Name: Modelo murino de tumores hepáticos metastásicos en el escenario de la lesión por reperfusión de isquemia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: Aprenda a crear un modelo murino de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal para estudiar los efectos de la isquemia-reperfusión hepática en el crecimiento tumoral. Esta técnica permite investigar el impacto del estrés quirúrgico en la progresión metastásica.

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Los autores agradecen a Sara Minemyer y Alexander Comerci por la revisión linguística.

Todos los protocolos de los animales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y se adhieren a las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Los instrumentos utilizados para cualquier procedimiento quirúrgico fueron completamente esterilizados.
1. Preparación inicial
<ol><li>Antes de inyectar células cancerosas en el bazo del ratón, autoclave y esterilizar todos los instrumentos que se utilizarán durante el procedimiento.</li>
	<li>Esterilice y/o autoclave una almohadilla de calentamiento, guantes quirúrgicos, gasa, pares de tijeras, abrazaderas pequeñas, dilatador de recipientes, fórceps quirúrgicos y un porta agujas.</li>
	<li>Preparar analgésicos postoperatorios (0,1 mg/kg de buprenorfina) para administrarse después de la esplenectomía y cada 12 h durante 2 días.</li>
</ol>2. Cultivo celular
<ol><li>Asegúrese de que las células cancerosas estén libres de contaminación por micoplasma mediante el uso de un kit ELISA de micoplasma.</li>
	<li>Preparar una solución de 500 ml del medio de cultivo del águila modificada (DMEM) de Dulbecco a 4 oC para el cultivo de células cancerosas colorrectales murinas (MC38). Los medios de cultivo deben complementarse con un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 15 mM de HEPES y 200 mM de L-glutamina.</li>
	<li>Cultivar células cancerosas en un matraz libre de ANA y ARNsa (75 cm2). Incubar el cultivo celular en una incubadora humidificada celular/tejido que contenga 5% CO2. Mantener la temperatura a 37oC.</li>
	<li>Una vez que las células que proliferan alcanzan 90-100% de confluencia, aspiran a los medios antiguos, lavan las células con 1 solución salina tamponada de fosfato (PBS) y luego las tratan con 1x trippsina (0,25%) para separar las células del matraz.</li>
	<li>Recoger las células en un tubo cónico de 15 ml y centrífuga durante 5 min a 700 x g.</li>
	<li>Aspirar el medio y lavar con 1pbS dos veces por centrifugación repetida.</li>
	<li>Proceda a confirmar la viabilidad celular mediante la tinción de células con mancha azul tripa (0,4%).</li>
	<li>Resuspender las células a una concentración de 1 x 106 células/ 100 l en 1x PBS. Células de pipeteo a fondo para evitar grumos. Mantenga las células cancerosas en hielo antes de la inyección.</li>
</ol>3. Inyección de células tumorales
<ol><li>Anestetizar ratones macho de 8 a 12 semanas (C57BL6) mediante la administración de ketamina (150 mg/kg) y xilazina (12 mg/kg) utilizando una aguja de 1 ml de 25 G (0,5 mm x 16 mm).</li>
	<li>Afeitar la piel abdominal de los ratones usando cortadoras para evitar cualquier infección postoperatoria.</li>
	<li>Coloque ratones en el sistema de retracción del fijador magnético. Confirme que los ratones están completamente bajo el efecto de la anestesia pellizcando un dedo del dedo del dedo o la cola.</li>
	<li>Agregue gotas salinas en los ojos para evitar la sequedad durante el procedimiento.</li>
	<li>Solución de povidona-yodo (7,5%) a la pared abdominal asecada para desinfectar la piel antes de hacer una incisión quirúrgica.</li>
	<li>Inicialmente levante la piel con los fórceps dentados y haga una incisión de línea media con la ayuda de tijeras quirúrgicas. Luego, levante el músculo abdominal y el peritoneo para crear una incisión de línea media de aproximadamente 3 cm de longitud (proceso de medio abdomen a xifoide para exponer el contenido abdominal. Tenga cuidado de no extender la incisión más allá del proceso de xifoide para evitar sangrado extenso.</li>
