Name: Análisis experimental del engulfment de thymocyte Apopético por los macrófagos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprende a preparar timocitos apoptóticos y macrófagos peritoneales para estudiar la efagocitosis en biología celular e inmunología. Este protocolo permite evaluar la eficiencia del engulfment y el efecto de inhibidores específicos.

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La investigación en el laboratorio de Shao es apoyada por la investigación de premio innovador de la Facultad de medicina y el Premio de piloto de la Facultad Junior del Departamento de medicina interna, Universidad de Cincinnati y Grant DK K01_095067 de NIDDK/NIH.

Ratones experimentales fueron criados y mantenidos en nuestra colonia de ratones. Todo el trabajo en animales se llevó a cabo de acuerdo con las pautas del Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Cincinnati.
1. preparación de los timocitos apopónticos etiquetados como CFSE
<ol><li>Eutanasia dos ratones C57/B6 ingenuos por inhalación de CO2 durante 10 min y diseccionar para abrir la cavidad torácica, remover (extraer) el timo con fórceps curvados de punta fina en un plato de Petri de cultivo de tejido que contenga 10 ml de medio RPMI1640.</li>
	<li>Obtenga la suspensión de una sola célula moliendo todo el timo contra dos extremos esmerilados de los portaobjetos del microscopio y luego filtre la suspensión a través del colador de células de 100 μm.</li>
	<li>Recoja la suspensión de timus de 10 mL en un tubo de 50 mL y centrifugue a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante, resupend en 40 mL de 1x PBS, y cuente los números celulares con un hemociómetro.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspendio en 20 mL de 1x PBS en un tubo de 50 mL como una suspensión de célula única con hasta 2 x 108 células (si más de 2 x 108 células, Resuspender el resto de las células en otros 20 ml de 1 x PBS en un tubo de 50 ml diferente).</li>
	<li>Hacer 5 μM de CFSE en el mismo volumen (20 mL) de 1x PBS en un tubo separado de 50 mL pipeteando 40 μL de la solución de la bolsa de CFSE (2,5 mM) en 20 mL de 1x PBS y mezclar bien invirtiendo el tubo 2-3 veces.</li>
	<li>Añadir los 20 mL de CFSE del paso 1,7 en los 20 mL de suspensión celular del paso 1,6 (la concentración final de CFSE es ahora de 2,5 μM). Nota: para cada suspensión de celda de 20 mL, se necesita un tubo de CFSE de 20 mL.</li>
	<li>Invierta la célula y el tubo de mezcla de CFSE 2-3 veces e incube la mezcla en la oscuridad a temperatura ambiente durante un máximo de 2 min, luego detenga la reacción añadiendo 10 mL de suero de caballo inactivado por calor.</li>
	<li>Centrifugar la mezcla de tubos de 50 mL a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Nota: Si el etiquetado CFSE es exitoso, el pellet de células se convertirá en color amarillo claro.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y resuspender el pellet de células en 40 mL de 1x PBS y cuente los números celulares con un hemociómetro.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Lavar el pellet de la célula de nuevo con 40 mL de medio RPMI1640.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y las células de resuspendio con RPMI1640 medio de cultivo de tejido (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% de FBS (calor inactivado), 20 mM de glutamina y 1x Pen/Strep) a una concentración de 7 x 106 células/ml en un plato de cultivo de tejido de 100 mm. Nota: si se obtienen más células, se necesita un plato de cultivo de tejido de 100 mm por separado.</li>
	<li>Añadir staurosporina en el cultivo de la suspensión celular a una concentración final de 1 μM y cultivo durante 4 h a 37 ° c en una incubadora de cultivo de tejidos suministrada con 5% de CO2.</li>
</ol>2. preparación de los macrófagos peritoneales
<ol><li>Inyectar dos ratones C57B6 (o cualquier ratón manipulado por genes en el laboratorio) intraperitonealmente con 1 mL de tioglycollato envejecido al 3% en el día 0.</li>
	<li>Eutanasia los ratones en el día 5 como en el paso 1,1, corte y cáscara abrir la piel abdominal pero dejar el peritoneo intacto. Enjuague la cavidad peritoneal empujando rápidamente 10 mL de tampón de lavado (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) en la cavidad peritoneal utilizando una jeringa de 10 mL unida con una aguja de 18 G.</li>
	<li>Recupere el tampón de lavado lentamente con la misma aguja/jeringa y recoja el tampón de lavado en un tubo de 50 mL (los detalles se refieren al artículo15del laboratorio de Janssen).</li>
