Name: Amputación y regeneración de dígitos de ratón adultos: un modelo simple para investigar la formación de Blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprende la amputación de falange distal en ratones adultos CD-1 para estudiar la formación de blastema y la osificación intramembranosa en mamíferos. Este modelo permite analizar poblaciones celulares críticas y mecanismos de regeneración endógena.

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Agradecemos a los miembros del Laboratorio Muneoka y del Instituto de Medicina Genómica de Texas (TIGM). Este trabajo fue apoyado por la Universidad Texas A&M.

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<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha%2FCXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li>
<li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BoneJ%3A+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un procedimiento estandarizado de amputación disal de P3 de ratón adulto, tinción inmunohistoquímica fluorescente para visualizar e investigar la formación de blastema y la osificación intramembranosa, y escaneo secuencial en vivoCT para identificar los cambios morfológicos, de volumen y longitud óseas después de la amputación. La amputación P3 es un modelo único, procedimentalmente simple y reproducible para analizar un entorno de heridas pro-regenerativo que desencadena la formación de blastema....

Los mamíferos, incluidos los humanos y los ratones, tienen la capacidad de regenerar las puntas de sus dígitos después de la amputación distal de la falange terminal (P3)1,2,3. En ratones, la respuesta de regeneración depende del nivel de amputación; las amputaciones de dígitos cada vez más proximales muestran una respuesta regenerativa progresivamente atenuada hasta que el fallo regenerativo completo en las amputaciones transectantes y proximal a la matriz de uñas P34,5,6 , 7 , 8. La regeneración P3 está mediada por la formación de un blastema, definido como unapoblación de células proliferantes que se someten a morfogénesis para regenerar las estructuras amputadas 9. La formación de un blastema para regenerar las estructuras perdidas por amputación, un proceso llamado regeneración epimórfica, distingue la respuesta de regeneración P3 a nivel multitejido de la reparación de tejido tradicional después de la lesión6, 10. La regeneración P3 es un modelo reproducible y procedimentalmente simple para investigar procesos regenerativos complejos, incluyendo la cicatrización de heridas11,12, histólisis ósea11,12, revascularización13, regeneración del nervio periférico14,y conversión blastemal a hueso a través de osificación intramembranosa15.
Estudios previos con inmunohistoquímica han demostrado que el blastema es heterogéneo, avascular, hipoxico y altamente proliferativo11,13,15,16. Después de la amputación distal de P3, el blastema temprano se asocia inicialmente con el periosteum P3 y el endosteum y se caracteriza por una proliferación robusta y osteogénesis naciente adyacente a la superficie ósea15. Después de la degradación ósea y el cierre de la herida, el blastema heterogéneo se forma por la fusión de células asociadas a periosteales y endosteales, seguido de la diferenciación de componentes blastemales, incluyendo hueso según la osificación intramembranosa 15.
La reparación ósea en respuesta a la lesión se produce típicamente por osificación endochondral, es decir, a través de un callo cartilageonoso inicial que forma una plantilla para la posterior formación ósea17,18. La osificación intramembranosa ósea larga, es decir, la formación ósea sin un intermedio cartilaginoso, se induce comúnmente utilizando dispositivos de distracción complejos o fijación quirúrgica19,20. La respuesta de regeneración de dígitos es un modelo preclínico que ofrece ventajas sobre los modelos convencionales de osificación intramembranosa: 1) no requiere fijación externa o interna después de una lesión para estimular la osificación intramembranosa, 2) es realizado utilizando 4 dígitos de cada animal, maximizando así las muestras y minimizando el uso de animales, y 3) el análisis secuencial de microcomputación in vivo (CT) se puede realizar con facilidad y velocidad.
En el presente estudio, mostramos el plano de amputación P3 estandarizado para lograr una respuesta de regeneración reproducible y robusta. Además, demostramos un protocolo optimizado de inmunohistoquímica de fluorescencia utilizando secciones de parafina para visualizar la formación de blastema, la revascularización en el contexto de la regeneración y la conversión blastemal a hueso a través de Osificación. También demostramos el uso de la c.CT secuencial para identificar los cambios en la morfología ósea, el volumen y la longitud en el mismo dígito en el transcurso de la regeneración. El objetivo de este protocolo es investigar la formación de blastema de mamíferos después de la amputación y demostrar 2 técnicas, inmunohistoquímica de fluorescencia y secuencial in vivo-CT, para el estudio de la regeneración ósea intramembranosa.

