Name: Ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprende a cuantificar interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri mediante un ensayo de incubación de monedas. Este protocolo utiliza plásmidos con resistencia a antibióticos y proteínas fluorescentes para diferenciar cepas.

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Nos gustaría agradecer a los revisores por sus comentarios útiles. A.N.S. fue apoyado por la Fundación Gordon y Betty Moore a través de Grant GBMF 255.03 a la Fundación de Investigación en Ciencias de la Vida.

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<li>Ishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathoadaptive+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+O1+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains.</a> Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).</li>
<li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).</li>
<li>Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).</li>
<li>Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+system+of+Vibrio+cholerae+fosters+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer.</a> Science. 347 (6217), 63-67 (2015).</li>
<li>Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Vibrio+cholerae+to+low-temperature+shift%3A+CpsV+regulates+type+VI+secretion%2C+biofilm+formation%2C+and+association+with+zooplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+fluvialis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis.</a> Frontiers in microbiology. 8, 528(2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo de incubación de monedas descrito anteriormente proporciona un método potente para descubrir la competencia interbacteriana. Este enfoque permitió la identificación de la competencia intraespecífica entre los aislados v. fischeri y la caracterización del mecanismo competitivo19. Aunque el método descrito fue optimizado para la bacteria marina V. fischeri, se puede modificar fácilmente para adaptarse a otras especies bacterianas, incluyendo aislados clínicos y ambientale...

Este manuscrito describe un método basado en el cultivo para determinar si dos aislados bacterianos son capaces de interacciones competitivas. Al estudiar poblaciones mixtas, es importante evaluar en qué medida interactúan los aislados bacterianos, particularmente si los aislados compiten directamente a través de mecanismos de interferencia. La competencia de interferenciase se refiere a las interacciones en las que una población inhibe directamente el crecimiento o mata a una población competidora1. Estas interacciones son importantes de identificar porque pueden tener efectos profundos en la estructura y funcióndeuna comunidad microbiana 2,3.
Se han descubierto ampliamente mecanismos para la competencia microbiana en genomas de bacterias de diversos entornos, incluidas las bacterias asociadas al huésped y las bacterias de vida libre4,5,6,7, 8,9. Se han descrito una variedad de estrategias de competencia10,11 incluyendo mecanismos difusibles, tales como productos químicos bactericidas1,12 y péptidos antimicrobianos secretados13 , así como mecanismos dependientes del contacto que requieren contacto de células celulares para transferir un efector inhibitorio a las células diana9,14,15,16,17 ,18.
Aunque las coincubadoras basadas en el cultivo se utilizan comúnmente en microbiología5,8,19, este manuscrito describe cómo utilizar el ensayo para caracterizar el mecanismo de competencia, así como sugerencias para adaptarse el protocolo para su uso con otras especies bacterianas. Además, este método describe múltiples enfoques para analizar y presentar los datos para responder a diferentes preguntas sobre la naturaleza de las interacciones competitivas. Aunque las técnicas descritas aquí se utilizaron anteriormente para identificar el mecanismo de matanza interbacteriana subyacente a la competencia intraespecífica entre cepas simbióticas de bacterias vibrio fischeri coaisladas19,son adecuadas para muchas especies bacterianas, incluidos los aislados ambientales y los patógenos humanos, y pueden utilizarse para evaluar los mecanismos competitivos difusibles y dependientes del contacto. Los pasos en el protocolo pueden requerir optimización para otras especies bacterianas. Dado que más sistemas modelo están ampliando sus estudios más allá del uso de organismos isogénicos para incluir diferentes genotipos10,16,20,21, este método será un recurso valioso para los investigadores que buscan entender cómo la competencia afecta a los sistemas multi-strain o multi-especie.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>multicanal</tr><tr><td>100 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>multicanal</tr><tr><td>300 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>multicanal</tr><tr><td>10 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>monocanal</tr><tr><td>20 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>monocanal</tr><tr><td>200 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>monocanal</tr><tr><td>1.000 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>monocanal</tr><tr><td>placas de 24 pocillos</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>estéril con tapa</td></tr><tr><td>placas de 96 pocillos</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>estéril con tapa</td></tr><tr><td>Calculadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>stock (20 mg/mL en etanol); concentración final en medios (2 &mu; g/mL LBS)</td></tr><tr><td>Microscopio de disección de fluorescencia con cámara y software</td><td></td><td></td><td></td>de imagen</tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fisher</td><td>08-880</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td>caldo (100 mg/mL en agua, esterilizante por filtro); concentración final en medios (1 &mu; g/mL LBS)</td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa (FS MCE, 25MM, NS)</td><td>Fisher</td><td>SA1J788H5</td><td>0.22 &mu; membrana de nitrocelulosa (paquete de 100)Placas de</td></tr> <tr><td>Petri</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>estéril con tapa</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Semi-micro cubetas</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 0.1-10 &mu; L sistema de arranque</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3500</td><td>10 bastidores</td></tr><tr><td>TipOne 200 &mu; L sistema de arranque</td><td>USA Scientific</td><td>1111-500</td><td>10 bastidores</td></tr><tr><td>TipOne 1000 &mu; Sistema de arranque L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2520</td><td>10 bastidores</td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>LBS media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Tampón Tris (pH ~7.5)</td><td></td><td></td><td>50 mL 1 M de tampón de caldo (62 mL de HCl, 938 mL de agua desionizada, 121 g de base de Trizma)</td></tr><tr><td>Agar Technical</td><td>Fisher</td><td>DF0812-17-9</td><td>15 g (Añadir solo para placas)</td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td> desionizada <td>950 mL</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher</td><td>S640-3</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Fisher</td><td>BP97265</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Fisher</td><td>BP9727-2</td><td>5 g</td></tr></tbody></table>

ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de vibrio fischeri

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Este manuscrito describe un ensayo de incubación de monedas basado en el cultivo para detectar y caracterizar interacciones competitivas entre dos poblaciones bacterianas. Este método emplea plásmidos estables que permiten que cada población sea etiquetada diferencialmente con distintas capacidades de resistencia a los antibióticos y proteínas fluorescentes para la selección y discriminación visual de cada población, respectivamente. Aquí, describimos la preparación y la incubación de monedas de cepas Vibrio fischeri competidores, imágenes por microscopía de fluorescencia y análisis cuantitativo de datos. Este enfoque es simple, produce resultados rápidos y se puede utilizar para determinar si una población mata o inhibe el crecimiento de otra población, y si la competencia se media a través de una molécula difusible o requiere contacto directo con células celulares. Debido a que cada población bacteriana expresa una proteína fluorescente diferente, el ensayo permite la discriminación espacial de las poblaciones competidoras dentro de una colonia mixta. Aunque los métodos descritos se realizan con la bacteria simbiótica V. fischeri utilizando condiciones optimizadas para esta especie, el protocolo se puede adaptar para la mayoría de los aislados bacterianos culturables.

Con el fin de evaluar las interacciones competitivas entre las poblaciones bacterianas, se desarrolló y optimizó un protocolo de ensayo de acuñación de monedas para V. fischeri. Este método utiliza plásmidos estables que codifican genes de resistencia a antibióticos y proteínas fluorescentes, lo que permite la selección diferencial y la discriminación visual de cada cepa. Mediante el análisis de los datos recogidos del ensayo de incubación de monedas, se puede identificar el resu...

Las bacterias codifican diversos mecanismos para participar en la competencia interbacteriana. Aquí, presentamos un protocolo basado en el cultivo para caracterizar las interacciones competitivas entre los aislados bacterianos y cómo afectan a la estructura espacial de una población mixta.

Ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Nuestro protocolo proporciona un enfoque simple pero robusto para identificar y caracterizar los mecanismos competitivos entre diferentes cepas de bacterias Vibrio fischeri. Este método utiliza plásmidos estables que codifican diferentes genes de resistencia a los antibióticos y proteínas fluorescentes que permiten la selección diferencial y la discriminación visual de cada cepa bacteriana en un cultivo mixto. Para comenzar, utilice un palillo de dientes estéril para raspar las células de la placa de agar en el tamaño de un grano de arroz.Resuspender las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de caldo LBS. Para descomponer los grumos de la célula, presionelos en el lado del tubo y luego pipetee hacia arriba y hacia abajo vigorosamente. Cierre el tubo y el vórtice durante uno o dos segundos y repita si los grumos de la célula siguen siendo visibles hasta que la muestra sea visualmente uniforme.Repita estos pasos de preparación desde el raspado de celdas hasta el vórtice para todas las muestras. Mida y registre la densidad óptica en 600 nanómetros para todas las muestras. Para obtener una medición precisa de la DO, diluya las muestras hasta 10 veces utilizando caldo LBS.A continuación, normalice cada muestra al OD 600 deseado. Para mezclar la cepa de referencia y la cepa de la competencia en una proporción de uno a uno, añada 100 microlitros de cada cepa normalizados a OD 1.0 a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros etiquetado y vórtice durante uno a dos segundos. Como control, mezcle la cepa de referencia con una versión etiquetada diferencialmente de sí misma y vórtice también.Es fundamental lograr la relación de inicio correcta, ya que puede cambiar considerablemente el resultado del experimento. Para asegurar el éxito, este paso puede requerir optimización para una especie bacteriana determinada. Después de repetir este paso para cada réplica biológica, debe haber cuatro réplicas biológicas con cepas de referencia etiquetadas diferencialmente como controles y cuatro réplicas biológicas con referencia etiquetada diferencialmente y cepas de la competencia.Para hacer manchas de cultivo que se utilizarán para la microscopía de fluorescencia después de la incubación, agregue 10 microlitros de cada control y mezcla experimental en una placa de Petri que contenga agar LBS. Después de que las manchas se hayan secado completamente en el banco, incubar las placas a 24 grados centígrados durante 24 horas. Para hacer manchas de cultivo que se utilizarán para cuantificar las unidades formadoras de colonias para cada cepa al final del experimento, agregue 10 microlitros de cada control y mezclas experimentales en 24 placas de pozo que contengan un mililitro de agar LBS por pozo.Después de que las manchas se hayan secado por completo, incubar las placas a 24 grados centígrados durante cinco horas. Para realizar una dilución en serie de mezclas de coincubation iniciales, gire una placa de 96 pozos de 90 grados para que haya ocho columnas y 12 filas. Etiquete cada fila con el ID de deformación unitaria, el número de réplica y la hora que comienza con t cero.Etiquetar las placas de agar LBS suplementadas con el antibiótico adecuado en el que detectar la serie de dilución mientras se asegura de identificar para qué cepa está seleccionando cada placa antibiótica. Con una pipeta multicanal, agregue 180 microlitros de caldo LBS a cada pozo dejando la primera columna vacía para la mezcla de coincubation sin diluir. Usando una pipeta de microlitros de un solo canal, transfiera 100 microlitros de la mezcla de coincubation desde el tubo al primer pozo de la primera columna, luego deseche la punta y repita para todas las mezclas de coincubation.Con una pipeta multicanal, transfiera 20 microlitros de la columna uno a la columna dos y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Deseche las puntas y repita para cada columna mientras es consistente con el número de pipeteo hacia arriba y hacia abajo para cada dilución. Al final, cada fila contendrá una dilución en serie de 10 veces de la mezcla inicial.Utilice una pipeta multicanal equipada con ocho puntas para aspirar cinco microlitros de cada pozo en una serie de dilución y detectar en la placa de agar LBS suplementada con Kanamicina que selecciona para la cepa de referencia. Repita este paso para seleccionar la detección de tensión de la competencia en la placa suplementada con cloramphenicol. Después de que las manchas se hayan secado por completo, coloque las placas en la incubadora a 24 grados centígrados.Después de que las manchas de coincubation y las 24 placas de pozo se hayan incubado durante cinco horas a 24 grados Centígrados, agregue un mililitro de caldo LBS a cada pozo. Resuspend por pipeteo hacia arriba y hacia abajo hasta que todas las células se han resuspendido siendo consistentes con el vigor en el que las células se resuspenden en todas las réplicas. Una vez que se resuspendiga cada punto de coincubación, prepare una placa de 96 pozos para una dilución en serie y placas de agar LBS con los antibióticos adecuados en los que detectar la dilución de la misma manera que se hizo anteriormente.Para completar la dilución en serie para las mediciones finales en las 24 placas de pozo, realice los pasos utilizados para la dilución en serie del inóculo inicial y detecte cada dilución en placas de agar LBS como se hizo anteriormente. Continúe con la imagen de las manchas de coincubation en las placas de Petri y el análisis de datos como se describe en el manuscrito. En el tratamiento experimental, la cepa de referencia y la cepa de la competencia una están presentes en una proporción de 0,5 al principio y al final del experimento consistente con el tratamiento de control.Los valores de log RCI no eran estadísticamente diferentes de cero para el tratamiento de control o cuando la cepa de referencia se incubaba con la cepa de la competencia uno. Estos datos sugieren que no existía competencia entre la cepa de referencia y la cepa de la competencia. Por el contrario, cuando la cepa de referencia se incubaba con la cepa de la competencia dos, la cepa de referencia disminuyó de una proporción de 0,5 al principio a una proporción inferior a 0,01 al final del experimento.Además, los valores de RCI de registro fueron significativamente mayores que cero cuando la cepa de referencia se incubaba con la cepa de la competencia dos. En conjunto, estos datos indican que la proporción de la cepa de referencia disminuyó en presencia de la cepa de la competencia dos que sugieren la competencia entre las cepas. Cuando la cepa de referencia se incubaba con la cepa de la competencia, las UFC de ambas cepas aumentaron en el transcurso de cinco horas y no fueron significativamente diferentes, lo que sugiere que no se produjo ninguna competencia.Además, se observó aproximadamente 3200% de recuperación que no era estadísticamente diferente del control. Sin embargo, cuando la cepa de referencia se incubaba con dos cepas de la competencia, las FFU de cepa de referencia eran significativamente más bajas que las de tensión dos UFC en el control a cinco horas. Además, se observó aproximadamente un 4% de recuperación significativamente menor que el control.En conjunto, estos datos indican que la cepa dos compitió la cepa de referencia matando a sus células. El paso más importante en este procedimiento es lograr la relación de inicio correcta, ya que puede afectar significativamente a los resultados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Fuente: Brumfield, K. D., et al., Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar biotipos de aislados clínicos y ambientales de Vibrio cholerae . J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demuestra la prueba Voges-Proskauer (VP) para diferenciar entre tres biotipos de Vibrio cholerae: clásico, tipo salvaje El Tor y variante El Tor. Cada cultivo se inocula en un medio que contiene glucosa, se incuba y se trata con α-naftol e hidróxido potásico para detectar la presencia de acetoína. Un...

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