	<li>Coloque el hemostat a ambos lados de la incisión y debajo del proceso de xifoide. Extienda el abdomen tirando de la cola hacia abajo y pegándola. Utilice el aplicador de punta de algodón estéril de 6 pulgadas para separar y exponer el bazo del tejido graso pancreático.</li>
	<li>Antes de la inyección en el bazo, vórtice las células cancerosas para evitar cualquier grumos celulares.</li>
	<li>Utilice una jeringa de insulina de 0,5 ml 28 G (0,36 mm x 13 mm) para inyección. Evite las burbujas de aire.</li>
	<li>Inyecte lentamente y cuidadosamente 100 s de células en la punta del bazo. Coloque una punta de algodón y agregue una presión suave para evitar el flujo de espalda en la región abdominal. Se puede observar una inyección exitosa identificando el cambio en el color del hígado durante la inyección.</li>
	<li>Humedezca una gasa estéril con 1pbS y colóquela sobre el área diseccionada.</li>
	<li>Transfiera los ratones a una almohadilla de calentamiento durante 15 minutos para permitir que las células cancerosas circulen dentro del sistema.</li>
	<li>Para proceder con la isquemia quirúrgica y la lesión por reperfusión, siga los pasos 5.3-5.10. NOTA: Este procedimiento consiste en estudiar el efecto del establecimiento inducido por I/R de focos metastásicos.</li>
</ol>4. Esplenectomía
<ol><li>Para realizar una esplenectomía, usa un dispositivo de cauterización portátil. Levante cuidadosamente el bazo con fórceps lisos y cauterice los vasos sanguíneos esplénicos para evitar el sangrado excesivo. Retire el bazo transectando los vasos en la sección cauterizada.</li>
	<li>Inmediatamente después del procedimiento, cierre la incisión en un patrón de doble capa suturando primero la capa muscular y luego la piel. Utilice suturas de polipropileno 4-0 tanto para la pared abdominal como para la piel.</li>
	<li>Antes de repetir el procedimiento sobre otro animal, desinfecte todos los instrumentos rociándolos con un 70% de isopropanol o insertándolos en un baño de cuentas.</li>
	<li>Coloque los ratones de nuevo en jaulas originales y busque signos de angustia y dolor postquirúrgico.</li>
	<li>Inyectar analgésico postoperatorio (Buprenorfina 0,1 mg/kg) cada 12 h durante 2 días para evitar el dolor postquirúrgico.</li>
</ol>5. Lesión por reperfusión de isquemia
<ol><li>A los 5 días de la primera laparotomía, los ratones anestesian mediante la administración de ketamina (150 mg/kg) y xilazina (12 mg/kg) utilizando una aguja de 1 ml de 25 G (0,5 mm x 16 mm). Siga los pasos 3.3–3.4.</li>
	<li>Solución de povidona-yodo (7,5%) en el abdomen afeitado del ratón para desinfectar la piel y realizar una laparotomía de línea media como se describe anteriormente en el paso 3.6.</li>
	<li>Usando dos puntas de algodón humedecidas, mueva suavemente el intestino de la cavidad para exponer las estructuras asociadas, incluyendo la vena porta. Diseccionar el hilum hepático libre del tejido circundante.</li>
	<li>Levante la mediana y los lóbulos laterales izquierdos contra el diafragma. Separe el lóbulo del cuadrante del lóbulo lateral izquierdo disección el hilum hepático con las tijeras de resorte utilizando un microscopio operativo para permitir una visibilidad clara hacia la estructura de la tríada del portal.</li>
	<li>Coloque un pequeño hisopo de algodón húmedo entre el lóbulo mediano y el lóbulo lateral derecho para crear suficiente espacio para la sujeción. Usando el fórceps dilatador del recipiente, pase cuidadosamente el hilo de 10 cm (sutura de polipropileno 4.0) para levantar la tríada del portal. Ocluir todas las estructuras de la tríada portal (arteria hepática, vena porta y conducto biliar) a la izquierda y media de los lóbulos hepáticos mediante la colocación de una abrazadera microvascular utilizando un aplicador de abrazadera microserrefine con bloqueo.</li>
	<li>Si los lóbulos no muestran un blanqueamiento significativo, reajuste la abrazadera quitando y volviendo a aplicar. NOTA: Si el blanqueamiento inmediato del hígado no se produce incluso después de reajustar la abrazadera, considere cuidadosamente si procede o no con la I/R.</li>
