Name: Uso de Minigenes que contienen elementos Alu para analizar ARN circulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Aprende a generar ARN circulares mediante minigenes con elementos Alu para estudiar su función y asociación con enfermedades. Este protocolo de biología molecular optimiza condiciones de PCR y ensamblaje de ADN.

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Este trabajo fue apoyado por la concesión AZ180075 del Departamento de Defensa. Stefan Stamm gracias Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin fue apoyada por el DAAD, programa de intercambio académico alemán, Justin R. Welden fue galardonado con el Premio de la Universidad de Kentucky Max Steckler.

1. Diseño de las construcciones
<ol><li>Utilice el navegador del genomaCPSC 24 para identificar los elementos repetitivos necesarios para la formación de ARN circular e incorporarlos en las construcciones. Es importante destacar que las imprimaciones para amplificación deben estar fuera de los elementos repetitivos.</li>
	<li>Pegue la secuencia de ARN circular(Figura suplementaria 1 es una secuencia de prueba) en <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start" target="_blank">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start</a> y seleccione el organismo adecuado. Envíe la secuencia y vaya a la vista del navegador, aléjese 1.5x o según corresponda(Figura 2A). NOTA: La secuencia de búsqueda aparece en la línea superior(Figura 2A, 1). Dependiendo del orden de los exons en el ARN circular, BLAT no conectará todos los exons. En este ejemplo, el exón 12(Figura 2A, 4) no está conectado a 11(Figura 2A, 2, 3), porque el exón 12 es aguas arriba del exón 11 en la secuencia de ARN circular(Figura suplementaria 1). Los elementos repetitivos están en la pista 'repetir enmascarador', indicada por cajas, donde el color negro a gris indica la conservación evolutiva(Figura 2A, 5).</li>
	<li>Pase el ratón sobre los elementos repetitivos para identificar su subtipo en una ventana flotante. Los elementos Alu se encuentran en la línea SINE (elemento nuclear intercalado corto). Utilice el botón 'pistas predeterminadas' debajo de la ventana para restablecer el navegador si se obtiene una imagen diferente de la Figura 2. NOTA: Mousing sobre los exons en la pantalla del gen genera una ventana con números de exón generados por computadora. Estos números no corresponden a la numeración de exón establecida en la literatura y también cambian entre isoformas.</li>
</ol>2. Seleccione la secuencia que se va a clonar en un vector de expresión
<ol><li>Descargue la secuencia de ADN que se muestra en la ventana yendo a Ver el ADN en la línea superior del navegador del genoma UCSC. En la opción Formato de secuenciación, seleccione Opciones de mayúsculas y minúsculas/colores extendidas.</li>
	<li>Seleccione el caso predeterminado como Inferior y seleccione alternar mayúsculas y minúsculas para NCBI refseq. Seleccione subrayado, negrita y cursiva para Máscara de repetición. Haga clic en Enviar. Habrá exons como letras mayúsculas e intrones como letras pequeñas. Compruebe los bordes del exón/intron.</li>
	<li>En este ejemplo hay una secuencia 'ccctttacCTTTTT', que indica que el navegador muestra el complemento inverso. Si este es el caso, vuelva atrás y seleccione el cuadro de complemento inverso hasta ver los bordes intrones de exón correctos (agEXONgt), en este ejemplo AAAAAGgtaaaggg.</li>
	<li>Copie el archivo con la orientación correcta (los exons internos están rodeados de ag... gt) en un documento de procesamiento de textos y resalte los exons(Figura Suplementaria 2). NOTA: En este ejemplo, el fragmento genómico que abarca los exons 9-12 es de alrededor de 24 kb y, por lo tanto, demasiado grande para ser amplificado a partir del ADN genómico. Por lo tanto, cada exón rodeado por aproximadamente 1 kb de región intrónica se amplifica individualmente y estos cuatro fragmentos se ensamblan en un vector de clonación.</li>