<table><tbody><tr><td>Protein Block Serum</td><td>Free DAKO</td><td>X0909</td><td>Listo para usar</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-PCNA de ratón</td><td>Abcam</td><td>ab29</td><td>dilución 1:2000</td></tr><tr><td>Rata anticuerpo anti-CXCR4</td><td>R& D Systems</td><td>MAB21651</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-humano vWF XIII</td><td>de conejo DAKO</td><td>A0082</td><td>Dilución 1:800</td></tr><tr><td>Anti-osterix de conejo, anticuerpo SP7</td><td>Abcam</td><td>ab22552</td><td>dilución 1:400</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Runx2 de conejo</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>HPA022040</td><td>dilución 1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 conjugada cabra anti-ratón IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td> dilución <td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugada cabra anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>dilución Alexa Fluor 568-cabra conjugada anti-rata IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>Reactivo</td> <td>antidecoloración Prolong GoldInvitrogen</td><td>P36930</td><td>Listo para usar</td></tr><tr><td>Surgipath Decalicificador 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800400</td><td>Listo para usar</td></tr><tr><td>Z-Fix, Fijador acuoso tamponado de formalina de zinc</td><td>Anatech LTD</td><td>174</td><td>Listo para usar</td></tr><tr><td>CD-1 Ratón Hembra</td><td>Envigo ICR</td><td>(CD-1)</td><td>8-12 semanas</td></tr><tr><td>vivaCT 40</td><td>SCANCO Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

amputación y regeneración de dígitos de ratón adultos: un modelo simple para investigar la formación de blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Aquí, presentamos un protocolo de amputación de falange terminal distal de ratón adulto (P3), un modelo de regeneración epimórfica de mamíferos procedimentalmente simple y reproducible, que implica la formación de blastema y la osificación intrammal inmunohistoquímica de fluorescencia y microtomografía microcomputada secuencial en vivo (CT). La regeneración de mamíferos se limita a las amputaciones que transectan la región distal de la falange terminal (P3); dígitos amputados a niveles más proximales no se regeneran y se someten a curación fibrosa y formación de cicatrices. La respuesta de regeneración está mediada por la formación de un blastema proliferativo, seguido de la regeneración ósea a través de la osificación intramembranosa para restaurar la longitud esquelética amputada. La amputación P3 es un modelo preclínico para investigar la regeneración epimórfica en mamíferos, y es una poderosa herramienta para el diseño de estrategias terapéuticas para reemplazar la curación fibrosa con una respuesta regenerativa exitosa. Nuestro protocolo utiliza inmunohistoquímica de fluorescencia a 1) identificar poblaciones de células blastema tempranas y tardías, 2) estudiar la revascularización en el contexto de la regeneración, y 3) investigar la osificación intramembranosa sin necesidad de hueso complejo dispositivos de estabilización. También demostramos el uso de imágenes secuenciales in vivo-CT para crear imágenes de alta resolución para examinar los cambios morfológicos después de la amputación, así como cuantificar los cambios de volumen y longitud en el mismo dígito en el transcurso de la regeneración. Creemos que este protocolo ofrece una enorme utilidad para investigar las respuestas regenerativas tanto epimórficas como tisulares en mamíferos.

Ratón adulto que regenera los dígitos P3 a 6/7 DPA (Figura2A-D), 9 DPA (Figura2E-H)y 10 DPA (Figura2I-L) fueron inmunomanchados con anticuerpos a Runx2, OSX y PCNA para visualizar hueso intrammalembranous regeneración e inmunostecadas con anticuerpos contra CXCR4 y vWF para visualizar la formación de blastema. Las representaciones representativas de los dígitos escaneados antes de l...