	<li>Lavar el gavaje peritoneal dos veces con 1x PBS, resuspender los macrófagos peritoneal en RPMI1640 medio de cultivo de tejido a una densidad de 2 x 106 células/ml y alícuota 500 μL en cada pozo de la placa de 24-well. Dejar la placa en una incubadora de cultivo de tejido durante 2 h.</li>
	<li>Retire las células flotantes aspirando y reemplazando con 500 μL de medio de cultivo fresco, dos veces.</li>
	<li>Opcionalmente, añadir inhibidor de la tirosina del receptor TAM, RXDX-106, en las concentraciones indicadas en las leyendas de la figura en cada pozo de la cultura macrófagos e incubar para otro 2 h.</li>
</ol>3. cocultivo de macrófagos peritoneal con timocitos apopónticos
<ol><li>Recoger los timocitos apopónticos del paso 1 y lavar tres veces con RPMI1640 medio. La eficiencia de la inducción apopóntica se puede medir en esta etapa con el kit anexion V/7-AAD.</li>
	<li>Distribuir 0-12 x 106 células (en 500 μl medio) en cada pozo de los cultivos de macrófagos de protocolo #2, de acuerdo con la disposición experimental (por ejemplo, ver figura 1). Esto hace que todo el volumen de cultivo de 1 mL en cada pozo de la placa de 24-well. Añadir el anticuerpo de bloqueo en la cultura inmediatamente antes de la adición de los timocitos apopónticos.</li>
	<li>Cultivo de la mezcla celular a 37 ° c durante 4 h en una incubadora de cultivo de tejidos suministrada con 5% de CO2.</li>
	<li>Lave cada pozo de la cultura con 1x PBS (que contiene 500 μM EDTA) dos veces para eliminar las células apopónticas de flotación libre.</li>
	<li>Mancha los macrófagos atados con placas con CD11b-PE en esta etapa.<ol>
<li>Lave los macrófagos atados con placas con tampón de tinción (1x PBS, 1% BSA) una vez.</li>
		<li>Añadir 200 μL de tampón de tinción que contenga 2 μL de CD11b-PE en cada pozo.</li>
		<li>Incubar la placa a 4 ° c durante 20 min.</li>
		<li>Lave cada pozo de la placa tres veces con el tampón de tinción.</li>
		<li>Añadir 200 μL de tampón de tinción y proceder a la placa de análisis de imagen bajo el microscopio fluorescente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativamente, separe los macrófagos ligados a placas añadiendo 1 mL de lidocaína al 1% en PBS e incubando durante 10 min a 37 ° c.</li>
	<li>Separe los macrófagos encuadernado en placa con pipeteo repetitivo.</li>
	<li>Transfiera la suspensión de macrófagos a un tubo FACS de 5 mL de fondo redondo individual de cada pozo de la placa de 24-well.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Extraer el sobrenadante y añadir 200 μL de tampón de tinción que contenga 2 μL de CD11b-PE (dilución 1:200 en tampón de tinción).</li>
	<li>Incubar la suspensión celular en tampón de tinción a 4 ° c durante 20 min.</li>
	<li>Lavar la suspensión de la célula dos veces con tampón de tinción.</li>
	<li>Añadir 200 μL de tampón de tinción y proceder al análisis de FACS con un CITOMETRO de caudal y analizar el porcentaje de macrófagos positividad de la CFSE.</li>
</ol>

<ol><li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).</li>
<li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+death+and+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li>
<li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+cancer%3A+from+pathogenesis+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87(2011).</li>
<li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research%3A+Where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058(2016).</li>
<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li>
<li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li>
<li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li>
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<li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annal+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li>
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<li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance%3A+progress+and+conundrums%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La apoptosis es un proceso de muerte celular altamente conservado que involucra muchas cascadas de señal e induce la expresión de proteínas, secreción, y el transporte. La apoptosis se asocia a menudo con los cambios de morfología celular17. Las células apopónticas liberan activamente citocinas y quimioquinas que atraen a los fagocitos para emigrar al sitio e iniciar el proceso de engulfment, una vía extremadamente compleja bajo control estricto18. Por otro lado, la muerte ...