	<li>Seleccione los fragmentos que desea amplificar (exón a 500 nt intron). Asegúrese de que el intrón no comience ni termine en una región repetitiva, ya que los imprimadores de estas regiones no amplificarán secuencias específicas. Las regiones seleccionadas se muestran en la Figura 2By sus secuencias se muestran en la Figura suplementaria 3. NOTA: En general, cuanto más grandes sean las construcciones, más difícil será la clonación. Los fragmentos se pueden ensamblar paso a paso sabio (es decir, el exón 9 se combina con el vector y en el siguiente paso el exón 10 se introduce en esta construcción a través de la clonación hasta que todos los exons están en su lugar), o alternativamente, todos los fragmentos se ensamblan simultáneamente. Un enfoque escalonado siempre funciona, pero requiere más tiempo. Un ensamblaje simultáneo no siempre funciona y depende de lo bien que los fragmentos individuales se pueden amplificar a partir del ADN genómico y del tamaño total de la construcción. Por lo tanto, normalmente comenzamos con ambos enfoques simultáneamente.</li>
</ol>3. Imprima imprimaciones para clonación
<ol><li>Utilice una herramienta web (<a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a>) para diseñar las imprimaciones para la clonación. Por ejemplo, escriba los fragmentos 9, 10, 11 y 12 y la secuencia vectorial(Figura suplementaria 3)a esta herramienta.</li>
	<li>Para la secuencia vectorial, agregue el sitio de inserción como el último nucleótido y, posteriormente, agregue los fragmentos. Puesto que la numeración vectorial no comienza con un sitio de inserción dado, se encuentra el sitio de inserción en el vector y la parte descendente se coloca delante de la secuencia ascendente. En este ejemplo, las plaquitas comienzan directamente después del sitio HindIII [AAGCTT] y terminan directamente después del sitio PmeI [GTTTAAAC] de pcDNA3.1. La secuencia de cccgctgatcag ... ccgtaaaaaagccgc se pega delante de la posición 1 en la secuencia pcDNA3.1 (gttgctggcgtttttcc ...).</li>
	<li>Ajuste las imprimaciones si sus puntos de fusión están separados a más de 4 oC, ya que no funcionarán en la amplificación. El montaje de los fragmentos y secuencias de imprimación diseñados se muestran en la Figura Suplementaria 4. Las imprimaciones para clonación también se pueden diseñar manualmente25.</li>
</ol>4. Detección de PCR y amplicon
<ol><li>Reacción PCR estándar: Haga una mezcla de reacción para un volumen total de 50 s por reacción. A continuación se muestra la receta para una reacción usando la polimerasa 1: 10 l de búfer de reacción de 5x 1 L de 10 mM de dNtPs 2,5 s de 10 m de imprimación delantera 2,5 ml de imprimación inversa de 10 m 0,5 l de polimerasa 1 32,5 l de Nuclease libre H2O<ol>
<li>Opcionalmente, agregue 10 s l de 5x GC Enhancer si el producto tiene un alto contenido de GC; hacer una mezcla separada que contenga GC Enhancer para probar la reacción de PCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot 49 l de la mezcla en tubos PCR por muestra de reacción.</li>
	<li>Añadir 1 l de ADN a la PCR, la cantidad oscila entre 10 pg y 1 ng.</li>
	<li>Gire las muestras para eliminar los residuos de los lados y colóquelos en una máquina pcR. Utilice la misma máquina, así como los mismos puntos en la máquina al optimizar las condiciones de PCR.</li>
</ol>5. Optimización de fragmentos de ADN más largos para el uso de diferentes polimerasas
<ol><li>Temperatura<ol>
<li>Optimice la polimerasa de largo alcance 2.<ol>
<li>Utilizar una temperatura de desnaturalización más baja (Polimerasa 1: 98 oC, Polimerasa 2: 94 oC).</li>
			<li>Utilizar un tiempo de desnaturalización más largo (Polimerasa 1: 10 s, Polimerasa 2: 30 s).</li>
			<li>Utilice un tiempo de recocido más largo (Polimerasa 1: 30 s, Polimerasa 2: 60 s).</li>
			<li>Utilice un tiempo de extensión más largo (Polimerasa 1: 30 s/kb, Polimerasa 2: 50 s/kb).</li>
			<li>Utilice una temperatura de extensión más baja (Polimerasa 1: 72 oC, Polimerasa 2: 65 oC).</li>
			<li>Utilice una temperatura de recocido 5 oC por debajo de la Tm de las imprimaciones.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Optimizar las concentraciones de imprimación (5 veces menos a 5 veces más que la concentración de imprimación original). Optimizar las concentraciones de ADN de 10 pg a 50 pg, 100 pg, 1 ng, 5 ng, 10 ng.</li>
		<li>Como ejemplo de un programa de PCR para amplificar un tamaño de producto de 15 kb usando Polymerase 2, realice una desnaturalización inicial a 94 oC durante 30 s, desnaturalización del ADN a 94 oC para 30 s seguida de recocido a 58 oC para 30 s, y extensión de ADN a 65 oC durante 12 min 30 s. Realizar una extensión final a 65 oC durante 10 minutos con una retención final de 4 oC. NOTA: La temperatura de recocido (Ta) específica para las imprimaciones determinada por los cálculos de temperatura basados en web que son específicos para cada polimerasa. Los tiempos de extensión pueden variar y deben optimizarse si los fragmentos son mayores de 10 kb.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tiempos de extensión y concentraciones de ADN<ol>
