exacta necesaria dependerá de la apertura de la aguja y debe determinarse empíricamente para cada ronda de inyección y/o nueva aguja utilizada.</li>
	<li>Asegúrese de que la perilla BALANCE del microinyector esté girada a 0 (normalmente completamente en sentido contrario a las agujas del reloj) y que el microinyector esté presurizado y en el modo de inyección.</li>
</ol>5. Inyecciones
<ol><li>Filtrar alrededor de 500 l de búfer de inyección de 10x utilizando una jeringa de 1 ml y un filtro de jeringa de 0,45 m.</li>
	<li>Reactivos de inyección de mezcla (los detalles que siguen son para la inyección de dsRNA preparado como se describe en12). NOTA: Puede ser aconsejable diseñar y realizar varios controles, especialmente cuando uno está aprendiendo esta técnica por primera vez. Poking eggs without injectioning, injecting buffer + dye alone, or injecting buffer + dye + a control reagent (such as eGFP dsRNA) are all good tests of how disrupt various elements of the injection protocol might be. Consulte la figura 3 para la supervivencia de varios controles diferentes.</li>
	<li>Comience con una alícuota de 4 ml dsRNA.</li>
	<li>Agregue 0,5 ml del búfer de inyección filtrado 10x a la alícuota dsRNA.</li>
	<li>Añadir 0,5 ml de 50 mg/ml de tetrametil rhodamina Dextran solución de tinte. Si trabaja en un ámbito de diseción sin fluorescencia, utilice Phenol Red en su lugar.</li>
	<li>Mantenga todos los materiales sobre hielo durante el período de inyección.</li>
	<li>Cargue la solución inyectable en una aguja de inyección con puntas de carga de 20 ml y un pipeta p10.</li>
	<li>Elaborar una solución de inyección de 1,5 ml e insertar la punta de carga en el extremo ancho de la aguja de inyección.</li>
	<li>Expulse la solución lo más abajo posible en la aguja y elimine las burbujas de aire parpadeando suavemente; tenga cuidado de no romper la aguja.</li>
	<li>Coloque el plato de huevos bajo el microscopio de disección y seleccione un aumento bajo de alrededor de 10x (1x aumento visto a través de objetivos oculares 10x).</li>
	<li>Inserte la aguja en la carcasa de inyección y apriete. NOTA: Tenga cuidado de que la aguja esté bien insertada y firmemente insertada en la carcasa. Para ello, tire del extremo ancho de la aguja hacia atrás fuera de la carcasa de metal, trayendo el tubo de silicio en la carcasa con él. Ajuste el tubo de silicio para que el extremo de vidrio de la aguja sobresalga justo más allá del silicio. Si esto no se hace, el tubo de silicio puede ser pellizcado entre el vidrio y la carcasa de metal, bloqueando el extremo de la aguja.</li>
	<li>Inserte cuidadosamente la carcasa de inyección con una aguja conectada en el micromanipulador. Tenga en cuenta el extremo afilado de la aguja y tenga cuidado de que no se tropieza con superficies y se rompa.</li>
	<li>Mientras mira los huevos y la aguja a través del microscopio, mueva la aguja cerca de los huevos en la esquina superior izquierda de la rejilla del plato.</li>
	<li>Baje la aguja hasta que la punta entre en el HBS más una solución tamponada con 1% de penicilina/estreptomicina en el plato.</li>
	<li>Centra la aguja en el campo de visión y mueve el plato de huevo para que la aguja esté unos pocos mm más cerca del borde del plato que los huevos.</li>
	<li>No obstruya la vista de la rejilla de los huevos con la aguja.</li>
	<li>Ajuste el microscopio al filtro adecuado para Rhodamine para que sea posible observar la fluorescencia en la aguja y centrarse en la punta de la aguja.</li>
	<li>En el microinyector, gire lentamente la perilla BALANCE en el sentido de las agujas del reloj hasta que la solución inyectable comience a salir de la aguja en la solución de suspensión. El número de saldo en la pantalla del microinyector comenzará a aumentar, aunque el valor numérico no es importante. A continuación, gire la perilla hacia atrás en sentido contrario a las agujas del reloj ligeramente hasta que el tinte deje de salir de la aguja. NOTA: Es fundamental ajustar este equilibrio cada vez que se utiliza una nueva aguja. Sin el conjunto de equilibrio adecuadamente, el microinyector continuará inyectándose durante algún tiempo después de que se active la inyección. Incluso es posible que un solo pulsador del botón de inyección con una aguja desequilibrada resulte en la expulsión de todo el contenido de la aguja cargada.</li>
	<li>Con la aguja centrada en el campo de visión, mueva la placa de huevo para que la aguja esté dirigida al huevo que se va a inyectar primero. Se recomienda que las inyecciones comiencen en una esquina de la cuadrícula de huevos dispuestos, por ejemplo, la esquina superior izquierda.</li>
	<li>Ajuste el aumento a unos 50x; en este aumento, un solo huevo llenará la mayor parte del campo de visión.</li>
	<li>Utilice tanto el micromanipulador como la mano en la bandeja de huevo para mover la aguja en su posición para la inyección.</li>
	<li>Avance la aguja con el micromanipulador e inserte la punta de la aguja en el primer óvulo que se va a inyectar.</li>
	<li>Inserte la aguja a una longitud de huevo de 20–30% desde el extremo posterior (más contundente) del huevo (Figura1E),perpendicular al eje largo del huevo.</li>
	<li>Inyecte la solución con el pedal de inyección o el botón de inyección en el microinyector. Un pequeño bolo de material fluorescente dentro del huevo indicará una inyección exitosa (Figura1D). NOTA: No es raro que alguna yema sea expulsada del óvulo durante la inyección (Figura1F),y esto no indica necesariamente que el óvulo inyectado será inviable.</li>
	<li>Retira la aguja del huevo. Si el huevo se levanta involuntariamente de su pozo tras la retracción de la aguja, utilice pequeños fórceps para empujar el huevo de nuevo a su pozo mientras retrae la aguja.</li>
	<li>Si la aguja se obstruye durante la inyección, retire la aguja del huevo y, manteniendo la aguja sumergida en el HBS más 1% solución de penicilina/estreptomicina que cubra los huevos, limpie la aguja obstruida con la función Clear o presionando la inyección Botón.</li>
	<li>Continuando con el uso de la misma aguja, repita el procedimiento de inyección para el mayor número de huevos posible. Al principio, esto puede ser sólo alrededor de 20 o 30 huevos, pero aumentará a más de 100 con la práctica.</li>
	<li>Si la aguja se obstruye y no se puede limpiar, deseche la aguja, llene una aguja nueva y comience de nuevo (es decir, vuelva al paso 5.7).</li>
	<li>Almacenar el plato de los huevos inyectados en una incubadora caliente (23,5–26 oC) ligeramente húmeda (para minimizar la evaporación) hasta que los embriones hayan alcanzado la etapa de desarrollo deseada para el análisis.</li>
	<li>Al menos cada 24 h, retire los huevos que ya no sean viables (Figura3A,B)y reemplace la solución de suspensión por HBS fresco más 1% Penicilina/Estreptomicina.</li>
	<li>Dos a tres días después de la inyección, transfiera los huevos mediante pipeteo suave o con fórceps de plástico a toallas de papel humedecidas con HBS más 1% penicilina/estreptomicina en un plato de petri con tapa para continuar el desarrollo en la incubadora cálida y húmeda.</li>
	<li>Supervise los huevos y retire los huevos que ya no sean viables cada día (Figura3A,B).</li>
</ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Los dos principales desafíos con esta técnica son los problemas relacionados con el tamaño óptimo de la aguja y la supervivencia. Aunque las agujas más pequeñas mejoran la supervivencia, las agujas con lúmenes más estrechos tienen un mayor grado de fuerzacapilar en el trabajo, lo que hace que sea más probable que la yema se mueva en la aguja haciendo que se obstruya. En el mejor de los casos, los bloqueos se pueden eliminar simplemente inyectando otro huevo o limpiando la aguja como se describió anteriormente. También se...