	<li>Retire el pequeño hisopo de algodón colocado entre los lóbulos laterales medianos y rectos. Reemplace suavemente el intestino en la cavidad abdominal. Cubra la pared abdominal con una gasa húmeda (remojada con 1x PBS) y cubra con una envoltura de plástico para minimizar la pérdida evaporativa.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre la almohadilla de calentamiento y aplique la abrazadera durante un período de 60 minutos.</li>
	<li>A lo largo del intervalo isquémico, busque evidencia de lesión por isquemia visualizando el blanqueamiento pálido de los lóbulos medios y laterales izquierdos.</li>
	<li>Inicie la reperfusión quitando las abrazaderas después del período de 60 minutos. NOTA: La evidencia de reperfusión se puede observar mediante un cambio de color inmediato de la mediana y los lóbulos laterales izquierdos.</li>
	<li>Inmediatamente después de la reperfusión, cierre la incisión con un patrón de sutura de doble capa suturando primero la capa muscular y luego la piel. Utilice la sutura de polipropileno 4-0 con la ayuda de un soporte de aguja para cerrar la pared abdominal y la piel.</li>
	<li>Antes de repetir el procedimiento sobre otro animal, desinfecte todos los instrumentos rociándolos con un 70% de isopropanol o insertándolos en un baño de cuentas calentado.</li>
	<li>Coloque los ratones de nuevo en jaulas originales y busque signos de angustia y dolor postquirúrgico.</li>
	<li>Inyectar analgésico postoperatorio (0,1 mg/kg de buprenorfina) cada 12 h durante 2 días para evitar el dolor postquirúrgico.</li>
	<li>Para ratones falsos de I/R del hígado, realice laparotomía, disección de hilum y suturas abdominales. NOTA: El papel del estrés quirúrgico que influye en el establecimiento de metástasis hepáticas se puede investigar a través de dos diseños experimentales diferentes. El protocolo anterior (Modelo-1) se utiliza para establecer la enfermedad hepática micrometastásica y estudiar el efecto de la I/R hepática en su crecimiento (Figura 1A). Alternativamente, la I/R hepática y la inyección tumoral se pueden realizar simultáneamente(Modelo-2) para estudiar el efecto de la lesión de I/R en el establecimiento de nuevos focos metastásicos (Figura1B). Para ello, inyectar células cancerosas en el bazo como se describió anteriormente y permitir que circulen durante 15 minutos. Realizar I/R hepática o cirugía falsa después del período circulante durante 60 min. Realizar esplenectomía lateral 60 min más tarde, y luego cerrar la incisión de laparotomía.</li>
</ol>6. Evaluación de ratones operados
<ol><li>Durante el procedimiento quirúrgico asegúrese de que los ratones están bajo la influencia de la anestesia en estadio III mediante la realización de pruebas de reflejo palpebraal y corneal. Se debe administrar dosis anestésica adicionales sobre los signos de los reflejos.</li>
	<li>Proporcionar analgésico postoperatorio (Buprenorfina 0,1mg/kg) justo después de la cirugía y cada 12h durante 2 días para evitar el dolor post quirúrgico.</li>
	<li>Permita a los ratones de 30 a 60 minutos de tiempo de recuperación de la anestesia. Monitoree constantemente a los ratones y no los deje desatendidos hasta la recuperación completa.</li>
	<li>Busque signos de angustia como espalda encorvada, ojos cerrados, movimiento lento y falta de cuidado. Tratar en consecuencia hasta que los ratones vuelvan a su actividad normal.</li>
	<li>Cuidado suplicante incluyendo líquidos, calor, Agente de inversión de yohimbina para la xilazina, ropa de cama de papel suave (para evitar la aspiración) debe proporcionarse después de la cirugía para mejorar el período de recuperación.</li>
</ol>7. Evaluación de la lesión por reperfusión de isquemia hepática
<ol><li>Inmediatamente después de aplicar la abrazadera, asegúrese de que el blanqueamiento pálido de la mediana y los lóbulos laterales izquierdos se produce en comparación con los lóbulos caudado saqueo y cuadrático.</li>
	<li>Evaluar la lesión por isquemia hepática midiendo los niveles de alanina transaminasa sérica (sALT), transaminasa de aspartato sérico (sAST) y lactato deshidrogenasa sérica (sLDH). La sangre se puede extraer de la vena facial para extraer suero 3-6 h después del inicio de la reperfusión. Realizar histología hepática para analizar el porcentaje de área tumoral dentro del lóbulo isquémico.</li>
</ol>

