Name: Ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprende a cuantificar interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri mediante un ensayo de incubación de monedas. Este protocolo utiliza plásmidos con resistencia a antibióticos y proteínas fluorescentes para diferenciar cepas.

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Nos gustaría agradecer a los revisores por sus comentarios útiles. A.N.S. fue apoyado por la Fundación Gordon y Betty Moore a través de Grant GBMF 255.03 a la Fundación de Investigación en Ciencias de la Vida.

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<li>Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).</li>
<li>Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+system+of+Vibrio+cholerae+fosters+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer.</a> Science. 347 (6217), 63-67 (2015).</li>
<li>Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Vibrio+cholerae+to+low-temperature+shift%3A+CpsV+regulates+type+VI+secretion%2C+biofilm+formation%2C+and+association+with+zooplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+fluvialis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis.</a> Frontiers in microbiology. 8, 528(2017).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo de incubación de monedas descrito anteriormente proporciona un método potente para descubrir la competencia interbacteriana. Este enfoque permitió la identificación de la competencia intraespecífica entre los aislados v. fischeri y la caracterización del mecanismo competitivo19. Aunque el método descrito fue optimizado para la bacteria marina V. fischeri, se puede modificar fácilmente para adaptarse a otras especies bacterianas, incluyendo aislados clínicos y ambientale...

Este manuscrito describe un método basado en el cultivo para determinar si dos aislados bacterianos son capaces de interacciones competitivas. Al estudiar poblaciones mixtas, es importante evaluar en qué medida interactúan los aislados bacterianos, particularmente si los aislados compiten directamente a través de mecanismos de interferencia. La competencia de interferenciase se refiere a las interacciones en las que una población inhibe directamente el crecimiento o mata a una población competidora1. Estas interacciones son importantes de identificar porque pueden tener efectos profundos en la estructura y funcióndeuna comunidad microbiana 2,3.
Se han descubierto ampliamente mecanismos para la competencia microbiana en genomas de bacterias de diversos entornos, incluidas las bacterias asociadas al huésped y las bacterias de vida libre4,5,6,7, 8,9. Se han descrito una variedad de estrategias de competencia10,11 incluyendo mecanismos difusibles, tales como productos químicos bactericidas1,12 y péptidos antimicrobianos secretados13 , así como mecanismos dependientes del contacto que requieren contacto de células celulares para transferir un efector inhibitorio a las células diana9,14,15,16,17 ,18.
Aunque las coincubadoras basadas en el cultivo se utilizan comúnmente en microbiología5,8,19, este manuscrito describe cómo utilizar el ensayo para caracterizar el mecanismo de competencia, así como sugerencias para adaptarse el protocolo para su uso con otras especies bacterianas. Además, este método describe múltiples enfoques para analizar y presentar los datos para responder a diferentes preguntas sobre la naturaleza de las interacciones competitivas. Aunque las técnicas descritas aquí se utilizaron anteriormente para identificar el mecanismo de matanza interbacteriana subyacente a la competencia intraespecífica entre cepas simbióticas de bacterias vibrio fischeri coaisladas19,son adecuadas para muchas especies bacterianas, incluidos los aislados ambientales y los patógenos humanos, y pueden utilizarse para evaluar los mecanismos competitivos difusibles y dependientes del contacto. Los pasos en el protocolo pueden requerir optimización para otras especies bacterianas. Dado que más sistemas modelo están ampliando sus estudios más allá del uso de organismos isogénicos para incluir diferentes genotipos10,16,20,21, este método será un recurso valioso para los investigadores que buscan entender cómo la competencia afecta a los sistemas multi-strain o multi-especie.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>multicanal</tr><tr><td>100 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>multicanal</tr><tr><td>300 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>multicanal</tr><tr><td>10 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>monocanal</tr><tr><td>20 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>monocanal</tr><tr><td>200 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>monocanal</tr><tr><td>1.000 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>monocanal</tr><tr><td>placas de 24 pocillos</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>estéril con tapa</td></tr><tr><td>placas de 96 pocillos</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>estéril con tapa</td></tr><tr><td>Calculadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>stock (20 mg/mL en etanol); concentración final en medios (2 &mu; g/mL LBS)</td></tr><tr><td>Microscopio de disección de fluorescencia con cámara y software</td><td></td><td></td><td></td>de imagen</tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fisher</td><td>08-880</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td>caldo (100 mg/mL en agua, esterilizante por filtro); concentración final en medios (1 &mu; g/mL LBS)</td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa (FS MCE, 25MM, NS)</td><td>Fisher</td><td>SA1J788H5</td><td>0.22 &mu; membrana de nitrocelulosa (paquete de 100)Placas de</td></tr> <tr><td>Petri</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>estéril con tapa</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Semi-micro cubetas</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 0.1-10 &mu; L sistema de arranque</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3500</td><td>10 bastidores</td></tr><tr><td>TipOne 200 &mu; L sistema de arranque</td><td>USA Scientific</td><td>1111-500</td><td>10 bastidores</td></tr><tr><td>TipOne 1000 &mu; Sistema de arranque L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2520</td><td>10 bastidores</td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>LBS media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Tampón Tris (pH ~7.5)</td><td></td><td></td><td>50 mL 1 M de tampón de caldo (62 mL de HCl, 938 mL de agua desionizada, 121 g de base de Trizma)</td></tr><tr><td>Agar Technical</td><td>Fisher</td><td>DF0812-17-9</td><td>15 g (Añadir solo para placas)</td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td> desionizada <td>950 mL</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher</td><td>S640-3</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Fisher</td><td>BP97265</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Fisher</td><td>BP9727-2</td><td>5 g</td></tr></tbody></table>

ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de vibrio fischeri

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Este manuscrito describe un ensayo de incubación de monedas basado en el cultivo para detectar y caracterizar interacciones competitivas entre dos poblaciones bacterianas. Este método emplea plásmidos estables que permiten que cada población sea etiquetada diferencialmente con distintas capacidades de resistencia a los antibióticos y proteínas fluorescentes para la selección y discriminación visual de cada población, respectivamente. Aquí, describimos la preparación y la incubación de monedas de cepas Vibrio fischeri competidores, imágenes por microscopía de fluorescencia y análisis cuantitativo de datos. Este enfoque es simple, produce resultados rápidos y se puede utilizar para determinar si una población mata o inhibe el crecimiento de otra población, y si la competencia se media a través de una molécula difusible o requiere contacto directo con células celulares. Debido a que cada población bacteriana expresa una proteína fluorescente diferente, el ensayo permite la discriminación espacial de las poblaciones competidoras dentro de una colonia mixta. Aunque los métodos descritos se realizan con la bacteria simbiótica V. fischeri utilizando condiciones optimizadas para esta especie, el protocolo se puede adaptar para la mayoría de los aislados bacterianos culturables.

Con el fin de evaluar las interacciones competitivas entre las poblaciones bacterianas, se desarrolló y optimizó un protocolo de ensayo de acuñación de monedas para V. fischeri. Este método utiliza plásmidos estables que codifican genes de resistencia a antibióticos y proteínas fluorescentes, lo que permite la selección diferencial y la discriminación visual de cada cepa. Mediante el análisis de los datos recogidos del ensayo de incubación de monedas, se puede identificar el resu...

Las bacterias codifican diversos mecanismos para participar en la competencia interbacteriana. Aquí, presentamos un protocolo basado en el cultivo para caracterizar las interacciones competitivas entre los aislados bacterianos y cómo afectan a la estructura espacial de una población mixta.

Ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Nuestro protocolo proporciona un enfoque simple pero robusto para identificar y caracterizar los mecanismos competitivos entre diferentes cepas de bacterias Vibrio fischeri. Este método utiliza plásmidos estables que codifican diferentes genes de resistencia a los antibióticos y proteínas fluorescentes que permiten la selección diferencial y la discriminación visual de cada cepa bacteriana en un cultivo mixto. Para comenzar, utilice un palillo de dientes estéril para raspar las células de la placa de agar en el tamaño de un grano de arroz.Resuspender las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de caldo LBS. Para descomponer los grumos de la célula, presionelos en el lado del tubo y luego pipetee hacia arriba y hacia abajo vigorosamente. Cierre el tubo y el vórtice durante uno o dos segundos y repita si los grumos de la célula siguen siendo visibles hasta que la muestra sea visualmente uniforme.Repita estos pasos de preparación desde el raspado de celdas hasta el vórtice para todas las muestras. Mida y registre la densidad óptica en 600 nanómetros para todas las muestras. Para obtener una medición precisa de la DO, diluya las muestras hasta

coincubation-assay-for-quantifying-competitive-interactions-between

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Speare, L., et al. Ensayo de coincubación para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra un ensayo de coincubación utilizado para estudiar cómo compiten las cepas bacterianas en un entorno compartido. Se aplica ampliamente en microbiología para identificar mecanismos, como la muerte dependiente o independiente del contacto, que impulsan estas interacciones.

