Name: Evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprende la técnica de digestión en membrana para analizar interacciones proteína-proteína mediante espectrometría de masas. Este método simplifica el flujo de trabajo al eliminar la electroforesis en gel de poliacrilamida.

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Este estudio fue apoyado en parte por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia KAKENHI Grant Number 17K09869 (a AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), una beca de investigación de Kanehara Ichiro Medical Science Foundation y una beca de investigación de Suzuken Memorial Foundation (todo a TM).

1. Inmunoprecipitación
NOTA: Utilizamos tampón de lisis dodecilo no sódico (SDS) y elución de citrato, como se describe en las secciones siguientes. Sin embargo, el uso de una técnica alternativa de inmunoprecipitación interna también puede ser aplicable para preparar muestras LC-MS/MS.
<ol><li>Células cultivadas transfectos con vectores que codifican una etiqueta de epítopos solo o una proteína de fusión. Para adquirir datos representativos, transfiera células J774 (1 x 106) con vectores que codifican proteína fluorescente verde (GFP) solo o Capn6 fusionado con GFP (gen calpain-6) utilizando liposomas catiónicos.</li>
	<li>Conjugar anticuerpos a cuentas magnéticas.<ol>
<li>Para ello, mezcle el anticuerpo anti-GFP (2 l/reacción) con perlas magnéticas (25 l/reacción) en 500 l de tampón de fosfato de citrato (24,5 mM de ácido cítrico, fosfato sódico dibásico de 51,7 ml; pH 5,0) en un tubo de ensayo de 1,5 ml.</li>
		<li>Gire la mezcla a 50 rpm durante 1 h a temperatura ambiente. Luego, lave las perlas conjugadas con IgG tres veces con tampón de fosfato de citrato que contenga un monolaurate de polioxietileno (20%) de polioxietileno (20).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lise las células transinfectadas utilizando un tampón de lisis adecuado. Para la adquisición de datos representativos, licela las células transtramperosas durante 30 minutos en hielo en 400 l de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% de poli(oxyethelene) octilfenil éter) que contiene 40 mmol/L de flúor, 50 g/mL de éter de leupetina, 50 mL de aprotinin, ortovanato sódico de 200 omol/L y ácido tetraacético de etilenglicol de 1 mM (EGTA) en tubos de ensayo de 1,5 ml 24 h después de la transfectuación.</li>
	<li>Limpie el lisado centrifugando a 15.000 x g durante 5 min y recoja el sobrenadante.</li>
	<li>Prelimpiar el lisado. Añadir perlas magnéticas sin etiquetar (25 l/reacción) en un tubo de ensayo de 1,5 ml. Lave las perlas tres veces con 500 ml de tampón de fosfato de citrato. Después de la eliminación del tampón de fosfato de citrato en el lavado final, agregue el lisato celular sobre las cuentas magnéticas. Gire la mezcla utilizando un rotador de 50 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque el tubo de ensayo en un soporte magnético durante 5 minutos para la separación magnética y recoja el lisado celular. Se recomienda el uso del soporte magnético designado por el fabricante.</li>
	<li>Une las proteínas diana a las cuentas conjugadas. Coloque las perlas conjugadas con jugadas de inmunoglobulina (Ig)G en un soporte magnético durante 5 minutos para la separación magnética, deseche el tampón de citrato y luego agregue el lisado celular a las cuentas separadas.</li>
	<li>Gire la mezcla a 50 rpm durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Separe las proteínas diana de las proteínas libres no objetivo. Lave las perlas tres veces con 500 ml de tampón de fosfato de citrato que contiene un monolaurate de polioxietileno al 0,1% (20). Después del lavado final, añadir 30 l de tampón de citrato (pH 2-3), e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente para eluir las proteínas diana. NOTA: Si la recuperación de la inmunoprecipitación es insuficiente, el uso de etiquetas de epítopos alternativas, como FLAG o HIS, puede mejorar la eficiencia. Si la eficiencia de la elución es insuficiente, el uso de otros eluantes, como una solución basada en SDS, puede mejorar la eficiencia.</li>
</ol>2. Digestión en la membrana de las proteínas
NOTA: El uso de materiales y equipos libres de proteínas es necesario para evitar la contaminación con proteínas exógenas. Además, se recomienda que el operador use una máscara quirúrgica y guantes para evitar la contaminación por proteínas humanas.