<ol><li>Riihimäki, M., Hemminki, A., Sundquist, J., Hemminki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+metastasis+in+colon+and+rectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Patterns of metastasis in colon and rectal cancer.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29765(2016).</li>
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<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (10), 484(2007).</li>
<li>Elkin, M., Vlodavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tail+vein+assay+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tail vein assay of cancer metastasis.</a> Current Protocols in Cell Biology. 19 (19.2), (2001).</li>
<li>Thalheimer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intraportal+injection+model%3A+A+practical+animal+model+for+hepatic+metastases+and+tumor+cell+dissemination+in+human+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The intraportal injection model: A practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer.</a> BMC Cancer. 9 (1), 29(2009).</li>
<li>Frampas, E., Maurel, C., Thedrez, P., Le Saëc, P. R. emaud-, Faivre-Chauvet, A., Barbet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intraportal+injection+model+for+liver+metastasis%3A+Advantages+of+associated+bioluminescence+to+assess+tumor+growth+and+influences+on+tumor+uptake+of+radiolabeled+anti-carcinoembryonic+antigen+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+Communications%22%5BJournal%5D)">The intraportal injection model for liver metastasis: Advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody.</a> Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).</li>
<li>Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portal+Vein+Injection+Model+to+Study+Liver+Metastasis+of+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Limani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+portal+vein+injection+for+the+design+of+syngeneic+models+of+liver+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), G682-G688 (2016).</li>
</ol>