La capacidad de modificar el genoma o influir en la expresión génica en los organismos es la base para el diseño de muchos tipos de experimentos que prueban la causalidad funcional. También es fundamental para el trabajo comparativo y evolutivo relevante que las técnicas de modificación genómica y no genómica estén disponibles en organismos fuera de los sistemas de modelos animales de laboratorio genético sin importancia (por ejemplo, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, y Caenorhabditis elegans). Ya sea el deseo de entender la diversidad del organismo1 o la adhesión de uno al principio de Krogh, que para cada pregunta biológica hay un organismo más adecuado para su solución 2,3, la capacidad de modificar genomas o la expresión génica es esencial para los diseños experimentales modernos.
El grillo Gryllus bimaculatus es un sistema modelo emergente. Utilizado durante el siglo pasado en experimentos de neuroetología4, las últimas dos décadas han sido testigos de un mayor interés experimental en el cricket, particularmente centrado en la evolución y desarrollo de este organismo5. El grillo es un insecto hemimetabolous que se ramifica basalmente a los insectos holometabolosos bien estudiados, como D. melanogaster y Tribolium castaneum6. Debido a su posición útil sobre el árbol evolutivo, los científicos están interesados en hacer preguntas experimentales modernas y sofisticadas en este insecto, lo que ha llevado a un creciente interés en adaptar las herramientas moleculares para su uso en G. bimaculatus.
Las inyecciones de reactivos moleculares en huevos de grillo se pueden utilizar para experimentos de modificación genómica, así como manipulaciones no genómicas de la expresión génica en embriones. Por ejemplo, se han creado inserciones transgénicas G. bimaculatus que transportan eGFP utilizando la transposase piggyBac7,8. Los investigadores han creado con éxito noqueos G. bimaculatus utilizando nucleasas de zinc-dedo (ZFN) y nucleasas de efector de activador de tipo activador de transcripción (TAL) (TALENs) para introducir roturas de doble cadena en regiones genómicas específicas9. Aunque los ZFN y los TALENs permiten la segmentación específica del sitio en animales más allá de los cuatro grandes sistemas de modelos, estos reactivos han sido rápidamente superados por el sistema CRISPR/Cas9, que es más fácil de usar, más eficiente y altamente flexible10. CRISPR se ha utilizado en G. bimaculatus para producir knock-out11, así como las líneas de knock-in12,13 Además de la modificación genómica, dsRNA se puede inyectar en los huevos para derribar la expresión de ARNm en el desarrollo embriones, permitiendo a los investigadores comprender el papel de las transcripciones específicas a lo largo del desarrollo14,15. Algunos detalles limitados sobre cómo inyectar huevos de grillo se han publicado anteriormente12.
Aquí, describimos un protocolo detallado para inyectar los primeros huevos de G. bimaculatus. Este protocolo es eficaz y fácilmente adaptable a varios entornos de laboratorio, materiales de inyección, y posiblemente a otros insectos. Si bien se han publicado detalles adicionales para diseñar e implementar experimentos de modificación genómica y derribo en otros lugares12,13, estos enfoques se basarán en última instancia en el protocolo de inyección detallado aquí.