<ol><li>Cortar las membranas PVDF en trozos de 3 mm x 3 mm utilizando tijeras quirúrgicas que han sido limpiadas con metanol y secas inmediatamente antes de su uso.</li>
	<li>Añadir de 2 a 5 ml de etanol en las piezas de membrana PVDF en papel de aluminio limpio.</li>
	<li>Antes de que se sequen por completo, agregue el eluant (2-5 l cada uno, 4-6 piezas por muestra) en las membranas fotovoltaicas hidrófilas, y luego seque al aire las membranas hasta que la superficie de la membrana se vuelva mate. Las membranas secas se pueden almacenar a 4 oC.</li>
	<li>Transfiera todas las membranas en tubos de plástico de 1,5 ml, agregue 20-30 ml de etanol para hacer las membranas hidrófilas y, a continuación, retire el etanol con una pipeta.</li>
	<li>Antes de que la membrana se seque por completo, añadir 200 ml de solución de reacción basada en ditiothreitol (TDT) (80 mM NH4HCO3, 10 mM de TDT y 20% acetonitrilo) e incubarla a 56 oC durante 1 h.</li>
	<li>Sustituya la solución de reacción por 300 ml de solución de yodoacetamida (80 mM NH4HCO3,55 mM de yodoacetamida y 20% acetonitrilo), e incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar las membranas dos veces con 1 ml de agua destilada y una vez con 1 ml de acetonitrilo al 2% mediante mezcla de vórtice para >10 s.</li>
	<li>Disolver la trippsina liofilizada de grado MS (Tablade materiales)directamente en la solución de reacción (30 mM NH4HCO3 que contiene 70% de acetonitrilo). Añadir 100 l de la solución de reacción que contenga 1 g de tripsina (Tablade materiales)(30 mM NH4HCO3 que contenga 70% de acetonitrilo) e incubar a 37 oC durante la noche.</li>
	<li>Transfiera la solución de reacción que contiene los digeridos trípticos a un tubo de ensayo limpio de 1,5 ml utilizando una pipeta.</li>
	<li>Añadir 100 oC de solución de lavado (70% acetonitrilo/1% ácido trifluoroacético) a la membrana e incubarla a 60 oC durante 2 h. Recoger la solución de lavado y mezclarla con la solución de reacción. Añadir otros 100 l de solución de lavado a la membrana y sonicarla durante 10 minutos. A continuación, recoja la solución de lavado y mezcle con la solución de reacción.</li>
	<li>Cubra el tubo de ensayo con un pedazo de película de laboratorio y haga un par de pequeños agujeros con una aguja. Seque la solución con un concentrador de vacío.</li>
	<li>Disolver el residuo en 10 s de ácido fórmico al 0,2%. Después de la centrifugación (12.000 g , 3 minutos a temperatura ambiente), transfiera el sobrenadante a un tubo de muestra. NOTA: Los lavados son los pasos críticos de esta sección. Durante la digestión de proteínas en la membrana, el lavado de las membranas que contienen las proteínas inmovilizadas después de la reducción y alquilación con agua destilada, seguido de un 2% de acetonitrilo, durante más de 10 segundos cada una, es fundamental para la eliminación de los reactivos.</li>
</ol>3. Análisis de ionización LC-electrospray (ESI)-MS/MS
<ol><li>Activar un instrumento ESI-MS/MS (Tablade materiales)junto con un sistema HPLC nano-LC (Tablade materiales). Vincular una columna previa (Tabla de materiales) y una columna analítica (Tabla de materiales).</li>
	<li>Antes del análisis, calibrar el espectrómetro de masas utilizando digeridos trípticos de albúmina sérica bovina disuelta en 0,2% de ácido fórmico, que proporciona péptidos estándar.</li>
	<li>Analizar las muestras utilizando el modo iónico positivo y un rango de masa de 400–1,250 m/z; luego adquirir hasta 10 espectros MS/MS (100 ms cada uno) con un rango de masa de 100–1.600 m/z y un gradiente lineal de 2%–80% de acetonitrilo y 0.2% de ácido fórmico durante 80 min a un caudal de 300 nL/min.</li>
	<li>Analizar los datos de salida utilizando software para la identificación de proteínas (Tabla de Materiales) para identificar las proteínas asociadas candidatas. Para la identificación positiva de una proteína candidata, se requiere la detección de al menos un fragmento de péptido de alta fidelidad (> 95% de fidelidad).</li>
	<li>Omita las proteínas que se precipitan de manera similar en los lysatos que expresan GFP (transfección de vector que expresa una etiqueta GFP solamente) de la lista de proteínas candidatas. NOTA: Si se identifican pocas proteínas en el análisis de la base de datos, la modificación de las condiciones de adquisición de EM/MS (por ejemplo, cambiar el tiempo de 100 ms cada una a 50 ms cada una) puede aumentar el número de proteínas identificadas.</li>
</ol>

