Inyección de huevos de Gryllus bimaculatus
22 de agosto de 2019
Aquí presentamos un protocolo para inyectar huevos de cricket, una técnica que sirve como método fundamental en muchos experimentos en el cricket, incluyendo, pero no limitado a, interferencia de ARN y manipulación genómica.
Esta técnica sirve como método fundamental para experimentos diseñados para ensayar el desarrollo embrionario o larvario del grillo. La principal ventaja de esta técnica es que es flexible y soportará varios tipos de enfoques experimentales, como los que utilizan interferencia de ARN o manipulación genómica. Demostrando el procedimiento estará Hadley Wilson Horch, la investigadora principal en el laboratorio.
Para comenzar este procedimiento humedezca el plano de la trituradora giratoria del biselador con agua goteando. Coloque la aguja tirada en el biselador y gírela a un ángulo de 20 grados. Baje la aguja hasta que toque la placa de molienda y bisele durante dos o tres minutos.
Evalúe el bisel colocando la aguja biselada en cinta de doble palo que se ha adherido a un portaobjetos de vidrio. Coloque la diapositiva en el escenario de un microscopio compuesto equipado con una cámara y un software de adquisición de imágenes. Adquirir una imagen de la aguja utilizando un objetivo 20x.
Utilice el software de imágenes para medir el diámetro del lumen interior de la aguja sólo proximal a la abertura biselada. Deseche las agujas con una abertura inferior a ocho micrómetros o más de 12 micrómetros. Primero, haz 40 mililitros de 1% de ágarosa en agua y vierta en un plato de Petri de 10 centímetros.
Coloque un sello de huevo en la superficie de la agarosa antes de que se solidifique. Una vez que la agarosa se solidifice, retire el sello para revelar los pozos. A continuación, llene la placa del pozo de agarosa con HBS que contiene 1%estreptomicina de penicilina.
Coloque la tapa en el plato, envuélvalo en Parafilm y guárdelo a cuatro grados centígrados. Después de esto, llene un plato de Petri de 35 milímetros con arena blanca del patio de recreo para hacer un plato de recolección de huevos para que los grillos pongan huevos. Cubra el plato de huevo con una toalla de papel cortada en cuadrados de aproximadamente 18 por 18 centímetros.
Llene con agua del grifo a través de la toalla de papel. A continuación, incline el plato de Petri y apriete suavemente la parte superior para eliminar el exceso de agua. Coloque las esquinas de la toalla de papel cuadrada debajo del plato y coloque el plato de huevo en una tapa invertida que ayudará a mantener la toalla de papel en su lugar.
Coloque el plato de huevo en el recipiente de cricket y deje que las hembras adultas oviposite los huevos durante una o dos horas. Mientras tanto, deje que el plato de agarosa se caliente a temperatura ambiente en preparación para la celebración de los huevos para inyección. Cuando esté listo, retire el plato de recolección de huevos, que ahora contiene huevos recién puestos, de la papelera de cricket.
Retire la toalla de papel y coloque un colador con un tamaño de poro entre 0,5 y un milímetros sobre un vaso de precipitados. Enjuague el contenido del plato de puesta de huevos en el colador bajo el agua del grifo que corre suavemente. Los granos de arena caerán a través de la malla coladora en el vaso de precipitados de abajo, mientras que los huevos de cricket permanecen en la cesta de colador.
Llene un recipiente con agua de ósmosis inversa y colóquelo en una bandeja. Invierta el colador sobre el recipiente y tócalo contra el plato para desalojar los huevos en el agua. Los huevos se hundirán en el fondo del recipiente.
A continuación, utilice tijeras para cortar la punta de una punta de pipeta P1000 para hacer una abertura de aproximadamente tres milímetros de diámetro. Coloque este consejo en un pipeteador P1000 y úselo para transferir los huevos del recipiente al plato de moldes de huevo de agarosa. Usando pinzas de plástico, alinee los huevos en los pozos de agarosa.
Cada huevo se hundirá en el fondo de un pozo individual. Cubra el plato de Petri con una tapa hasta que esté listo para inyectar. Para comenzar, coloque el plato de huevos bajo el microscopio de disección y seleccione un aumento bajo de alrededor de 10x.
Extraiga 1,5 microlitros de solución inyectable utilizando puntas de carga de 20 microlitros y una pipeta P10 e inserte la punta de carga en el extremo ancho de la aguja de inyección. Expulse la solución inyectable a la aguja de inyección. Inserte la aguja en la carcasa de inyección y apriete, asegurándose de que la aguja esté correctamente insertada y firmemente en la carcasa.