<li>Utilice tiempos de extensión más largos para fragmentos de ADN de más de 6 kb: 1 min por 1 kb. Los fragmentos más largos deben usar menos ADN.</li>
		<li>Realizar diluciones de ADN para encontrar la concentración óptima de ADN para la amplificación, por lo general de 1 pg a 1 ng para plásmidos o 1 ng a 1 g para el ADN genómico. NOTA: Para la mayoría de la clonación, utilice la polimerasa 1, diseñada fusionando el dominio de unión al ADN Sso7d a una polimerasa de ADN termoestable patentada26. La polimerasa tiene una baja tasa de error y debido al dominio Sso7d una alta procesatividad, necesaria para amplificar fragmentos genómicos grandes (10-15 kb). Debido a este gran tamaño de fragmento, el conjunto enzimático de moléculas de ADN27 se utiliza para la inserción en vectores, ya que este método no requiere enzimas de restricción. La amplificación de fragmentos de más de 15 kb se vuelve cada vez más difícil con la polimerasa 1. Para la amplificación de fragmentos grandes, utilice la polimerasa 2 hecha de pirococo-como la polimerasa de corrección fusionada con Sso7d o el kit de PCR de largo alcance que da, sin embargo, tasas de error más altas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Purificación de productos de PCR para clonación
<ol><li>Ejecute la mitad de los productos de PCR en geles de agarosa al 1% que contengan una mancha de ácido nucleico intercalante (por ejemplo, 1x GelGreen). Visualice los geles manchados en un transiluminador lector oscuro. Este ADN manchado no se ajusta al tamaño. NOTA: GelGreen intercala en EL ADN, similar al bromuro de etidio, pero se excita por la luz alrededor de 500 nm (cian), una longitud de onda que no daña el ADN, lo que mejora en gran medida la clonación.</li>
	<li>Paralelamente, ejecute la mitad de los productos PCR en un gel del 1% que se tiñe después de la ejecución con bromuro de etidio(Figura 3A,B).</li>
	<li>Bandas especiales del tamaño adecuado del gel teñido (paso 6.1) y aislar el ADN utilizando un gel y un kit de limpieza de PCR. En desviación de su protocolo estándar, eluir el ADN en sólo 20 l de agua destilada doble, ya que por lo general las concentraciones de ADN son bajas.</li>
	<li>Antes de clonar, compruebe la concentración e integridad del ADN aislado de un gel de agarosa(Figura 3B). Apunte a una relación de inserción molar a vector 2:1. Cuando se utilizan varias plaquitas, la relación es 2:2:2:1.</li>
</ol>7. Montaje de ADN y detección de clones
NOTA: La clonación se realiza utilizando un kit de ensamblaje de ADN enzimático, con modificaciones menores. El montaje se realiza durante 60 minutos a 50 oC y generalmente se utiliza el rango inferior de ADN para el montaje (reacción de 20-100 fmol/20 l). Toda la mezcla de reacción se añade a las células químicas competentes y las células enteras chapadas en una placa de agar de 6 cm.
<ol><li>Combine el vector e insértelo en una relación molar de 1:2 (20-500 fmol cada uno) en 10 ml de agua.</li>
	<li>Añadir 10 l de mezcla maestra de ensamblaje de ADN.</li>
	<li>Incubar muestras durante 60 minutos a 50oC.</li>
	<li>A continuación, transforme las celdas competentes con la reacción total de ensamblaje. Aquí, utilice e. coli cepa 1 células para construcciones más cortas o E. coli colaunitaria 2 células para construcciones más largas o inestables. Las celdas deben estar en un volumen de 50 l.</li>
	<li>Descongelar las células sobre hielo y añadir 2 ml del producto enfriado ensamblado a las células competentes. Mezclar moviendo suavemente el tubo 4-5 veces. No vórtice.</li>
	<li>Deje que la mezcla se sente en hielo durante 30 minutos.</li>
	<li>Choque de calor a 42oC durante 30 s. No mezclar.</li>
	<li>Transfiera el tubo de nuevo al hielo durante 2 min.</li>
	<li>Añadir 950 l de SOC a temperatura ambiente al tubo.</li>
	<li>Incubar el tubo de reacción a 37oC durante 60 min. Agitar vigorosamente (300 rpm).</li>
	<li>Placas de selección calientes con el antibiótico adecuado durante la incubación a 37oC.</li>
	<li>Reventar las células a través de centrifugación (10.000 x g,30 s) y la placa de salida 1/4 y 3/4 de células en dos placas de selección e incubar a 37oC durante la noche.</li>
</ol>8. Validación de clones
<ol><li>Utilice la PCR de colonia, empleando imprimaciones PCR que abarcan los sitios de montaje(Figura 1C)para la detección.</li>
	<li>Tome un palillo estéril y toque una sola colonia bacteriana.</li>