<ol><li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+protein+folding%3A+progress+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79(2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Atherosclerosis+and+Thrombosis%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li>
<li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li>
<li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li>
<li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li>
<li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li>
<li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li>
<li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li>
<li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6%2C+a+microtubule-stabilizing+protein%2C+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li>
<li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+elongation%2C+co-translational+folding+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li>
<li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%25+acetonitrile%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos descrito previamente un análisis de las modificaciones oxidativas de la apolipoproteína B-100 en lipoproteínas oxidadas de baja densidad utilizando LC-MS/MS precedida por una técnica de digestión en membrana6. En el presente estudio, combinamos esta técnica con la inmunoprecipitación y hemos identificado varias proteínas asociadas al calpain-6. Esta novedosa técnica representa un método conveniente de detección de proteínas asociadas a los candidatos. Calpain-6 es un miembro no proteolítico ...

Aunque las proteínas desempeñan un papel constitutivo en los organismos vivos, se sintetizan, procesan y degradan continuamente en el entorno intracelular. Además, las proteínas intracelulares interactúan con frecuencia física y bioquímicamente, lo que afecta a la función de uno o ambos1,2,3. Por ejemplo, la unión directa del homólogo proteico asociado al esferoctico CWC22 con el factor de inicio de latraslación eucariota 4A3 (eIF4A3) es necesaria para el montaje del complejo de unión de exón 4. En consonancia con esto, un mutante eIF4A3 que carece de afinidad por CWC22 no facilita el empalme de ARNm impulsado por el complejo de cruces de exón4. Por lo tanto, el estudio de las interacciones proteicas es crucial para la comprensión precisa de la regulación fisiológica, así como de las funciones celulares.
Los avances recientes en espectrometría de masas (EM) se han aplicado al análisis exhaustivo de las interacciones proteína-proteína. Por ejemplo, la co-precipitación de proteínas endógenas o proteínas etiquetadas introducidas exógenamente con sus proteínas asociadas, seguida según el análisis de la EP, permite la identificación de nuevas interacciones proteicas5. Sin embargo, uno de los principales cuellos de botella del análisis de la SM/MS es la mala recuperación de los resúmenes trípticos de las muestras de proteínas. Para realizar análisis proteómicos en los lysatos celulares, generalmente se emplean técnicas de digestión en gel y en membrana para preparar muestras de MS/MS. Hemos comparado previamente un procedimiento de digestión en gel con una técnica de digestión en la membrana6, y hemos demostrado que este último se asoció con una mejor cobertura de secuencia. La membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) puede ser adecuada para este fin, ya que es mecánicamente robusta y resistente a altas concentraciones de disolventes orgánicos7,8, lo que permite la digestión enzimática de inmovilizados proteínas en presencia de 80% acetonitrilo9. Además, la inmovilización en una membrana puede inducir cambios de conformación en las proteínas diana, lo que conduce a mejoras en la eficiencia de la digestión tríptica10. En consecuencia, en este artículo, hemos descrito el uso del análisis de inmunoprecipitación-LC/MS/MS de interacciones proteicas utilizando una técnica de digestión en la membrana. Este sencillo método facilita el análisis conveniente de las interacciones proteína-proteína incluso en laboratorios no especializados.