Nuestro cuerpo genera 1-10 mil millones de células apopónticas sobre una base diaria. Se debe borrar un número tan grande de células apopónticas de manera que las respuestas inmunitarias permanezcan en reposo. Para asegurar el aclaramiento de las células apopónticas de manera oportuna, numerosos tipos de células residentes de tejido y células circulantes desarrollan mecanismos para engullir las células apopónticas1. Regulación disfuncional de la apoptosis se ha implicado en la aparición y progresión de diversas enfermedades inflamatorias y autoinmunidad2. La apoptosis también desempeña un papel crítico en la patogénesis del desarrollo del cáncer y su posterior resistencia a los tratamientos convencionales3,4. La eliminación de las células apopónticas generalmente promueve una respuesta antiinflamatoria, que puede estar relacionada con la tolerancia inmunológica5. La alteración del aclaramiento de las células apopónticas impulsa la autoinmunización y contribuye al desarrollo de enfermedades autoinmunes sistémicas tanto en humanos como en ratones6.
Cuando las células se someten a la apoptosis, exponen la fosfatidilserina (PtdSer) desde el prospecto interno hasta el prospecto externo de la membrana. El PtdSer será reconocido por los fagocitos a través de los receptores de la superficie. Se han identificado más de una docena de receptores para reconocer y/o facilitar el internalización de las células apopónticas. En general, hay al menos tres tipos de receptores de superficie implicados en el aclaramiento de la célula apopóntica: receptores tethering, reconocer las células apopónticas; receptores de cosquillas, iniciar el engulfment; receptores de Chaperos, facilitan todo el proceso7. Los receptores de tirosina quinasas TAM (TAM RTKs) constan de Tyro-3, AXL y MER y se expresan principalmente por células mieloide del sistema inmunitario8. La función principal de TAM RTKs es servir como receptores de tethering, facilitando la eliminación fagocitaria de células apopónticas y escombros. Nuestro grupo ha estudiado el aclaramiento de células apopécticas mediadas en el entorno de autoinmunidad durante muchos años. El crecimiento proteico dependiente de la vitamina K, proteína específica 6 (Gas6) y proteína S (pros) se une y activa los receptores TAM9,10. Gas6 se produce en el corazón, los riñones y los pulmones. ProS se produce principalmente en el hígado11. TAM reconoce las células apopónticas de tal manera que la terminal N de Gas6/ProS se une al PtdSer en una célula apopéctica y el terminal C de Gas6/ProS se une a los receptores TAM que anclaron en la superficie de los fagocitos. Junto con los otros receptores, el internalización de las células apopónticas se produce12. Aunque Mer puede unirse a los ligandos ProS y Gas6, descubrimos que Gas6 parece ser el ligando único para la fagocitosis de macrófagos mediada por Mer de las células apopónticas, que pueden ser bloqueadas por el anticuerpo anti-Mer13. Los macrófagos son fagocitos profesionales. El aclaramiento rápido de las células apopónticas por macrófagos es importante para la inhibición de la inflamación y las respuestas autoinmunes contra antígenos intracelulares. El receptor de la tirosina quinasa del Mer es crítico para el internalización del macrófago y el aclaramiento eficiente de las células apopónticas14. En el bazo del ratón, Mer expresa principalmente en la zona marginal y los macrófagos corporales tangibles13.
El protocolo presentado aquí describe un método básico para inducir la apoptosis celular y demostrar maneras de medir el proceso y la eficiencia de la efervocitosis. Estos protocolos pueden ser fácilmente adaptados para estudiar la efferocitosis por otros tipos de células en el internalización de las células apopónticas de diferentes orígenes.