Aquí, presentamos un protocolo de amputación de falange terminal de ratón adulto para investigar la formación de blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa, analizada por inmunohistoquímica fluorescente y tomografía microcomputada secuencial in vivo.

Amputación y regeneración de dígitos de ratón adultos: un modelo simple para investigar la formación de Blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

La amputación P3 es un modelo preclínico para investigar la regeneración epimórfica de los mamíferos y una poderosa herramienta para identificar poblaciones y mecanismos celulares críticos que controlan la regeneración endógena. El modelo P3 permite la identificación de poblaciones de células blastémicas tempranas y tardías, el estudio de la revascularización durante la regeneración y la investigación de la osificación intramembranosa sin requisitos complejos de dispositivos de estabilización ósea. Demostrando el procedimiento conmigo serán Osama Qureshi, Alyssa Falck, y Katherine Zimmel, técnica, y Regina Brunaeur, una profesora asistente de investigación, todas de nuestro laboratorio.Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un ratón CD-1 de ocho a 12 semanas de edad, Aplique ung ón en los ojos del animal y coloque el ratón debajo de un microscopio de disección 10X. Utilice yodo povidona quirúrgico y 70%etanol para esterilizar los dígitos de cada extremidad posterior y utilizar microscisores para recortar el cabello lejos del sitio quirúrgico. Aplicar un microlitro de bupivacaína tópica localmente para anestesiar el sitio quirúrgico, y suavemente tocar una pata trasera para exponer la superficie del dígito medial.A continuación, sosteniendo el bisturí en un ángulo paralelo a la almohadilla de grasa, utilice un bisturí estéril número 10 para amputar la punta distal de la falange terminal de los dígitos dos y cuatro. Aplicar un microlitro adicional de bupivacaína localmente a cada dígito amputado y devolver el ratón a una jaula limpia para permitir que las heridas sanen sin vendaje de la herida y con monitoreo hasta la recumbencia completa. Para asegurar un plano de amputación P3 exitoso, sostenga el bisturí paralelo a la almohadilla de grasa durante la amputación y realice la exploración de micro-CT para confirmar la longitud de amputación correcta.En el punto final experimental adecuado, utilice un bisturí para cortar el dígito a mitad de camino a través del hueso de la falange media aproximadamente en la segunda sangría de la almohadilla de grasa ventral. Transfiera el tejido a un vial de centelleo de 20 mililitros que contenga 10 mililitros de fijador de formalina de zinc con tamponado fresco durante 24 a 48 horas. Y utilizar un microtomo para adquirir secciones de cuatro a cinco micrómetros de espesor de cada dígito, colocando las rodajas en un baño de agua de 38 a 41 grados Celsius complementado con una solución adhesiva histológica a medida que se obtienen.A continuación, capture las rodajas en las diapositivas adhesivas y coloque las diapositivas en un calentador de diapositivas Celsius de 37 grados para secar. Cuando los portaobjetos se hayan desparafinado, sumerja las muestras en un frasco de tinción de una solución de recuperación de antígeno adecuada, y caliente los portaobjetos a 95 grados centígrados durante 25 minutos asegurándose de que no se produzca la ebullición. Al final de la incubación, deje que el frasco llegue a temperatura ambiente, y poner los portaobjetos planos en una caja deslizante de plástico cubierta profunda de una pulgada con papel tisú humedecido en la base.Añadir 100 microlitros de proteinasa precalentada K a cada muestra. Cubra cada diapositiva con una pequeña tira de parafilm para asegurarse de que las secciones no se sequen. Después de 12 minutos a 37 grados centígrados, retire cuidadosamente la película de parafina y drene suavemente las diapositivas en papel tisú para eliminar el exceso de solución de bloqueo.A continuación, añada entre 100 y 200 microlitros de la solución primaria de anticuerpos de interés para cada diapositiva. Devolver los sitios a la cámara humidificadora cubierta con película de parafina para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, después de lavar los portaobjetos en solución salina tamponada TRIS, además de TWEEN o TBST, etiqueta los portaobjetos con una solución de anticuerpos secundaria adecuada para una incubación de 45 