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Wako</td><td>014-00386</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Wako</td><td>030-05525</td><td></td></tr><tr><td>DiNA</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>cromatografía líquida de alta resolución de nanoflujo</td></tr><tr><td>DiNa AI</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>cromatografía líquida de alta resolución nanoflow equipada con muestreador automático</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads protein G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Wako</td><td>066-00461</td><td></td></tr><tr><td>HiQ Sil C18W-3</td><td>KYA Tech Co.</td><td>E03-100-100</td><td>0.10mmID * 100mmL</td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>Wako</td><td>095-02151</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific L3000008</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Colors A.v. Anticuerpo Monoclonal (JL-8)</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Wako</td><td>018-21742</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Sigma</td><td>N6507</td><td>poli(oxietileno) octilfenil éter (n = 9)</td></tr> <tr><td>péptido estándar</td><td>KYA Tech Co.</td><td>tBSA-04</td><td>digestión tríptica de albúmina sérica bovina</td></tr><tr><td>PP vial</td><td>KYA Tech Co.</td><td>03100S</td><td>tubo de muestra de plástico</td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa cooctail</td><td>Sigma</td><td>P8465</td><td></td></tr><tr><td>Software ProteinPilot</td><td>Software Sciex</td><td>5034057</td><td>para la identificación</td></tr><tr><td>de proteínas Grado de secuenciación Tripsina modificada</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>tripsina</td></tr><tr><td>Ortovanadato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico dihidratado</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Wako</td><td>206-10731</td><td></td></tr><tr><td>columna trampa</td><td>KYA Tech Co.</td><td>A03-05-001</td><td>0.5mmID * 1mmL</td></tr><tr><td>Sistema TripleTOF 5600</td><td>Sciex</td><td>4466015</td><td>Espectrómetro de masas tándem de tiempo de vuelo cuadrupolar híbrido</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Wako</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Wako</td><td>160-21211</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerosas proteínas intracelulares interactúan físicamente de acuerdo con sus circunstancias intracelulares y extracelulares. De hecho, las funciones celulares dependen en gran medida de las interacciones proteína-proteína intracelular. Por lo tanto, la investigación sobre estas interacciones es indispensable para facilitar la comprensión de los procesos fisiológicos. La co-precipitación de proteínas asociadas, seguida de un análisis de espectrometría de masas (EM), permite la identificación de nuevas interacciones proteicas. En este estudio, hemos proporcionado detalles de la novedosa técnica de la cromatografía inmunoprecipitada-líquido (LC)-MS/MS combinado con la digestión en la membrana para el análisis de interacciones proteína-proteína. Esta técnica es adecuada para inmunoprecipitados crudos y puede mejorar el rendimiento de los análisis proteómicos. Las proteínas recombinantes etiquetadas se precipitaron utilizando anticuerpos específicos; a continuación, los inmunoprecipitados borrados en piezas de membrana de difluoruro de polivinilideno fueron sometidos a alquilación reductiva. Después de la tripinización, los residuos de proteínas digeridas se analizaron utilizando LC-MS/MS. Usando esta técnica, pudimos identificar varias proteínas asociadas candidatas. Por lo tanto, este método es conveniente y útil para la caracterización de nuevas interacciones proteína-proteína.