<table><tbody><tr><td>Tampón de lisado Ack</td><td>GIBCO</td><td>A10492</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V/7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mer Anti-Mer</td><td>R& D Systems</td><td>BAF591</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-PE (clon M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553311</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 mM)</td><td>GIBCO</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352017</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos esmerilados</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-343</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo (inactivado por calor)</td><td>Invitrogen</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5647</td><td>Prepare un tampón al 1% en 1x PBS</td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Corning</td><td>10040CV</td><td></td></tr><tr><td>RXDX-106</td><td>Selleck Chemicals</td><td>CEP-40783</td><td></td></tr><tr><td>Staurosprine (100 mg)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2541-100</td><td>Agregue 214,3 ml de DMSO en 100 mg para hacer una solución de almacenamiento de 1 mM</td></tr><tr><td>Tioglicolato Medio Cervecero Modificado</td><td>BD Biosciences</td><td>243010</td><td>Prepare tampón de tioglicolato al 3% en 1&agudo; PBS, esterilizado en autoclave y almacenar en la oscuridad durante 3 meses.</td></tr></tbody></table>

análisis experimental del engulfment de thymocyte apopético por los macrófagos

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

La apoptosis celular es un proceso natural y desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario, la regulación homeostática, la inducción de la tolerancia inmune y la resolución de la inflamación. La acumulación de desechos apopónticos en el cuerpo puede desencadenar respuestas inflamatorias crónicas que conducen a enfermedades autoinmunes sistémicas con el tiempo. El aclaramiento de células apopónticas deterioradas se ha implicado en una variedad de enfermedades autoinmunes. El aclaramiento apopético es un proceso complejo que raramente se detecta en condiciones fisiológicas. Implica abundantes receptores de superficie y moléculas de señalización. El estudio del proceso de aclaramiento de la célula apopéctica proporciona mecanismos moleculares perspicaces y subsiguientes respuestas biológicas, que pueden conducir al desarrollo de nuevas terapias. Aquí describimos los protocolos para la inducción de los timocitos apopónticos, la preparación de los macrófagos peritoneales y el análisis del aclaramiento de las células apopónticas por citometría de flujo y microscopía. Todas las células se someten a la apoptosis en una cierta etapa, y muchas células residenciales y circulantes pueden captación de desechos apopético. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí se puede utilizar en muchas aplicaciones para caracterizar la Unión de la célula apopóntica y la ingestión por muchos otros tipos de células.

Análisis de la enfaración peritoneal de los timocitos apópticos por macrófagos. Los macrófagos y las células apopónticas peritoneal se prepararon y cocultivaron como se describe en el protocolo. Los macrófagos fueron separados y manchados con el anticuerpo anti-CD11b de PE conjugada durante 20 min en hielo. Los macrófagos fueron lavados y procesados en un CITOMETRO de flujo. Como se ve, no hay macrófago positivo de CFSE en el cuadrante inferior derecho cuando no se agregaron células apopónticas en la cul...

Aquí presentamos un protocolo para preparar los timocitos apopónticos y los macrófagos peritoneal y analizar la eficiencia de la efervocitosis y el bloqueo específico por inhibidores de los timocitos apopónticos. Este protocolo tiene una amplia aplicación en el aclaramiento mediado por células de otras partículas, incluyendo granos artificiales y bacterias.