Los autores no revelan conflictos de intereses relacionados con esta obra.

El modelo animal descrito en este manuscrito se basa en dos enfoques principales. La primera es reconocer la capacidad de las células cancerosas para localizar y proliferar en los lóbulos hepáticos. El segundo es estudiar el efecto de la lesión por reperfusión de isquemia hepática que influye en el crecimiento tumoral y las metástasis. Este modelo permite el estudio relevante de metástasis hepáticas en ausencia de metástasis secundarias en un ratón inmunocompetente. El modelo es útil para abordar las cuestiones de la efi...

El hígado es uno de los sitios más comunes para el desarrollo de la enfermedad metastásica1. La mortalidad es casi invariablemente atribuible a complicaciones asociadas con el crecimiento tumoral en el hígado. En pacientes con tumores sólidos metastásicos en el hígado, la cirugía sigue siendo una intervención crucial para el control de la enfermedad y un posible enfoque curativo. Sin embargo, la gran mayoría de los pacientes en última instancia presentan con enfermedad recurrente, predominantemente en el hígado2,3. Durante la cirugía hepática, el sangrado intraoperatorio es común, a menudo requiere transfusión de sangre y diferentes enfoques técnicos para el control del sangrado, incluidos los métodos de sujeción vascular. Sin embargo, tales medidas causan isquemia hepática/reperfusión (I/R) al tejido hepático. Los efectos adversos de I/R sobre la función hepatocelular han sido bien documentados. El insulto de I/R del hígado enciende cascadas inflamatorias durante la restauración del flujo sanguíneo a través de vías inflamatorias4. La lesión de I/R hepática no sólo contribuye a la insuficiencia hepática, sino que la evidencia actual también muestra que la lesión por I/R estimula la adhesión de las células tumorales, y promueve la incidencia de la formación de metástasis y el crecimiento de la enfermedad micrometastásica existente5. Hemos informado previamente que el estrés quirúrgico induce la activación de las células inmunitarias que no sólo ayuda en el crecimiento del tumor primario, sino que también facilita las metástasis mediante la captura de células cancerosas dentro de la circulación6.
Aquí describimos en detalle una técnica para establecer un modelo de tumor de ratón de metástasis hepática. En este modelo, también presentamos un método para inducir una lesión por reperfusión de isquemia hepática que actúa como sustituto del estrés quirúrgico presente clínicamente durante las hepatectomías. Los métodos combinados de inyección de cáncer e I/R hepática pueden interpretar con éxito el desarrollo de CRLM en pacientes que se han sometido a una resección tumoral primaria.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium Lonza</td><td></td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Lonza</td><td>900-108</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Stretomysin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>SH3023701</tr><tr><td>Tripsina</td><td>Hyclone</td><td>sh30042.02</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular 75cm</td><td>5 Células Star</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>15ml PP Tubos Cónicos</td><td>BioExcell</td><td>41021037</td><td></td></tr><tr><td>Tinte Azul Tripano</td><td>Giibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Gasa</td><td>Fisherbrand</td><td>1376152</td><td></td></tr><tr><td>Cautry</td><td>Bovie</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Pinza microvascular</td><td>Finescience tools</td><td>18055-03</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de pinza Micro-Serrefine con bloqueo</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-18056-14</td><td></td></tr><tr><td>Tijera de resorte</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-15021-15</td><td></td></tr><tr><td>Dilatador de vasos</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-00276-13</td><td></td></tr><tr><td>Fijador magnético Sistema de retracción</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-18200020</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Pinzas</td><td>de ciencia fina toosl</td><td>FST-11019-12</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Pinzas</td> de <td>ciencia fina toosl</td><td>FST-11018-12</td><td></td></tr><tr><td>4-0 sutura de polipropileno</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8826</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td>1443915</tr><tr><td>Clipper</td><td>Oster</td><td>559A</td><td></td></tr><tr><td>Povidona Solución de Yodo</td><td>Medline</td><td></td> Jeringa MDS093945 <td></td></tr><tr><td>1ml 25G</td><td>BD seguridad Glide</td><td>305903</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina 0,5 ml</td><td>BD Jeringas de insulina</td><td>32946</td><td></td></tr><tr><td>Algodón Aplicador Fisher</td><td>Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Quirúrgico Microscopio</td><td>Leica</td><td>LR92240</td><td></td></tr><tr><td>Mycoplasma Elisa Kit</td><td>Roche</td><td>11663925910</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Putney</td><td>#056344</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>NADA</td><td>#139-236</td><td></td></tr><tr><td>Tira ALT</td><td>Heska</td><td>15809554</td><td></td></tr><tr><td>Tira AST</td><td>Heska 15809542</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tira LDH</td><td>Heska 15809607</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelo murino de tumores hepáticos metastásicos en el escenario de la lesión por reperfusión de isquemia

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

La isquemia hepática y la lesión por reperfusión (I/R), un desafío clínico común, sigue siendo un proceso fisiopatológico inevitable que se ha demostrado que induce múltiples daños en los tejidos y órganos. A pesar de los recientes avances y enfoques terapéuticos, la morbilidad general ha permanecido insatisfactoria, especialmente en pacientes con anomalías parénquimas subyacentes. En el contexto del crecimiento agresivo del cáncer y la metástasis, se sospecha que la I/R quirúrgica es el promotor que regula la recurrencia tumoral. Este artículo tiene como objetivo describir un modelo murino clínicamente relevante de I/R hepática y metástasis hepática colorrectal. Al hacerlo, nuestro objetivo es ayudar a otros investigadores a establecer y perfeccionar este modelo para su práctica de investigación rutinaria para entender mejor los efectos de la I/R hepática en la promoción de metástasis hepáticas.