<table><tbody><tr><td>Microscopio de disección fluorescente</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>Microscopio estereoscópico con fluorescencia</td></tr><tr><td>Fuente de luz externa para fluorescencia</td><td>Microinyector Leica</td><td>EL 6000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>IM-300-Los</td> <td>accesorios pueden incluir soporte para agujas de inyección, manguera de entrada (con un conector de manguera), cable de alimentación de CA, interruptor de pie, junta de caucho de silicona-mCubo</td></tr> de <tr><td>filtro de</td> <td>cerezaLeica</td><td>M205FA/M165FC</td><td>Cubo de filtro para mCherry o tinte rojo similar funcionará</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td>Utilizado con soporte magnético (Narishige, tipo GJ-8)</td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de pipeta (soporte de aguja)</td><td>Narishige</td><td>HD-21</td><td></td></tr><tr><td>Tubo para conectar la fuente de aire al microinyector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sello de pozo de huevo</td><td>impreso en 3D</td><td>personalizado</td><td>impreso en 3D en un Lulzbot Taz 5 con termoplástico</td></tr> <tr>de ácido poliláctico<td>Microondas</td><td>varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora o habitación con temperatura controlada</td><td>varias</td><td></td><td>Temperaturas de 23.5-26 &deg; C son necesarios.</td></tr><tr><td>La comida para grillos</td>, <td>la comida</td><td></td><td>para gatos o las hojuelas de pescado son alimentos apropiados.</td></tr><tr><td>El agua</td><td>se</td><td></td><td>puede contener en viales y se puede presentar a los grillos a través de bolas de algodón</td></tr><tr><td>Refugio de grillo</td><td>arioso</td><td></td><td>Los materiales del refugio pueden incluir toallas de papel arrugadas o cartones de huevos</td></tr><tr><td>Tubos capilares de vidrio</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>N.º de artículo 1B100F-4</td><td>Kwik-Fil&trade; Capilares de vidrio de borosilicato, 100 mm de longitud, 0,58 mm de diámetro interior, 1,0 mm de diámetro exterior, con filamento</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Flaming/Brown</td><td>Modelo P-97</td><td>Distribuido por Sutter Instrument Co.</td></tr><tr><td>Biseladora / Micro amoladora</td><td>Narishige</td><td>Modelo EG-45 / EG-400</td><td>EG-400 incluye una cabeza de microscopio</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>CellTreat</td><td>Código de producto 229693</td><td>90 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Play Sand</td><td>Sandtastik Products Ltd.</td><td>B003U6QLVS</td><td>Arena de juego blanca</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Bioanalítica Americana</td><td>AB000972</td><td>Agarosa GPG/LE ultrapura</td></tr><tr><td>Colador de huevos: Malla de sarga extrafina Coladores cónicos de acero inoxidable Suministros de</td><td>cocina de EE. UU</td>. <td>Modelo SS-C123</td> El <td>tamaño de los poros debe estar entre 0,5 y 1,0 mm</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>Ref 15070-063</td><td>Pinzas de plástico Pen Strep</td></tr><tr><td></td><td>Sipel Electronic SA</td><td>P3C-STD</td><td>Disipador de estática negro, 118 mm</td></tr><tr><td>Filtros de jeringa, 25 mm de diámetro, 0,45 y micro; m</td><td>Nalgene</td><td>725-2545</td><td>Úselo con jeringa de 1 mL Jeringa</td></tr> de <tr><td>1 mL, con punta deslizante de tuberculina</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>Úselo con filtro de jeringa para filtrar el tampón de inyección, las jeringas de punta Luer-Lok también funcionarían</td></tr><tr><td>Tanque de aire (opcional)</td><td>Midwest Products</td><td>Air Works&reg;</td><td>Tanque de aire portátil</td></tr><tr><td>Colorante de rodamina</td><td>Thermofisher</td><td>D-1817</td><td>dextrano, tetrametilrodamina 10,000MW,20</td></tr> <tr><td>mL puntas de carga</td><td>Eppendorf</td><td>N° de pedido 5242 956.003</td><td>epT.I.P.S. 20 &mu; L Microcargador</td></tr><tr><td>Microscopio compuesto</td><td>Zeiss</td><td>Axioskope 2 plus</td><td></td></tr><tr><td>20x objetivo</td><td>Ziess</td><td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Leica</td><td>DMC 5400</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite&nbsp; software</td><td>Leica</td><td>LAS</td><td>Versión 4.6.2 utilizado aquí</td></tr></tbody></table>