Análisis experimental del engulfment de thymocyte Apopético por los macrófagos

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Nuestro cuerpo genera de uno a 10 mil millones de células apoptóticas cada día. El aclaramiento eficiente de estas células ayuda a eliminar los desechos celulares y mantener los inventarios. Este método se puede utilizar en muchas aplicaciones para caracterizar la unión de células apoptóticas y la ingesta por muchos otros tipos de células fagocíticas.Demostrar este procedimiento estará Yuxuan Zhen, un técnico superior en mi laboratorio. Para cosechar timocitos, después de abrir la cavidad torácica de un ingenuo ratón C57 negro 6, usa pinzas de punta fina curva para sacar el timo. Coloque el órgano en una placa de cultivo de tejido que contenga 10 mililitros de RPMI 1640 Medio.Moler todo el timo contra los extremos esmerilados de dos diapositivas de microscopio y filtrar la suspensión de tejido resultante a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Recoger los timocitos por centrifugación y resuspender el pellet en 40 mililitros. Después de contar, centrifugar las células de nuevo y resuspend hasta dos veces 10 a las ocho células en 20 mililitros de PBS fresco por tubo de 50 mililitros.Etiquete las células con cinco cfSE micromolares en 20 mililitros de PBS por tubo. Invierta los tubos de dos a tres veces para mezclar antes de incubar los timocitos durante no más de dos minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz. Al final de la incubación, detener la reacción con 10 mililitros de suero de caballo inactivado por calor y recoger las células por centrifugación.Resuspender las células etiquetadas en 40 mililitros de PBS fresco para el conteo y centrifugación seguido de un lavado adicional con 40 mililitros de medio. Después del lavado medio, resuspender los timocitos a siete veces 10 a las seis células por mililitro de concentración media de cultivo de tejido y sembrar las células en un plato de cultivo de tejido de 100 milímetros. A continuación, añadir estaurosporina al cultivo celular en una concentración final de un micromolar y colocar la placa en una incubadora de cultivo de tejido durante cuatro horas.Para el aislamiento de macrófagos peritoneales, inyecte dos ratones C57 negros 6 por vía intraperitoneal con un mililitro de tiolitismo envejecido en el día cero antes de abrir la piel abdominal sin alterar el peritoneo en el día cinco. Para lavar la cavidad peritoneal, utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 18 para empujar rápidamente 10 mililitros de tampón de lavado en la cavidad antes de aspirar lentamente el tampón de lavado para su recolección en un tubo de 50 mililitros. Lave el lavado peritoneal dos veces con PBS.Resuspender los macrófagos peritoneales a dos veces 10 a las seis células por mililitro de concentración media de cultivo tisular. Próxima semilla 500 microlitros de macrófagos en cada pozo de una placa de 24 pozos y colocar la placa en una incubadora de cultivo de tejido durante dos horas. Al final de la incubación, aspirar el sobrenadante para eliminar las células flotantes y añadir 500 microlitros de medio de cultivo tisular a cada pocótulo.Añadir inmediatamente cero a 12 veces 10 a los seis timocitos en 500 microlitros de medio a cada pozo del cultivo y colocar la placa en la incubadora de cultivo de tejido durante cuatro horas. Al final de la incubación, lavar cada pozo dos veces con PBS fresco para eliminar cualquier célula apoptótica flotante libre seguido de un solo lavado con tampón de tinción. A continuación, etiquete los macrófagos unidos a la placa con 200 microlitros de tampón de tinción complementados con un anticuerpo anti-CD11b apropiado por pozo y coloque la placa a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.En este experimento representativo, hasta el 30% de los macrófagos peritoneales estimulados por tioglycollato demostraron una señal positiva en el canal CFSE que indicaba que estos fagocitos habían ingerido células apoptóticas etiquetadas por CFSE. La observación microscópica del engufato de macrófagos de las células apoptóticas es esencial para investigar la capacidad de los macrófagos para ingerir células apoptóticas como macrófagos positivos de CFSE repartidos en el cuadrante inferior derecho debido a diferentes intensidades que indican que el número de células apoptóticas dentro de los macrófagos individuales es diferente. Una mayor proporción de células apoptóticas a macrófagos no sólo aumenta el número de macrófagos que ingieren células apoptóticas, sino que también mejora la capacidad de los macrófagos para ingerir más células apoptóticas.En otro conjunto de experimentos, alrededor del 15% de los macrófagos se convirtieron en CFSE positivos cuando CFSE etiquetó timocitos apoptóticos se añadieron a la cultura de los macrófagos durante cuatro horas, lo que indica que estos macrófagos eran los macrófagos fagocíticos. El anticuerpo Mer bloquea la efferocitosis de macrófagos de una manera dependiente de la dosis y la obstrucción general puede representar alrededor del 30% de la eficiencia de la efferocitosis en el entorno actual. Además, un inhibidor del receptor TAM recientemente aprobado atenúa la efferocitosis de macrófagos de una manera dependiente de la dosis hasta una concentración de aproximadamente 100 nanomolares.Recuerde siempre comprobar el porcentaje de células apoptóticas, ya que este número afecta directamente a la eficiencia de la efferocitosis. Los macrófagos fagocíticos pueden ser analizados más a fondo por Western blot para investigar las moléculas de señalización reguladas por el proceso de engullimiento y por microscopía para estudiar la dinámica del engullimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, demostramos el ensayo de eferocitosis para estudiar el aclaramiento de células apoptóticas utilizando microscopía confocal. La eferocitosis es un proceso de varios pasos en el que las células apoptóticas son engullidas por fagocitos y degradadas dentro de vesículas llamadas eferosomas. Este protocolo proporciona un método para visualizar porciones internalizadas y no internalizadas de células apoptóticas individuales y cuantificar la eferocitosis.