	<li>Toque la parte inferior de un tubo de PCR con el palillo de dientes que tiene la colonia y luego raye el palillo de dientes en una placa de agar antibiótico, incubar la placa rayada a 37 oC o temperatura ambiente para construcciones sensibles durante la noche.</li>
	<li>Superponer el tubo PCR tocado con la colonia con una mezcla de PCR que contiene las imprimaciones de detección. Estos están diseñados con imprimación 3 (<a href="http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/" target="_blank">http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</a>). El programa tiene la opción de forzar el diseño de imprimación a través de una secuencia definida utilizando los signos "[ccc]" para seleccionar imprimaciones a través de la unión de ensamblaje. El ADN de cepas positivas se aísla y verifica mediante secuenciación.</li>
</ol>9. Análisis del ARN circular que expresa los genes del reportero
<ol><li>Para el análisis, los genes de reporteros transfectos en células eucariotas. Aquí, utilice las células HEK293 (ATTC #CRL-1573) ya que proporcionan una alta eficiencia de transfección. Para ahorrar costes, utilice las soluciones PEI (polietilenimina).</li>
	<li>Para la solución PEI, disolver el clorhidrato lineal de polieetilemímine (PEI) a 1 mg/ml en agua a un pH bajo, pH 2. Sube el pH a 7 con NaOH. Filtro estéril con filtros de 0,22 m y guárdelo a 4 oC.</li>
	<li>Divida las células en seis pozos (aproximadamente 150.000 células por pozo) y déjelas crecer durante la noche en 10% FBS en medios DMEM.</li>
	<li>Aliquot 1 g del gen del reportero en un tubo estéril y añadir 200 ml de NaCl filtrado estéril de 150 mM. Mezclar con el ADN por vórtice.</li>
	<li>Añadir la solución PEI a esta mezcla y vórtice, centrífuga brevemente para recoger muestras en la parte inferior del tubo. Utilice una proporción de 1 g de ADN por cada 3 ml de PEI.</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego añadir directamente a las células HEK 293.</li>
	<li>Incubar células HEK293 a 37oC, 5%CO2,durante la noche.</li>
	<li>Aísle el ARN para RT-PCR a través de un kit de aislamiento de ARN.</li>
</ol>10. Tratamiento RNase R para eliminar ARN lineales
<ol><li>Utilice 10 g de ARN total en un tubo libre de RNase.</li>
	<li>Añadir 10 l de tampón 10x R Nase R (0,2 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 M KCl, 1 mM MgCl2) al ARN.</li>
	<li>Añadir RNase R al ARN (1 l a 20U).</li>
	<li>Añadir 1 l de glicol azul al ARN y llevar el volumen hasta 100 l con agua estéril.</li>
	<li>Incubar muestras a 37oC durante 30 min.</li>
	<li>Añadir 100 l de fenol/cloroformo y vórtice durante 1 min.</li>
	<li>Centrífuga a 21.000 x g durante 1 min para separar las fases.</li>
	<li>Tomar el sobrenadante (fase acuosa) y añadir 1 volumen (alrededor de 80 l de cloroformo).</li>
	<li>Vórtice durante 1 min, y luego centrifugar durante 1 min para separar las fases.</li>
	<li>Tomar sobrenadante, añadir 1:10 vol KAc y 2.5 vol etanol, y precipitar a -20 oC para 1-4 h. Centrifugar a 4 oC durante 30 minutos a toda velocidad (21.000 x g). Habrá un pequeño pellet azul en la parte inferior.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y lávelo con un 80% de etanol. Dejar secar al aire durante 5 minutos a temperatura ambiente y disolver en agua de 10 s.</li>
</ol>11. Análisis RT-PCR
<ol><li>Utilice 1 g de ARN por reacción RT.</li>
	<li>Hacer una mezcla de reacción para un volumen total final de 20 s por reacción. Para una reacción, utilice 1 l de dNTPs de 10 mM, 1 l de ditiothreitol de 0,1 M (TDT), 4 ml de búfer de primera cadena de 5 x y 0,5 ml de transcriptasa inversa.</li>
	<li>Aliquot 6,5 l de mezcla de reacción en nuevos tubos PCR.</li>
	<li>Mezclar hasta 5 imprimaciones en una sola mezcla. Sin embargo, algunos imprimadores pueden emparejarse erróneamente con otros imprimadores en el PCR(Figura 5). Las secuencias de imprimación están en la Tabla 2. Usamos rutinariamente imprimaciones de unión de exónitos específicas de genes, pero también es posible cebar con hexamers aleatorios.</li>
	<li>Añadir 1 l de imprimación inversa de 10 m al tubo de reacción RT deseado.</li>
	<li>Añadir 1 g de ARN al tubo de reacción de PCR.</li>
	<li>Añadir H2O libre de RNase hasta un volumen total de 20 l.</li>
	<li>Esgire los tubos hacia abajo para eliminar los residuos en el lado de los tubos y colocarlos en el termociclador.</li>
	<li>Ejecuta la reacción RT en termociclador a 50oC durante 50 minutos.</li>
	<li>Almacene el ADNC RT a -20 oC o proceda a la reacción de la PCR.</li>
