Mitocondrias y endoplasmática retícula imagen por microscopía electrónica de luz y volumen correlativa
20 de julio de 2019
Presentamos un protocolo para estudiar la distribución de mitocondrias y retículo endoplasmático en células enteras después de la modificación genética utilizando microscopía electrónica correlativa de luz y volumen incluyendo ascorbato peroxidasa 2 y tinción de peroxidasa de rábano picante, seccionamiento en serie de células con y sin el gen objetivo en la misma sección, y la toma de imágenes en serie a través de microscopía electrónica.
Esta técnica de microscopía electrónica de volumen se utiliza para realizar estudios biológicos que requieren la observación de una estructura 3D. Ofreciendo una varilla, una vista de jardinero y un almacenamiento de muestras antes de que se vuelva a tomar la imagen. Fx2 Asan diseñó las etapas de ruta que catalizan la deabilización para aumentar la prueba de electrones de las estructuras objetivo y se puede utilizar para localizar un objetivo específico de interés.
Estas partículas combinan el uso de luz correlativa y la técnica de microscopía electrónica 3D para investigar las interacciones entre los orgánulos membranos y las células huésped. 16 a 24 horas después de la transfección, lave suavemente el cultivo con 250 microlitros de 30 a 37 grados de solución de fijación Celsius. Reemplazando rápidamente el lavado con 1,5 mililitros de solución de fijación fresca y colocando el cultivo en hielo durante 30 minutos.
Al final de la incubación, enjuague las células con tres lavados de diez minutos en un mililitro de tampón de cacodilato de sodio molar 0,1 molar helado por lavado. Después del último lavado, agregue un mililitro de solución de glicina milimétrica de 0 a 4 grados Celsius 20 para una incubación de diez minutos sobre hielo seguida de tres lavados de cinco minutos con un mililitro de tampón de cacodilato de sodio molar fresco y frío por lavado. A continuación, etiquete las células con 500 microlitros de solución DAB recién preparada.
E incubar las células en hielo durante aproximadamente cinco a cuarenta y cinco minutos. Cuando una mancha marrón claro sea visible bajo un microscopio de luz invertido, enjuague las células tres veces con un mililitro de tampón de cacodilato de sodio frío y fresco durante diez minutos por lavado. A continuación, utilice un microscopio invertido de contraste de fase para visualizar la tinción DAB a un aumento de 100 veces o superior y marque la parte inferior del vidrio donde se encuentra la región de interés.
Para la preparación de muestras de bloques de microscopio electrónico, primero después de fijar las células con un mililitro de tetróxido de 2% reducido de tetróxido de osmio reducido durante una hora a cuatro grados centígrados. Al final de la fijación, enjuague las células con tres lavados de cinco minutos y un mililitro de agua destilada fresca por lavado. Antes de tratar las células con un mililitro de solución TCH filtrada durante 20 minutos.
Al final de la incubación, lavar las células tres veces en agua destilada como se acaba de demostrar y fijar las células con una incubación de 30 minutos en 2% reducido tetróxido de osmio. Al final de la segunda fijación, lavar las células tres veces con agua destilada y cubrir el cultivo con un mililitro de acetato de 1% de uranilo acuoso durante la noche a 4 grados celsius protegido de la luz. A la mañana siguiente, lave las células tres veces con agua destilada antes de mancharse con un mililitro de 60 grados Celsius calentó la solución de aspartato de plomo de Walton durante 30 minutos en un horno de 60 grados centígrados.
Al final de la incubación, lave las células tres veces en agua destilada. E incubar el cultivo en una serie calificada de alícuotas de etanol de 20 minutos y 2 mililitros. Después de la última exposición al 100% del etanol, incubar las células durante 30 minutos en un mililitro de tres a un etanol a baja viscosidad incrustando mezcla media a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, sustituya el medio por un mililitro de etanol de uno a uno a un medio de mezcla de inserción de baja viscosidad para otra incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, reemplace el medio por un fresador de uno a tres etanol a medio de mezcla de baja viscosidad durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente. A continuación, reemplace el medio con un mililitro de medio de incrustación de viscosidad 100% baja durante la noche, seguido de la incrustación de la muestra en una mezcla 100% de baja viscosidad incorporada durante 24 horas a 60 grados centígrados.
Para el análisis de microscopía electrónica de transmisión, al día siguiente, utilice un microtoma ultra para obtener secciones de 90 nanómetros de espesor y observar la red bajo microscopía electrónica de transmisión a 200 kilovoltas. Antes de comenzar la preparación de la muestra, limpie los cubreobjetos de vidrio recubierto de óxido de estaño de indio con agitación suave en isopropanol durante 30 a 60 segundos. Al final de la agitación, drenar el exceso de alcohol y colocar los cubreobjetos en un ambiente libre de polvo.