inyección de huevos de gryllus bimaculatus

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

La alteración de la función génica en un organismo en desarrollo es fundamental para diferentes tipos de experimentos. Si bien se han desarrollado herramientas genéticas tremendamente poderosas en los sistemas de modelos tradicionales, es difícil manipular genes o ARN mensajero (ARNm) en la mayoría de los otros organismos. Al mismo tiempo, los enfoques evolutivos y comparativos se basan en una exploración de la función génica en muchas especies diferentes, lo que requiere el desarrollo y la adaptación de técnicas para manipular la expresión fuera actualmente tratable genéticamente Especies. Este protocolo describe un método para inyectar reactivos en huevos de grillo para analizar los efectos de una manipulación dada en el desarrollo embrionario o larvario. Se describen las instrucciones para recoger e inyectar óvulos con agujas biseladas. Esta técnica relativamente sencilla es flexible y potencialmente adaptable a otros insectos. Uno puede reunir e inyectar docenas de óvulos en un solo experimento, y las tasas de supervivencia para las inyecciones sólo de amortiguación mejoran con la práctica y pueden ser tan altas como 80%. Esta técnica apoyará varios tipos de enfoques experimentales, incluida la inyección de agentes farmacológicos, el ARNm tapado in vitro para expresar genes de interés, el ARN de doble cadena (dsRNA) para lograr la interferencia del ARN, el uso de Repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas (CRISPR) en conjunto con reactivos de proteína 9 (Cas9) asociados a CRISPR para modificación genómica y elementos transposables para generar líneas transgénicas transitorias o estables.

Los grillos ponen fácilmente los huevos en el material húmedo, y proporcionando material adecuado, como arena húmeda o suciedad, los induce a poner un gran número de huevos. Esto es especialmente eficaz si los grillos se ven privados primero de material de puesta de huevos durante 8-10 h. Los huevos colocados en arena limpia se pueden separar fácilmente, recoger (Figura1B)y colocarse en pozos de huevo sin cáscara de inyección diseñados a medida (Figura<strong...