Todos los ratones de tipo salvaje (C57BL6) (n x 20) fueron sometidos al modelo de metástasis hepáticas utilizando el protocolo descrito anteriormente. Todos los ratones inyectados con o sin lesión por reperfusión de isquemia sobrevivieron hasta la fecha del sacrificio. El diagrama esquemático Figura 1A de un hígado inyectado por cáncer ilustra la sujeción de la tríada del portal (arteria hepática, vena porta y conducto biliar) que induce una isquémica hepática parcial (70%) insulto hacia la ...

Describimos en detalle un modelo de tumor de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal clínicamente relevante (CRLM) y la influencia de la reperfusión de isquemia hepática (I/R) en el crecimiento tumoral y la metástasis. Este modelo puede ayudar a entender mejor los mecanismos subyacentes promoción inducida por cirugía del crecimiento metastásico hepático.

Modelo murino de tumores hepáticos metastásicos en el escenario de la lesión por reperfusión de isquemia

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

La evidencia experimental y clínica muestra que la reperfusión de isquemia hepática puede aumentar la formación de focos metastásicos mediante la circulación de células cancerosas y el crecimiento de la enfermedad micrometastática. Este modelo murino reproducible permite el estudio pertinente tanto del establecimiento de metástasis como del crecimiento del tumor preexistente en el hígado. La cirugía hepática, el sangrado y el shock séptico están asociados con la reperfusión de isquemia hepática y pueden afectar el crecimiento de la enfermedad metastásica.Estas técnicas permiten el estudio de este fenómeno en un esfuerzo por diagnosticar y prevenir mejor el efecto perjudicial de la reperfusión de isquemia en el crecimiento tumoral en un entorno clínico. Después de confirmar una falta de respuesta a la pellizca del dedo del pie en un macho anestesado de ocho a 12 semanas de edad C57 negro 6 ratón, desinfectar la piel expuesta de la pared abdominal con un exfoliante povidona-yodo y utilizar fórceps dentados para levantar la piel. Usando un bisturí quirúrgico, haz una incisión de línea media en la piel y levanta el músculo abdominal y el peritoneo para facilitar la creación de una incisión de línea media de tres centímetros para exponer el contenido abdominal.Después de colocar un hemostat a ambos lados de la incisión y debajo del proceso de xifoide, tire y pegue la cola hacia abajo para extender el abdomen y use un aplicador de punta de algodón estéril de seis pulgadas para separar y exponer el bazo del tejido graso pancreático. A continuación, vórtice la suspensión de la célula cancerosa de interés para disociar cualquier grupo celular y cargar las células en una jeringa de insulina de 0,5 mililitros equipada con una aguja de calibre 28. Inyecte lentamente y cuidadosamente 100 microlitros de células en la punta del bazo, colocando una punta de algodón adyacente al lado de la punción de la aguja para absorber cualquier posible derrame tumoral en la cavidad peritoneal mientras agrega una presión suave para estabilizar el bazo durante la inyección.Una inyección exitosa será evidente por un cambio en el color del hígado. Cuando todas las células hayan sido entregadas, coloque un pedazo de gasa estéril empapada por PBS sobre el área diseccionada y coloque el ratón en una almohadilla de calentamiento durante 15 minutos para permitir que las células cancerosas circulen dentro del sistema. Para inducir una isquemia y una lesión por reperfusión, utilice dos puntas de algodón humedecido para mover suavemente el intestino de la cavidad para exponer la vena porta y coloque el ratón bajo un microscopio diseccionador.Levante la mediana y los lóbulos hepáticos laterales izquierdos contra el diafragma. Coloque un pequeño hisopo de algodón húmedo entre el lóbulo mediano y el lóbulo lateral derecho para crear suficiente espacio para sujetar y pasar cuidadosamente un vaso de fuerzas dilatadores detrás de la tríada del portal y, utilizando los fórceps dilatadores del vaso, utilice una pieza de 10 centímetros de sutura de polipropileno de 4-0 para pasar detrás y levantar la tríada del portal. Utilice un aplicador de abrazadera de micro-serifina con una cerradura para colocar una abrazadera microvascular a la izquierda y la mediana de los lóbulos hepáticos para ocluir todas las estructuras de la tríada del portal.Cuando se observe blanqueo, retire la sutura de polipropileno 4-0 y el pequeño hisopo de algodón y devuelva cuidadosamente el intestino a la cavidad abdominal. Cubra la pared abdominal con una nueva pieza de gasa empapada en PBS y cubra la gasa con una envoltura de plástico para minimizar la pérdida evaporativa. A continuación, vuelva a colocar el ratón en la almohadilla calefactora durante 60 minutos.A lo largo del intervalo isquémico, visualice el blanqueamiento pálido de los lóbulos medial, medial izquierdo y lateral derecho para confirmar la evidencia de la lesión de isquemia. Al final del período de lesión, retire la abrazadera. Para realizar una esplenectomía, levante cuidadosamente el bazo con fórceps lisos y utilice un dispositivo cautery de mano para cauterizar los vasos sanguíneos esplénicos para evitar el sangrado excesivo.Transecte los vasos en la sección cauterizada para eliminar el bazo e inmediatamente utilizar 4-0 suturas de polipropileno para cerrar las incisiones musculares y de la piel en un patrón de sutura de doble capa. A continuación, vuelva a colocar el ratón en su jaula de inicio con monitoreo hasta la recuperación completa. El estrés quirúrgico aumenta significativamente la cantidad de micrometastas preestablecidas dentro del hígado.Esta diferencia se observa incluso dos semanas después de la reperfusión de isquemia en comparación con los ratones no-isquemia reperfundidos. La reperfusión de isquemia hepática y la inyección de células tumorales pueden verse afectadas por la temperatura ambiente y la viabilidad celular, así que tenga cuidado de controlar estas variables. Esta técnica facilita el estudio de los efectos del estrés quirúrgico y la lesión hepática en el crecimiento de la enfermedad metastásica.Esto ayudará a los investigadores a comprender mejor el fenómeno del crecimiento tumoral inducido por la cirugía.