Cuando los cubreobjetos estén secos, utilice una recubridora de plasma para que los cubren los cubreobjetos descarte durante un minuto. A continuación, inserte los cubreobjetos en el soporte del sustrato y coloque el soporte de sustrato en el bote de cuchillo. Para obtener muestras para la microscopía electrónica de barrido, inserte el bloque de muestra incrustado en el soporte de muestra del ultramicrotoma.
Y coloca el soporte en el bloque de recorte. Utilice una cuchilla de afeitar para recortar el exceso de resina alrededor de la posición objetivo de modo que la cara del bloque adquiera una forma trapezoidal o rectangular. Los bordes inicial y final deben ser estrictamente paralelos entre sí.
No es fácil adquirir un gran número de secciones de serie. Sin embargo, debe tener los bordes delanteros y los bordes finales completamente paralelos. A continuación, inserte el soporte de la muestra en el brazo del ultramicrotoma.
Coloque el cuchillo de diamante en el portacuchillas y llene el bote de cuchillos con agua destilada filtrada. A continuación, empuje cuidadosamente la manija del soporte para ajustar la posición del soporte de modo que el borde de los cubreobjetos esté cerca del cuchillo. Después de obtener la muestra, detenga el proceso de seccionamiento, abra lentamente el tornillo de sujeción del tubo y drene el bote de agua.
Una vez completado el proceso de recogida de la cinta, retire el sustrato con el mango del dispositivo de sujeción y seque la cinta. El uso de plásmidos genéticamente etiquetados que expresan proteínas de interés, permite la identificación de las células diana trans infectadas después de la tinción de las proteínas etiquetadas. La microscopía electrónica de luz correlativa se puede utilizar para visualizar aún más el cultivo celular etiquetado.
Por ejemplo, la mancha oscura generada por SCO1-APEX2 se observa exclusivamente en el espacio intermembrano mitocondrial y no en el espacio de matriz de las mitocondrias. Los plásmidos transfónicos de código con plásmidos SCO1-APEX2 y HRP-KDEL expresan una señal de electrones altamente densa en el espacio intermembrano mitocondrial y el retículo endoplasmático. Sin embargo, no se observa ninguna tinción de retículo endoplasmático en las células que están transfectadas con SCO1-APEX2 solamente.
Para imágenes en serie mediante microscopía electrónica de barrido, se crea una visión general de toda la imagen de la matriz utilizando un detector de electrones de retro-retroactiva sobre un área grande. A continuación, la región de interés se coloca en la primera sección y se propaga a todas las demás secciones. Por último, la región de interés que contiene cinco celdas de destino se realiza una imagen de cinco píxeles con imágenes de nanómetro.
La ampliación revela estructuras subcelulares detalladas como el aparato Golgi, las mitocondrias y el retículo endpolasmático. Las imágenes en serie revelan claramente que los contactos de retículo-mitocondria endoplasmáticos se producen en diferentes planos z. Usted debe tener una buena comprensión de cómo localizar una estructura objetivo específica utilizando luz correlativa y microscopía electrónica para investigar los efectos de una modificación de identidad específica.
Estas técnicas de tinción combinadas con la microscopía electrónica de volumen podrían utilizarse para EM a mayor escala para investigar las interacciones celulares, especialmente en el eurovirus. Recuerde que el glutaraldehído, también el enteterocida y el TCH son muy tóxicos, así que asegúrese de usar ropa protectora y trabajar en una campana de humo cuando utilice estos materiales.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para estudiar la distribución de mitocondrias y retículo endoplasmático en células completas tras una modificación genética. Utiliza técnicas de microscopía electrónica de volumen y de luz correlativas para analizar las estructuras celulares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Neurociencia
- Técnicas de Microscopía
Antecedentes
- Las mitocondrias y el retículo endoplasmático son orgánulos cruciales en la función celular.
- Comprender su distribución puede proporcionar información sobre los procesos celulares.
- La microscopía correlativa permite un análisis estructural detallado.
- Las modificaciones genéticas pueden alterar la distribución y la función de los orgánulos.
Objetivo del estudio
- Investigar la distribución espacial de los orgánulos tras la modificación genética.
- Utilizar técnicas avanzadas de imagen para una visualización mejorada.
- Comparar los efectos de las modificaciones genéticas en la posición de los orgánulos.
Métodos Utilizados
- Microscopía de luz correlativa para la imagen inicial.
- Microscopía electrónica de volumen para el análisis estructural detallado.
- Técnicas de tinción con peroxidasa de ascorbato 2 y peroxidasa de rábano picante.
- Seccionado en serie de células para capturar datos completos.