Ensayo de coincubación para estudiar interacciones competitivas entre cepas bacterianas

Fuente: Brumfield, K. D., et al. Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar biotipos de aislados clínicos y ambientales de Vibrio cholerae . J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demuestra un ensayo de agar blando utilizando cloruro de trifeniltetrazolio para evaluar y comparar la motilidad de cepas de Vibrio cholerae visualizando la actividad metabólica a través de la formación de zonas rojas alrededor de células activamente migratorias.

Ensayo de motilidad para comparar cepas de Vibrio cholerae utilizando cloruro de trifeniltetrazolio

Fuente: Brumfield, K. D., et al., Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar biotipos de aislados clínicos y ambientales de Vibrio cholerae . J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demuestra la prueba Voges-Proskauer (VP) para diferenciar entre tres biotipos de Vibrio cholerae: clásico, tipo salvaje El Tor y variante El Tor. Cada cultivo se inocula en un medio que contiene glucosa, se incuba y se trata con α-naftol e hidróxido potásico para detectar la presencia de acetoína. Un...

Ensayo Voges-Proskauer para la diferenciación de biotipos de Vibrio cholerae

Fuente: Nag, D., et al. Cuantificación de la colonización y diarrea por Vibrio cholerae en el modelo de pez cebra adulto. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demuestra un protocolo para cuantificar la carga bacteriana intestinal en peces cebra adultos infectados con una cepa resistente a antibióticos de Vibrio cholerae. Tras la eutanasia y disección, el tracto intestinal se aísla, homogeneiza con perlas de vidrio y se procesa para liberar las bacterias. El homogenado resultante se coloca en un medio...

Cuantificación de la carga bacteriana intestinal en pez cebra infectado con Vibrio cholerae

Este video muestra un método basado en microscopía de fluorescencia para estudiar la competencia bacteriana a nivel de una sola célula. Este método proporciona información sobre la estructura y función de las comunidades bacterianas.

Ensayo de co-incubación bacteriana: una técnica basada en microscopía de fluorescencia para visualizar la competencia bacteriana intraespecífica a nivel de una sola célula

Se describe un ensayo cualitativo para supervisar la competencia bacteriana mediada por...

Un ensayo visual para monitorear T6SS mediada por la competencia bacteriana

La unión bacteriana a las células huésped es un paso clave durante la colonización e infección del huésped. Este protocolo describe la generación de adhesinas recombinantes acopladas a polímeros como materiales biomiméticos que permiten analizar la contribución de adhesinas individuales a estos procesos, independientemente de otros factores bacterianos.

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

La detección y el aislamiento de especies de Vibrio clínicamente relevantes requieren medios de cultivo selectivos y diferenciales. Este estudio evaluó la capacidad de un nuevo medio cromogénico para detectar e identificar V. parahaemolyticus y otras especies relacionadas. Se encontró que el nuevo medio tenía mejor sensibilidad y especificidad que el medio convencional.

Desarrollo de una más sensible y específica cromogénico medio de agar para la detección de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Y Otros<em&gt; Vibrio</em&gt; Especies

Este manuscrito describe técnicas adecuadas de mantenimiento de Vibrio cholerae además de una serie de ensayos bioquímicos, utilizados colectivamente para una diferenciación rápida y confiable entre V clínico y ambiental. Cholerae biótipos en un entorno de laboratorio.

Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar los biotipos de<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Aislados Clínicos y Ambientales

Este manuscrito describe un método para utilizar la microscopía de fluorescencia unicelular para visualizar y cuantificar la competencia bacteriana en el cocultivo.

Cuantificación de la competencia interbacteriana utilizando imágenes de fluorescencia unicelular

Aprende a cuantificar interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri mediante un ensayo de incubación de monedas. Este protocolo utiliza plásmidos con resistencia a antibióticos y proteínas fluorescentes para diferenciar cepas.

Ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri

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