Expresión, purificación, cristalización y ensayos enzimáticos de proteínas que contienen el dominio de la hidrolasa fumarilacetoacetato

Nuestro protocolo describe métodos para la expresión eficiente y purificación del dominio FAH que contiene proteínas, pero también proteínas en general. La proteína FHD-1 desempeña un papel regulador en el ciclo de TCA y el metabolismo energético de las mitocondrias. Pudimos asociar la regulación de la baja de FHD-1 a la senescencia celular y la información sobre la actividad enzimática y la estructura de proteínas son generalmente necesarias para entender los mecanismos moleculares detrás de los fenotipos observados.

La principal ventaja de expresar proteínas a través de sistemas vectoriales inducibles IPTG es que todos los métodos son relativamente baratos y fáciles de establecer en cualquier laboratorio. Mediante el uso de proteínas de tipo poli-histidina en combinación con resinas de agarosa NTA de níquel, la inmensa selectividad de la cromatografía de afinidad puede emplearse a bajo costo. Para la mayoría de los propósitos, la proteína obtenida con esta calidad ya puede ser suficiente.

FPLC en otras manos, es un método bien establecido y general con varias ventajas en comparación con otros métodos. Primero, inserte de cinco a 10 nanogramos de plásmido en 100 microlitros de bacterias competentes BL21-DE3 pLysS E.coli sobre hielo. Toque ligeramente el tubo para mezclar el contenido.

Mantenga las bacterias sobre hielo durante 30 minutos, tocando suavemente el tubo cada pocos minutos. Calienta un agitador térmico a 42 grados centígrados. Coloque el tubo que contiene las bacterias en el aparato y caliente durante 90 segundos.

A continuación, coloque el tubo sobre hielo inmediatamente. Después de cinco a 10 minutos en hielo, agregue 600 microlitros de medio NZCYM y coloque el tubo en una incubadora de bacterias. Agitar el tubo a velocidad media orientada a lo largo de la dirección de temblor a 37 grados centígrados durante una hora.

Después de la incubación, placa 200 microlitros del cultivo bacteriano en una placa de agar LB de 10 centímetros que contiene la selección de antibióticos de elección. Cultivo de las bacterias en la placa de agar LB en la incubadora de bacterias a 37 grados centígrados durante la noche. Después de la formación exitosa de colonias, elija una sola colonia y disperse en cinco mililitros de NZCYM con los antibióticos seleccionados.

Cultivo en la incubadora de bacterias a 37 grados centígrados durante la noche. Después de un crecimiento bacteriano exitoso, amplificar las bacterias en lotes de 250 mililitros, 500 mililitros o un litro de medio dependiendo de la demanda de cantidad de proteína. Luego, cultiva las bacterias, en la incubadora de bacterias a 37 grados centígrados durante dos a tres horas.

Después de la incubación, dibuje una muestra para el análisis fotométrico. Si la densidad óptica a 600 nanómetros ha alcanzado 0,4, aplique 200 micromolares hasta un milimolar de isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid. Después de tres a cinco horas más en la incubadora de bacterias a 37 grados celsius la expresión de la proteína se agota.

Cosecha el pellet bacteriano mediante centrifugación a 5.000 veces G durante cinco minutos. A continuación, deseche el sobrenadante y congele el pellet a menos 20 grados centígrados para un breve almacenamiento. Por cada 250 mililitros de suspensión bacteriana original, aplique cinco mililitros del tampón seleccionado al pellet bacteriano.

Añadir 10 microlitros de beta-mercaptoetanol por cinco mililitros de tampón aplicado. Utilice una pipeta Pasteur de 10 mililitros para forzar mecánicamente el pellet en suspensión rascándose y pipeteando. Transfiera toda la suspensión a un tubo de 50 mililitros.

A continuación, sonicar la suspensión. A continuación, centrifugar durante 30 minutos a alta velocidad a cuatro grados centígrados. Filtrar el sobrenadante consecutivamente con unidades de filtro en hielo.

Prepare una columna de plástico o vidrio vacía adjuntándola a un retenedor estable y lavándola con un tampón de níquel NTA. Por cada 10 mililitros de suspensión proteica aplicar 500 microlitros de lodo de agarosa NTA de níquel a la columna. Llene la columna completamente con el búfer de funcionamiento de níquel NTA asegurando no interrumpir la resina de agarosa y permitir que el búfer corra a través de la gravedad.