A continuación, inserte cuidadosamente la carcasa de inyección en el micromanipulador, teniendo cuidado de no romperse o lesionarse por la aguja. Mientras mira los huevos y la aguja a través del microscopio, mueva la aguja cerca de la X en la esquina superior izquierda de la rejilla del plato. Baje la aguja hasta que la punta entre en la solución tamponada de estreptomicina de HBS más estrecilina en la bandeja.
Centrar la aguja en el campo de visión y mover el plato de huevo para que la aguja esté unos milímetros más cerca del borde del plato que los huevos. Después de esto, ajuste el microscopio al filtro apropiado para Que Rhodamine observe la fluorescencia en la aguja y concéntrese en su punta. En el microinyector gire lentamente la perilla de la balanza en el sentido de las agujas del reloj hasta que la solución de inyección comience a salir de la aguja a la solución de suspensión.
A continuación, gire la perilla hacia atrás ligeramente hasta que el tinte deje de salir de la aguja. Con la aguja todavía centrada en el campo de visión, mueva el plato de huevo para que la aguja esté dirigida al huevo que se va a inyectar primero. Ajuste el aumento a aproximadamente 50x para que un solo huevo llene la mayor parte del campo de visión.
Utilice tanto el micromanipulador como la mano en la bandeja de huevo para mover la aguja a su posición para la inyección. Utilice el micromaniprógrafo para avanzar la aguja e inserte la punta en el primer óvulo que se va a inyectar, asegurándose de insertar la aguja en 20 a 30% de la longitud del huevo desde el extremo posterior del huevo perpendicular al eje largo del huevo. Inyecte la solución con el pedal de inyección o con el botón de inyección del microinyector.
Un pequeño bolo de material fluorescente dentro del huevo indicará una inyección exitosa. Después de esto, retraiga la aguja del huevo. Si el huevo se levanta involuntariamente de su pozo al retracción de la aguja, utilice pequeños fórceps para empujar el huevo de nuevo en el pozo mientras retrae la aguja.
En este estudio, los huevos de cricket se inyectan utilizando una técnica que sirve como un método fundamental en muchos experimentos, incluyendo pero no limitado a, interferencia de ARN y manipulación genómica. La tasa de supervivencia es un parámetro importante para evaluar el éxito de este experimento. La mayoría de los óvulos muertos se pueden identificar fácilmente por la vista, ya que la yema y el tejido embrionario dentro del óvulo comienzan a aglucuarse de manera desigual, y con el tiempo la mayor parte de la yema migrará a un lado del óvulo.
Cuando se evalúa después de cuatro a seis días, más del 85% de los óvulos no inyectados sobrevivieron, mientras que los óvulos inyectados con reactivos experimentales generalmente tenían una tasa de supervivencia más baja. Se requiere el control de todos los aspectos de la inyección en sí, incluida la punción de la aguja, la introducción de tinte y tampón, o la presencia de ARN de vehículo o de doble cadena, para comprender los verdaderos efectos de la manipulación experimental intentada. La forma en que se evalúan los resultados fenotípicos de la inyección depende de lo que se inyectó.
Por ejemplo, los cambios fenotípicos como resultado de derribos específicos de ARNm pueden ser obvios a nivel de anatomía bruta. Si por otro lado se inserta un ADNC que codifica un gen de histona 2B etiquetado por EGFP bajo el control de un promotor de G.bimaculatus actin en el genoma del grillo utilizando transposasa de piggyback, se hace posible visualizar cada núcleo en el óvulo utilizando fluorescencia para excitar la proteína EGFP tagged hist 2B. Ajustar la balanza para que las agujas no se obstruyan es un paso crítico en este procedimiento.
Es posible que deba realizar varios ajustes después de las inyecciones posteriores, ya que la yema a veces obstruye la punta de la aguja. El grillo es un insecto hemimetabolous que se ramifica basalmente a insectos holometabolos bien estudiados como Drosophila. Estudiar el desarrollo del cricket nos ayudará a entender más sobre la evolución y el desarrollo en todo el reino animal.
Esta técnica requiere un poco de práctica. Recomendamos practicar inyecciones de control hasta que la tasa de supervivencia cuatro o cinco días después de la inyección sea al menos del 80%
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para la inyección de huevos de grillo, un método fundamental para diversos experimentos en la investigación con grillos. Esta técnica es particularmente útil para estudios que involucran interferencia de ARN y manipulación genómica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Manipulación genómica
Antecedentes
- Los huevos de grillo se utilizan en diversos enfoques experimentales.
- La técnica permite estudios sobre el desarrollo embrionario y larval.
- Es adaptable a diferentes diseños experimentales.