Mediante el procedimiento descrito anteriormente, se analizaron los inmunoprecipitantes utilizando LC-MS/MS (Figura1). Después de la exclusión de proteínas derivadas exógenamente (proteínas de otras especies e IgG), se identificaron 17 proteínas en inmunoprecipitantes asociados con calpato-6 (Tabla 1) y se identificaron 15 proteínas en inmunoprecipitantes asociados a la PTF ( Tabla 2). De las proteínas asociadas al calpato-6 ...

Aquí, presentamos un protocolo para una técnica de digestión en la membrana para la preparación de muestras para espectrometría de masas. Esta técnica facilita el análisis conveniente de las interacciones proteína-proteína.

Evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Investigar la interacción proteína-proteína es indispensable para comprender los procesos fisiológicos en varios campos. En este vídeo introducimos la técnica de digestión en la membrana que permite a los investigadores realizar un análisis exhaustivo de las proteínas de unión por LA MS de una manera conveniente. La principal ventaja de esta técnica es que podemos mejorar el rendimiento del análisis proteómico para inmunoprecipitantes crudos porque no es necesaria la separación de proteínas por electroforesis de gel de poliacrilamida.Comience a conjugar el anticuerpo con las perlas magnéticas, mezclando el anticuerpo anti-GFP con las perlas en 500 microlitros de tampón de fosfato de citrato. Gire la mezcla a 50 RPM durante una hora a temperatura ambiente. Y luego lavar las cuentas conjugadas tres veces con tampón de fosfato de citrato que contiene 1%polisorbato 20.Lyse células trans infectadas de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Raspa el plato y transfiere el izado al tubo de ensayo de 1,5 mililitros. A continuación, despeje el izado centrifugando a 15.000 x g durante cinco minutos y recoja el sobrenadante.Preparar perlas magnéticas sin etiqueta lavándolas tres veces con 500 microlitros de tampón de fosfato de citrato. Después del lavado final, retire el búfer y agregue el lysate de la célula a las cuentas. Gire la mezcla a 50 RPM durante 30 minutos a temperatura ambiente.Realice la separación magnética en el soporte magnético y recoja el lysate celular. Para unir las proteínas diana a las perlas conjugadas de inmunoglobulina, coloque las perlas en el soporte magnético durante cinco minutos. Deseche el búfer de citrato y agregue el lysate de celda a las cuentas.Gire la mezcla durante una hora a 50 RPM. Para separar las proteínas diana de las proteínas libres no objetivo, lave las cuentas tres veces con 500 microlitros de tampón de fosfato de citrato que contienen 1%polisorbato 20. Después del lavado final, agregue 30 microlitros de tampón de citrato, y deje que las cuentas se sienten durante cinco minutos a temperatura ambiente para eluir las proteínas diana.Para preparar la membrana, corte las membranas PVDF en piezas de 3 milímetros por 3 milímetros utilizando tijeras quirúrgicas que se limpiaron inmediatamente antes de su uso. Coloque las piezas de membrana sobre papel de aluminio y agregue dos a cinco microlitros de etanol a cada pieza. Antes de que las membranas estén completamente secas, agregue dos a cinco microlitros de la proteína eluyentes a cada pieza y séquelos al aire hasta que la superficie de la membrana se vuelva mate.Luego transfiera las membranas a tubos de 1,5 mililitros y guárdelas a cuatro grados centígrados. Si se utiliza inmediatamente, añadir de dos a 30 microlitros de etanol que los hará hidrófilos. Retire el etanol con una pipeta, pero antes de que las membranas se sequen, agregue completamente 200 microlitros de solución de reacción a base de TDT a cada tubo, e incubarlos a 56 grados centígrados durante una hora.Después de la incubación, sustituya la solución de reacción por 300 microlitros de solución de iodoacetamida e incubar en la oscuridad durante 45 minutos. A continuación, lave las membranas dos veces con agua destilada y una vez con 2% de acetonitrilo por vórtice durante al menos diez segundos. Trabajar con acetonitrilo diáfano puede ser extremadamente peligroso.Siempre se debe usar una máscara, gafas y guantes al realizar el procedimiento de digestión en la membrana. Preparar la trippsina de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y añadir 100 microlitros de solución de reacción de trippsina a cada membrana. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados para la digestión.Al día siguiente, transfiera la solución de reacción a un tubo limpio de 1,5 mililitros y añada 100 microlitros de soluciones de lavado a la membrana. Incubar la membrana a 60 grados centígrados durante dos horas, luego recoger la solución de lavado y mezclarla con la solución de reacción. Añadir otros 100 microlitros de solución de lavado a la membrana y sonicar durante 10 minutos.A continuación, recoja la solución de lavado y mezcle con la solución de reacción. Cubra el tubo de ensayo con una pieza de película de laboratorio y haga pequeños agujeros en la película con una aguja. Seque la solución con un concentrador de vacío y disuelva el residuo en 10 microlitros de ácido fórmico al 2%.Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante tres minutos y transfiera el sobrenadante a un tubo de muestra. Analice la muestra utilizando un espectrómetro de masas vinculado a un sistema nano LC/HPLC. Con este protocolo, se identificaron 17 proteínas en el inmunoprecipitante asociado Calpain-6, 15 en el inmunoprecipitante asociado a la GFP y 11 en ambos.Es importante tener en cuenta que la detección de al menos un fragmento de péptido de alta fidelidad es necesaria para la identificación positiva de una proteína candidata. Las proteínas que se precipitaron en el lisolato que expresa la GFP, así como las histonas, las proteínas exógenas y ribosomales se omitieron de la lista. Lavar las membranas antes de la digestión tríptica con agua destilada y 2%acetonitrilo es el paso más importante en el procedimiento de digestión en membrana sobre las proteínas.Siguiendo este método, es posible confirmar la co-precipitación de la proteína diana mediante la realización de otros experimentos, como la inmunoprecipitación y el análisis de manchas occidentales. Este sencillo método permite a los investigadores explorar las nuevas interacciones proteína-proteína con análisis convenientes y altamente sensibles.

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Investigación

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Bioquímica

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