A continuación, aplique la suspensión proteica en la columna y permita que la muestra se ejecute por gravedad. Después de que la muestra haya pasado, rellene la columna con el búfer de ejecución de NTA de níquel. Coloque una cubeta transparente UV debajo de la columna y recoja un mililitro de tampón de elución NTA de níquel.

Compruebe la densidad óptica de la muestra a 280 nanómetros en comparación con una muestra en blanco. De manera óptima, la muestra muestra una densidad óptica superior a 2,5. Dado que las proteínas FAHD y el tampón de elución de níquel NTA se precipitarán al congelarse y descongelar, dializar la proteína contra un tampón diferente durante la noche sobre el hielo usando un microlitro de TDT por cada 100 mililitros de tampón de diálisis.

Configure un sistema FPLC y lave la columna con cinco volúmenes de columna de 20% de etanol seguidos de cinco volúmenes de columna de agua. Después de equilibrar la columna, aplique la muestra dializada a la columna y recoja el flujo a través. Configure una elución de degradado.

Una vez finalizado el degradado, ejecute con un búfer de sal alta hasta que no se detecten más picos en el intervalo de un volumen de columna. Poner en marcha un lector de microplamas y equilibrar durante 30 minutos a 25 grados centígrados. Preparar un mililitro de una solución de 20 mililitros de un sustrato que se probará en tampón de ensayo enzimático.

De acuerdo con el esquema de pipeteo en el protocolo de texto, preparar la enzima en blanco y los pozos de muestra mediante pipetear 90 microlitros de tampón de ensayo enzimático en los pozos con cinco microlitros de solución enzimática. A continuación, prepare el sustrato en blanco y muestree los pozos pipeteando 95 microlitros de tampón de ensayo enzimático en los pozos. Justo antes de medir, aplique cinco microlitros de tampón de ensayo enzimático en los seis pozos en blanco.

Aplique cinco microlitros de la solución de sustrato de 20 milimolar a los pozos de muestra. Utilice una pipeta multicanal a un ajuste de 50 microlitros para mezclar suavemente los pozos. A continuación, inserte la placa en el lector de microplamas y mida cada pozo a 255 nanómetros.

Por último, realice el análisis en una hoja de cálculo. Aquí se muestran dos ejemplos de placas de agar LB después de una transformación óptima y no óptima. Demasiadas colonias bacterianas indican que dos de las bacterias fueron chapadas o que los antibióticos pueden estar caducados.

Muy pocas colonias bacterianas pueden indicar que o bien no se utilizó suficiente plásmido para la transformación o que se utilizaron demasiados antibióticos para seleccionar las bacterias. El pellet bacteriano que contiene la proteína expresada en cantidades de miligramos se cosecha y la expresión se verifica a través de sdS-página. Algunos problemas pueden ocurrir durante este proceso de otro modo simple, incluyendo las proteínas que forman cuerpos de inclusión o la proteína que no se expresa.

Si se utiliza una etiqueta His para etiquetar la proteína, la cromatografía de afinidad con agarosa NTA de níquel es un método de captura fácil y barato que elimina la mayoría de las contaminaciones. Si no se utiliza ninguna etiqueta, una combinación de precipitación de sulfato de amonio y una cromatografía de intercambio hidrófobo consecutiva también puede separar la proteína de la mayoría de otras proteínas. La proteína se separa aún más de las contaminaciones sobrantes por cromatografía de intercambio iónico seguida de cromatografía de exclusión de tamaño para obtener una proteína suficientemente pura.

Ninguno de los métodos descritos es difícil en particular. Pero todos los métodos requieren entrenamiento. Los primeros intentos pueden fallar, pero los experimentos tendrán éxito después de algunas adaptaciones adicionales.

Todos los métodos presentados aquí son métodos generales de purificación de proteínas. Aunque está especializado en proteínas FAHD, el protocolo puede adaptarse a cualquier proteína que uno desee purificar. FAHD-1 humano recombinante ha sido obtenido por los métodos descritos y las estructuras de rayos X de alta resolución contribuyeron masivamente a nuestra comprensión de FAHD-1 por la funcionalidad que actúa como decarboxilasa e hidrolasa.

Las bacterias utilizadas en este trabajo son cepas de seguridad y no peligrosas. Las guías de seguridad generales se aplican a todas las columnas químicas y FPLC deben manejarse con cuidado.