Aquí presentamos un protocolo para inyectar huevos de cricket, una técnica que sirve como método fundamental en muchos experimentos en el cricket, incluyendo, pero no limitado a, interferencia de ARN y manipulación genómica.

Inyección de huevos de Gryllus bimaculatus

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Esta técnica sirve como método fundamental para experimentos diseñados para ensayar el desarrollo embrionario o larvario del grillo. La principal ventaja de esta técnica es que es flexible y soportará varios tipos de enfoques experimentales, como los que utilizan interferencia de ARN o manipulación genómica. Demostrando el procedimiento estará Hadley Wilson Horch, la investigadora principal en el laboratorio.Para comenzar este procedimiento humedezca el plano de la trituradora giratoria del biselador con agua goteando. Coloque la aguja tirada en el biselador y gírela a un ángulo de 20 grados. Baje la aguja hasta que toque la placa de molienda y bisele durante dos o tres minutos.Evalúe el bisel colocando la aguja biselada en cinta de doble palo que se ha adherido a un portaobjetos de vidrio. Coloque la diapositiva en el escenario de un microscopio compuesto equipado con una cámara y un software de adquisición de imágenes. Adquirir una imagen de la aguja utilizando un objetivo 20x.Utilice el software de imágenes para medir el diámetro del lumen interior de la aguja sólo proximal a la abertura biselada. Deseche las agujas con una abertura inferior a ocho micrómetros o más de 12 micrómetros. Primero, haz 40 mililitros de 1% de ágarosa en agua y vierta en un plato de Petri de 10 centímetros.Coloque un sello de huevo en la superficie de la agarosa antes de que se solidifique. Una vez que la agarosa se solidifice, retire el sello para revelar los pozos. A continuación, llene la placa del pozo de agarosa con HBS que contiene 1%estreptomicina de penicilina.Coloque la tapa en el plato, envuélvalo en Parafilm y guárdelo a cuatro grados centígrados. Después de esto, llene un plato de Petri de 35 milímetros con arena blanca del patio de recreo para hacer un plato de recolección de huevos para que los grillos pongan huevos. Cubra el plato de huevo con una toalla de papel cortada en cuadrados de aproximadamente 18 por 18 centímetros.Llene con agua del grifo a través de la toalla de papel. A continuación, incline el plato de Petri y apriete suavemente la parte superior para eliminar el exceso de agua. Coloque las esquinas de la toalla de papel cuadrada debajo del plato y coloque el plato de huevo en una tapa invertida que ayudará a mantener la toalla de papel en su lugar.Coloque el plato de huevo en el recipiente de cricket y deje que las hembras adultas oviposite los huevos durante una o dos horas. Mientras tanto, deje que el plato de agarosa se caliente a temperatura ambiente en preparación para la celebración de los huevos para inyección. Cuando esté listo, retire el plato de recolección de huevos, que ahora contiene huevos recién puestos, de la papelera de cricket.Retire la toalla de papel y coloque un colador con un tamaño de poro entre 0,5 y un milímetros sobre un vaso de precipitados. Enjuague el contenido del plato de puesta de huevos en el colador bajo el agua del grifo que corre suavemente. Los granos de arena caerán a través de la malla coladora en el vaso de precipitados de abajo, mientras que los huevos de cricket permanecen en la cesta de colador.Llene un recipiente con agua de ósmosis inversa y colóquelo en una bandeja. Invierta el colador sobre el recipiente y tócalo contra el plato para desalojar los huevos en el agua. Los huevos se hundirán en el fondo del recipiente.A continuación, utilice tijeras para cortar la punta de una punta de pipeta P1000 para hacer una abertura de aproximadamente tres milímetros de diámetro. Coloque este consejo en un pipeteador P1000 y úselo para transferir los huevos del recipiente al plato de moldes de huevo de agarosa. Usando pinzas de plástico, alinee los huevos en los pozos de agarosa.Cada huevo se hundirá en el fondo de un pozo individual. Cubra el plato de Petri con una tapa hasta que esté listo para inyectar. Para comenzar, coloque el plato de huevos bajo el microscopio de disección y seleccione un aumento bajo de alrededor de 10x.Extraiga 1,5 microlitros de solución inyectable utilizando puntas de carga de 20 microlitros y una pipeta P10 e inserte la punta de carga en el extremo ancho de la aguja de inyección. Expulse la solución inyectable a la aguja de inyección. Inserte la aguja en la carcasa de inyección