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz.Al final de la incubación, lave los portaobjetos en TBST y dérelos secar. A continuación, utilice 100 microlitros de medios de montaje anti-fade para colocar cuidadosamente los cubreobjetos en los portaobjetos secos y almacene los portaobjetos planos a temperatura ambiente durante la noche protegidos de la luz para permitir que el medio de montaje se seque. Para la tomografía microcalculada in vivo secuencial o micro-CT equipar el micro-CT imager con tubo para permitir el flujo de oxígeno dentro y fuera de la cámara animal micro-CT, asegurándose de que el oxígeno saliente está equipado con un filtro de carbón activado para atrapar el isoflurano.Establezca el Voxelsize en 10,5 micrómetros en 55 kilovoltaje pico y 145 microamperios con 1.000 proyecciones por 180 grados y rotación continua con un tiempo de integración de 200 milisegundos, lo que resulta en un máximo de 213 cortes por escaneo. Cuando el escáner esté listo, coloque suavemente el ratón anestesiado en la cámara animal micro-CT con los dígitos de las extremidades posteriores dispuestos en el lado ventral plano y de estrecha asociación hacia arriba con la pata izquierda en el lado izquierdo y la derecha en el lado derecho de la plataforma de escaneo. A continuación, aplique cinta quirúrgica para fijar suavemente los dígitos en su lugar.Aplique pomada oftálmica a los ojos del animal antes de iniciar la exploración. Después de escanear, regrese el animal a una jaula limpia con monitoreo hasta la recumbencia completa, y permita hasta varias horas para la reconstrucción de la imagen de micro-CT. Para el análisis de la imagen ósea 3D reconstruida, utilizando el software proporcionado con el micro-CT, convierta los archivos de imagen en una serie de archivos DICOM.Cuando todos los archivos se hayan convertido, descargue la serie DICOM en una sola carpeta utilizando un descargador de archivos por lotes en un navegador web. Cargue el complemento BoneJ en la carpeta del complemento ImageJ. Arrastre y suelte la carpeta de la serie de archivos DICOM en la barra ImageJ para abrir los archivos.Se abrirá una pila de imágenes de 16 bits que muestra todos los valores grises. Para mostrar solo el hueso, haga clic en Ajuste de imagen y Umbral. Deslice la barra de umbral superior hacia el extremo derecho y ajuste la barra de umbral inferior hasta que solo el hueso se resalte en rojo.El valor de umbral inferior será de aproximadamente 10.000 a 13.000 a una intensidad máxima de la señal de 32.767. Haga clic en Aplicar y, en el nuevo cuadro de diálogo, haga clic en Fondo negro. A continuación, haga clic en Aceptar. Se generará una imagen de ocho bits que muestre valores en blanco y negro.Con el blanco correspondiente al hueso. Dibuja un rectángulo alrededor del hueso P3 para seleccionarlo y duplicar la pila. Para generar una imagen 3D, haga clic en Plugins y Visor 3D y utilice la herramienta de selección a mano alzada para rodear el hueso que se va a eliminar.A continuación, haga clic con el botón derecho y seleccione Rellenar selección para recortar cualquier hueso innecesario de la imagen. Para cuantificar el volumen óseo de la representación 3D, abra el complemento BoneJ y seleccione Fracción de volumen. Aparecerá una ventana de resultados y el volumen óseo mostrado en milímetros en cubos.Para cuantificar la longitud ósea de la representación 3D, utilice la herramienta multipunto ImageJ. Para capturar una imagen de la representación 3D, haga clic en Ver y tome una instantánea. A continuación, guarde la imagen como un archivo TIF o JPEG.En estas imágenes, las secciones de un dígito P3 regenerador de ratón adulto fueron inmunosuradas con anticuerpos para visualizar la regeneración ósea intramembranosa y la formación de blastema en los días seis a siete, nueve y 10 post-amputación. Aquí, se muestran representaciones representativas de micro-CT de dígitos escaneados antes de la amputación y en varios momentos a lo largo de la regeneración con puntos de referencia utilizados para identificar las mediciones de longitud. El modelo de dígitos del ratón es un potente sistema para analizar un entorno de herida pro-regenerativa que desencadena la formación de blastema cuando se amputa a un nivel distal.Por el contrario, la amputación proximal de los dígitos sirve como un sistema modelo para investigar fallas regenerativas, así como un sitio para probar estrategias para mejorar la regeneración.