Ensayo de eferocitosis de células fijas: un método para estudiar la absorción eferocítica de células apoptóticas por macrófagos mediante microscopía de fluorescencia

Este video muestra un procedimiento para analizar la eferocitosis mediada por macrófagos peritoneales de timocitos apoptóticos de ratón mediante microscopía de fluorescencia.

Análisis de la eferocitosis de timocitos apoptóticos por macrófagos peritoneales

Este video muestra un ensayo de apoptosis en células cancerosas inducida por linfocitos T efectores preactivados. Al co-cultivar estas células con células cancerosas marcadas con núcleos fluorescentes, se agrega un sustrato fluorogénico escindible en caspasas. Las células cancerosas apoptóticas mostrarán un color diferente en sus núcleos, lo que dará lugar a una fluorescencia dual. Esta doble fluorescencia es indicativa de células cancerosas que experimentan apoptosis.

Un ensayo in vitro para estudiar la citotoxicidad de las células T CD8+ preactivadas contra las células cancerosas

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de eventos de señalización intracelular inducidos en células viables por interacción física con células muertas o moribundas adyacentes. El protocolo se centra en los eventos de señalización inducidos por el reconocimiento de las células muertas mediado por receptores, en contraposición a su captación fagocítica o liberación de mediadores solubles.

Identificación de eventos de señalización intracelular inducida en células viables por la interacción con las células vecinas sometidos a la célula apoptótica de la muerte

En el presente documento se describe un ensayo de fagocitosis utilizando las células embrionarias dispersas de Drosophila . Nos permite cuantificar con facilidad y precisión los niveles de fagocitosis in vivo , e identificar nuevas moléculas necesarias para la fagocitosis de las células apoptóticas.

Ensayo de Fagocitosis para Células Apoptóticas en Drosophila Embriones

Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Describimos aquí un protocolo para investigar la citotoxicidad de CD8 pre-activado+ T las células contra las células cancerosas mediante la detección de apoptosis cáncer células vía en tiempo real la microscopia. Este protocolo puede investigar los mecanismos detrás de la supresión de la célula de T inducida por la célula mieloide y evaluar compuestos destinados a reposición de T las células vía bloqueo de células mieloides supresores inmunes.

Tiempo real detección de Vitro Tumor de la célula apoptosis inducida por CD8+ T las células para el estudio de las funciones inmunológicas de supresores de Tumor infiltrante de células mieloides

Las enfermedades neurodegenerativas se asocian con funciones de microglía desreguladas. Este artículo describe un ensayo in vitro de fagocitosis de células de neuroblastoma por macrófagos iPSC. Las lecturas de microscopía cuantitativa se describen tanto para imágenes de lapso de tiempo de células vivas como para imágenes de alto contenido de células fijas.

Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por iPSC-Macrófagos

Este protocolo se basa en la muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Utilizamos la citometría de flujo para analizar la tinción doble de anexina V y 7-AAD para detectar la muerte celular, utilizando toda la célula y empleando microscopía electrónica de barrido para observar la morfología de la membrana celular.

Muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA y su validación

Aprende a preparar timocitos apoptóticos y macrófagos peritoneales para estudiar la efagocitosis en biología celular e inmunología. Este protocolo permite evaluar la eficiencia del engulfment y el efecto de inhibidores específicos.

Análisis experimental del engulfment de thymocyte Apopético por los macrófagos

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