y apriete, asegurándose de que la aguja esté correctamente insertada y firmemente en la carcasa.A continuación, inserte cuidadosamente la carcasa de inyección en el micromanipulador, teniendo cuidado de no romperse o lesionarse por la aguja. Mientras mira los huevos y la aguja a través del microscopio, mueva la aguja cerca de la X en la esquina superior izquierda de la rejilla del plato. Baje la aguja hasta que la punta entre en la solución tamponada de estreptomicina de HBS más estrecilina en la bandeja.Centrar la aguja en el campo de visión y mover el plato de huevo para que la aguja esté unos milímetros más cerca del borde del plato que los huevos. Después de esto, ajuste el microscopio al filtro apropiado para Que Rhodamine observe la fluorescencia en la aguja y concéntrese en su punta. En el microinyector gire lentamente la perilla de la balanza en el sentido de las agujas del reloj hasta que la solución de inyección comience a salir de la aguja a la solución de suspensión.A continuación, gire la perilla hacia atrás ligeramente hasta que el tinte deje de salir de la aguja. Con la aguja todavía centrada en el campo de visión, mueva el plato de huevo para que la aguja esté dirigida al huevo que se va a inyectar primero. Ajuste el aumento a aproximadamente 50x para que un solo huevo llene la mayor parte del campo de visión.Utilice tanto el micromanipulador como la mano en la bandeja de huevo para mover la aguja a su posición para la inyección. Utilice el micromaniprógrafo para avanzar la aguja e inserte la punta en el primer óvulo que se va a inyectar, asegurándose de insertar la aguja en 20 a 30% de la longitud del huevo desde el extremo posterior del huevo perpendicular al eje largo del huevo. Inyecte la solución con el pedal de inyección o con el botón de inyección del microinyector.Un pequeño bolo de material fluorescente dentro del huevo indicará una inyección exitosa. Después de esto, retraiga la aguja del huevo. Si el huevo se levanta involuntariamente de su pozo al retracción de la aguja, utilice pequeños fórceps para empujar el huevo de nuevo en el pozo mientras retrae la aguja.En este estudio, los huevos de cricket se inyectan utilizando una técnica que sirve como un método fundamental en muchos experimentos, incluyendo pero no limitado a, interferencia de ARN y manipulación genómica. La tasa de supervivencia es un parámetro importante para evaluar el éxito de este experimento. La mayoría de los óvulos muertos se pueden identificar fácilmente por la vista, ya que la yema y el tejido embrionario dentro del óvulo comienzan a aglucuarse de manera desigual, y con el tiempo la mayor parte de la yema migrará a un lado del óvulo.Cuando se evalúa después de cuatro a seis días, más del 85% de los óvulos no inyectados sobrevivieron, mientras que los óvulos inyectados con reactivos experimentales generalmente tenían una tasa de supervivencia más baja. Se requiere el control de todos los aspectos de la inyección en sí, incluida la punción de la aguja, la introducción de tinte y tampón, o la presencia de ARN de vehículo o de doble cadena, para comprender los verdaderos efectos de la manipulación experimental intentada. La forma en que se evalúan los resultados fenotípicos de la inyección depende de lo que se inyectó.Por ejemplo, los cambios fenotípicos como resultado de derribos específicos de ARNm pueden ser obvios a nivel de anatomía bruta. Si por otro lado se inserta un ADNC que codifica un gen de histona 2B etiquetado por EGFP bajo el control de un promotor de G.bimaculatus actin en el genoma del grillo utilizando transposasa de piggyback, se hace posible visualizar cada núcleo en el óvulo utilizando fluorescencia para excitar la proteína EGFP tagged hist 2B. Ajustar la balanza para que las agujas no se obstruyan es un paso crítico en este procedimiento.Es posible que deba realizar varios ajustes después de las inyecciones posteriores, ya que la yema a veces obstruye la punta de la aguja. El grillo es un insecto hemimetabolous que se ramifica basalmente a insectos holometabolos bien estudiados como Drosophila. Estudiar el desarrollo del cricket nos ayudará a entender más sobre la evolución y el desarrollo en todo el reino animal.Esta técnica requiere un poco de práctica. Recomendamos practicar inyecciones de control hasta que la tasa de supervivencia cuatro o cinco días después de la inyección sea al menos del 80%

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Inyección de huevos de Gryllus bimaculatus

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