Resultados principales
- Mapeo detallado de la distribución de mitocondrias y retículo endoplasmático.
- Identificación de diferencias en la posición de orgánulos entre células modificadas y no modificadas.
- Información sobre las interacciones entre orgánulos y estructuras celulares.
- Validación de técnicas de imagen para estudios futuros.
Conclusiones
- El protocolo revela de manera efectiva los cambios en la distribución de orgánulos debido a modificaciones genéticas.
- La microscopía correlativa proporciona una herramienta potente para el análisis celular.
- Los hallazgos contribuyen al entendimiento de la dinámica de los orgánulos en las células.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía correlativa de luz y volumen electrónico permite la visualización tridimensional de alta resolución de redes de orgánulos membranosos, abordando una brecha crítica en biología estructural para la validación de objetivos. Este enfoque facilita la reducción de riesgos mecanicistas al revelar interacciones subcelulares que influyen en la localización de proteínas y en la función de los orgánulos, aspectos clave en las fases iniciales del descubrimiento. El método mejora la confianza predictiva en los cribados fenotípicos al proporcionar un contexto a escala nanométrica para perturbaciones genéticas o farmacológicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los sitios de contacto entre mitocondrias y retículo endoplasmático como centros funcionales en las vías de estrés y señalización celular.
- Valor operativo: Proporciona una visualización directa de la morfología de los orgánulos y sus relaciones espaciales tras una perturbación genética o química.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos en dianas al confirmar la localización subcelular esperada de proteínas marcadas, como SCO1-APEX2 en el espacio intermembranal.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera datos ultraestructurales cuantitativos tridimensionales que pueden servir como referencia para la reproducibilidad del ensayo en cribados enfocados en orgánulos.
- Valor operativo: Permite la preparación estandarizada de muestras y flujos de trabajo de imagen compatibles con tomografía en matriz y seccionado en serie.
- Preparación para ensayos: Facilita la correlación entre las señales de microscopía óptica y los patrones de tinción electrondensos para la verificación de dianas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Traduccional: Relaciona modificaciones genéticas con cambios medibles en la arquitectura de orgánulos, apoyando la traducción del fenotipo al mecanismo.
- Reducción de Riesgos Mecánicos: Revela contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en planos z, informando modelos de señalización de calcio y transferencia de lípidos relevantes para modelos de enfermedades.
- Relevancia del Modelo Preclínico: Aplicable a sistemas relevantes para enfermedades en los que la dinámica de orgánulos contribuye a mecanismos fisiopatológicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el flujo de trabajo de descubrimiento desde la validación inicial del blanco hasta el seguimiento mecanicista, proporcionando un contexto estructural que complementa los ensayos funcionales y apoya las decisiones de continuar o descartar basadas en la fidelidad fenotípica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la visualización de si las modificaciones genéticas producen los cambios esperados en la arquitectura de los orgánulos y en los contactos entre orgánulos.
- Selección: Permite generar lecturas estructurales reproducibles y de alto contenido para validar resultados positivos en ensayos fenotípicos centrados en orgánulos.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas tridimensionales de la morfología de los orgánulos, la frecuencia de contactos y la distribución espacial, para realizar análisis comparativos entre diferentes condiciones.
- Investigación Traductiva: Conecta las perturbaciones moleculares con sus consecuencias estructurales, ayudando a interpretar la actividad de biomarcadores o vías en modelos de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada y escalable para el análisis ultraestructural que puede aplicarse en múltiples proyectos y clases de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco al reducir la ambigüedad en los datos de localización subcelular e interacciones de orgánulos.
- Valor operativo: Proporciona imágenes tridimensionales reproducibles con resolución a escala nanométrica mediante protocolos estandarizados de fijación, tinción y corte.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones en la identificación de compuestos líderes al ofrecer información mecanicista sobre el efecto de un compuesto o genético en la arquitectura celular.
- Impacto en la cartera: Permite una priorización ajustada al riesgo al confirmar si los fenotipos observados coinciden con los cambios estructurales esperados en sistemas relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía correlativa, preparación de muestras para microscopía electrónica y estrategias de marcado genético.
- Depende del acceso a instrumentación de microscopía electrónica de volumen, ultramicrótomos y reactivos de tinción como DAB, tetróxido de osmio y acetato de uranilo.
- Necesita estandarización entre equipos de microscopía, biología molecular e histología para un manejo de muestras y una interpretación de datos consistentes.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el protocolo a diferentes tipos celulares o condiciones de fijación, particularmente en relación con la permeabilidad y la eficiencia de tinción.
- Está limitado por la complejidad técnica y el tiempo requerido para la sección seriada y el alineamiento de imágenes, lo que puede restringir el rendimiento en campañas de cribado a gran escala.