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Research

Investigación

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Aunque los modelos de ratón son herramientas invaluables para la ingeniería de tejidos óseos, los modelos de defectos de huesos largos son escasos. Esta necesidad motivó el desarrollo del presente protocolo, que utiliza una placa de bloqueo con cuatro tornillos y una plantilla específica para realizar y estabilizar un defecto femoral, reproducible, de tamaño crítico y de baja morbilidad.

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Este artículo describe cómo realizar un método quirúrgico para inhibir la formación de epidermis de la herida durante la regeneración de las extremidades del ajolote mediante la sutura inmediata de piel de espesor completo sobre el plano de amputación. Este método permite a los investigadores investigar las funciones funcionales de la epidermis de la herida durante las primeras etapas de la regeneración de las extremidades.

Inhibición de la formación de la epidermis de la herida a través de la cirugía de colgajo cutáneo completo durante la regeneración de las extremidades del ajolote

Este protocolo describe un procedimiento quirúrgico para el establecimiento de una fractura diafisaria en el fémur de ratones, que se estabiliza con un alambre intramedular, para estudios de cicatrización de fracturas.

Establecimiento de un modelo de fractura de fémur diafisario en ratones

Este protocolo muestra detalles paso a paso de cómo extraer el primer molar mandibular en el ratón. Proporciona un método alternativo para los investigadores que se centran en la curación y regeneración de la mandíbula.

El establecimiento de un modelo de curación del alvéolo de extracción molar mandibular murina

Se presenta un protocolo para la cirugía de osteotomía femoral con el uso de la fijación interna de la placa en ajolotes maduros. El procedimiento se puede utilizar para realizar estudios comparativos sobre la regeneración de extremidades y la curación de fracturas en anfibios acuáticos.

Estabilización de una osteotomía de fémur con fijación en placa en Ambystoma mexicanum

En este protocolo, mostramos cómo preparar tejido de ajolote para microscopía de fuerza atómica (AFM) y realizar mediciones de indentación en cartílago de extremidades intacto y en regeneración.

Mediciones de microscopía de fuerza atómica de cartílago en extremidades de ajolote intactas y en regeneración

El modelo de lesión de la médula ósea murina es una herramienta útil para estudiar la osteogénesis postnatal a través de la osificación intramembranosa. Este protocolo quirúrgico simplificado describe el procedimiento de ablación de la médula ósea para la evaluación posterior de la formación de hueso nuevo y las respuestas celulares después de una lesión.

Metodología mejorada para el estudio de la osteogénesis postnatal mediante osificación intramembranosa en un modelo de lesión de médula ósea murina

El objetivo de este estudio fue estandarizar un enfoque quirúrgico seguro y reproducible para realizar una amputación transversa completa de la mandíbula en Ambystoma mexicanum para el estudio de la regeneración del tejido craneofacial.

Diseño y estandarización de un modelo de lesión mandibular para el estudio de la regeneración del tejido craneofacial en el modelo Ambystoma mexicanum

Aprende la amputación de falange distal en ratones adultos CD-1 para estudiar la formación de blastema y la osificación intramembranosa en mamíferos. Este modelo permite analizar poblaciones celulares críticas y mecanismos de regeneración endógena.

Amputación y regeneración de dígitos de ratón adultos: un modelo simple para investigar la formación de Blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa (Video) | JoVE Journal

Amputación y regeneración de dígitos de ratón adultos: un modelo simple para investigar la formación de Blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa

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