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Research

Investigación

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Cancer Research

Investigación del cáncer

En este artículo se describe un procedimiento para la inducción de tumores en el hígado ortotópico bioluminiscentes en ratones, y el posterior análisis del crecimiento del tumor confinado al hígado, con imágenes en directo toda la luminiscencia del cuerpo.

Murino hepática Bioluminiscente modelo tumoral

El trauma quirúrgico induce una respuesta inflamatoria. Las citocinas y los ligandos endógenos se sabe que modulan el tamaño del infarto de miocardio después de la isquemia y la reperfusión. Se presenta una versión modificada de tórax cerrado, el modelo murino de isquemia y reperfusión con pesas colgantes para minimizar los efectos de la toracotomía.

Un murino tórax cerrado modelo de isquemia y reperfusión miocárdica

Se describen modelos de lesión renal por isquemia-reperfusión inducida moderada y grave en la que los ratones se someten a pedículo renal unilateral de sujeción seguida de simultánea o en diferido nefrectomía contralateral, respectivamente. Estos modelos dan consistentemente lugar a la disfunción renal y la fibrosis después de la lesión, pero gravedad de la lesión y la supervivencia dependen de equipos de fondo, la edad y quirúrgicos ratón.

La isquemia-reperfusión modelo de lesión renal aguda y post lesión fibrosis en ratones

Se introduce un método quirúrgico para inducir experimental de isquemia / reperfusión (I / R) lesión para simular el infarto de miocardio (MI) en modelos de ratón que permite una mayor claridad en el posicionamiento de la ligadura en la arteria descendente anterior izquierda (LAD) para aumentar la reproducibilidad de experimentos en ratones MI.

Un modelo murino de isquemia-reperfusión miocárdica lesión a través de la ligadura de la arteria descendente anterior

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A preclínicos modelo murino de metástasis hepática

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A continuación se describe el procedimiento detallado de isquemia-reperfusión intestinal en ratones que produce lesiones reproducibles sin mortalidad para fomentar la estandarización de esta técnica a través del campo. Este modelo de lesión de isquemia-reperfusión intestinal puede ser utilizado para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la lesión y regeneración.

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