- La interferencia de ARN es una de las aplicaciones principales de este método.
Objetivo del estudio
- Demostrar un protocolo para la inyección de huevos de grillo.
- Proporcionar un método fundamental para futuros experimentos con grillos.
- Destacar la flexibilidad de la técnica para diversas aplicaciones de investigación.
Métodos Utilizados
- Humedezca el plano giratorio del biselador con agua.
- Coloque la aguja estirada en el biselador con un ángulo de 20 grados.
- Baje la aguja hasta que toque la placa de rectificado y afílela durante 2-3 minutos.
- Demostración realizada por Hadley Wilson Horch, el investigador principal.
Resultados principales
- La técnica es efectiva para la inyección de huevos de grillo.
- Apoya diversos enfoques experimentales en la investigación con grillos.
- Demuestra flexibilidad en la aplicación para interferencia de ARN y manipulación genómica.
- Proporciona un método confiable para estudiar el desarrollo embrionario y larval.
Conclusiones
- Esta técnica de inyección es fundamental para la investigación con grillos.
- Ofrece versatilidad para diferentes diseños experimentales.
- Estudios futuros pueden basarse en este método para investigaciones avanzadas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la manipulación funcional de genes en organismos modelo no tradicionales, apoyando la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Al proporcionar un sistema flexible para el cribado fenotípico en diversas especies, aumenta la confianza predictiva en la interrogación de vías biológicas y reduce la dependencia de supuestos basados en un único modelo. El método facilita el desarrollo de ensayos escalables para el cribado de compuestos y el descubrimiento de biomarcadores en sistemas evolutivamente relevantes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la inhibición génica, sobreexpresión o edición en sistemas modelo emergentes.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas fuera de los sistemas genéticos tradicionales, reduciendo el sesgo específico de especie.
- Valor científico: Facilita la selección fenotípica para evaluar la esencialidad de la diana y la participación en vías durante el desarrollo embrionario.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas basadas en fluorescencia para rastrear la expresión génica o la dinámica celular in vivo.
- Valor operativo: Permite la preparación estandarizada de embriones de insectos para cribados de alto contenido de perturbaciones farmacológicas o genéticas.
- Valor científico: Facilita el perfilado de respuesta a la dosis y temporal de reactivos inyectados, como dsRNA, mRNA o componentes del sistema CRISPR.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad para estudiar vías de desarrollo conservadas con alineación de biomarcadores traslacionales.
- Valor operativo: Permite la comparación entre especies de la función del blanco, mejorando la extrapolación a sistemas mamíferos.
- Valor científico: Apoya la reducción mecanicista de riesgos al revelar la conservación o divergencia evolutiva en la función génica antes de la inversión en mamíferos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano, permitiendo la validación del blanco y el desarrollo de ensayos antes de la identificación del fármaco líder y la evaluación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la indagación de la función génica y la aclaración de vías en especies genéticamente inaccesibles pero evolutivamente informativas.
- Selección: Proporciona resultados fenotípicos cuantitativos y reproducibles, esenciales para la preparación de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite la medición de tasas de supervivencia, penetrancia fenotípica y localización subcelular como lecturas analíticas clave.
- Investigación Traducional: Conecta fenotipos del desarrollo con vías conservadas, apoyando la alineación de biomarcadores y el avance ajustado al riesgo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la inyección de diversos reactivos en múltiples campañas experimentales y clases de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al permitir la genómica funcional en organismos poco estudiados pero filogenéticamente importantes.
- Valor operativo: Ofrece un sistema escalable y de bajo costo para generar docenas de embriones inyectables por experimento, con tasas de supervivencia de hasta el 80 % tras la optimización.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo de fracaso en fases avanzadas al identificar tempranamente las limitaciones del objetivo mediante cribado fenotípico cruzado entre especies.
- Impacto en la cartera: Orienta las decisiones de continuar o descartar al proporcionar información mecanicista sobre la función del objetivo a través de distancias evolutivas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microinyección, embriología y microscopía para un manejo preciso de la aguja y la manipulación del embrión.
- Depende de instrumentación especializada, incluyendo afiladores de agujas, micromanipuladores, microinyectores y microscopios con capacidad de fluorescencia.
- Necesita la estandarización de la recolección de huevos, la preparación de pozos de agarosa y la formulación del tampón de inyección entre diferentes usuarios y sitios.
- Incluye consideraciones de adaptación para distintas especies de insectos, tamaños de huevo y etapas de desarrollo.
- Comprende limitaciones prácticas, como el obstrucción de la aguja por restos de vitelo y tasas de supervivencia dependientes de la habilidad, lo que requiere entrenamiento y práctica.