</ol>

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<li>Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+backsplicing+produces+translatable+circular+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs.</a> RNA. 21 (2), 172-179 (2015).</li>
<li>Yang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+GFP-Based+Reporter+to+Study+Back+Splicing+and+Translation+of+Circular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+profiling+reveals+an+abundant+circHIPK3+that+regulates+cell+growth+by+sponging+multiple+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11215(2016).</li>
<li>Jia, W., Xu, B., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+expression+profiles+of+mouse+ovaries+during+postnatal+development+and+the+function+of+circular+RNA+epidermal+growth+factor+receptor+in+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells.</a> Metabolism. 85, 192-204 (2018).</li>
<li>Liang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Output+of+Protein-Coding+Genes+Shifts+to+Circular+RNAs+When+the+Pre-mRNA+Processing+Machinery+Is+Limiting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting.</a> Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).</li>
<li>Legnini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circ-ZNF609+Is+a+Circular+RNA+that+Can+Be+Translated+and+Functions+in+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis.</a> Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+circRNA+Biogenesis+and+Function+with+NF90%2FNF110+in+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection.</a> Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biogenesis+of+Nascent+Circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Biogenesis of Nascent Circular RNAs.</a> Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).</li>
</ol>

Nada que revelar.

En general, los ARN circulares son de bajo abundante1, lo que complica el estudio de su función y formación. Al igual que los ARN lineales13,el uso de minigenes de reportero permite la identificación de cis y factores de acción trans que regulan la formación de ARN circulares. Por lo tanto, este enfoque genera hipótesis que se pueden probar aún más utilizando los genes endógenos.
El paso más crítico es el diseño del gen reportero. El conjunto enz...

RNA circulares Los ARN circulares (arnar circ) se cierran covalentemente en ARN de una sola trenza que se expresan en la mayoría de los organismos. Se generan uniendo un sitio de empalme descendente de 5' a un sitio de empalme ascendente de 3', un proceso llamado back-splicing(Figura 1A)1. Las secuencias en el pre-mRNA que exhiben base complementaria tan corta como 30-40 nt llevan los sitios de empalme hacia atrás en la alineación adecuada para la formación de ARN circn.2. En los seres humanos, los elementos Alu 1, que representan alrededor del 11% del genoma3,forman extensas estructuras de ARN de doble cadena en pre-arNM debido a su autocomplementariedad4,5 y así promueven la formación de circRNAs1.
Actualmente, se han descrito tres funciones principales de los circRNAs. Algunos círculos se unen microRNAs (miRNAs) y a través del secuestro actúan como esponjas de miRNA6. Los CircRNAs se han implicado en la regulación transcripcional y post transcripcional, a través de la competencia con el empalme lineal7 o la modulación de la actividad del factor de transcripción8. Por último, los círculos contienen marcos de lectura abiertos cortos y estudios de prueba de principio muestran que se pueden traducir9,10. Sin embargo, la función de la mayoría de los círculos narinás sigue siendo enigmática. La mayoría de los ARN circulares se han detectado utilizando métodos de secuenciación de próxima generación11. Los análisis detallados de genes individuales utilizando enfoques RT-PCR específicos revelan que un gran número de ARN circulares aún está por descubrir12.
Uso de genes reportero según el procesamiento previo al ARNm El análisis del ARNm derivado de construcciones de reporteros de ADN transfectó en células es un método bien establecido para estudiar el empalme alternativo antes del ARNm, que se puede aplicar a los ARN circulares. En general, el exón alternativo, sus intrones circundantes y exons constitutivos se amplifican y clonan en un vector de expresión eucariota. Con frecuencia, los intrones se acortan. Las construcciones están infectadas en células eucariotas y generalmente analizadas por RT-PCR13,14. Este enfoque se ha utilizado ampliamente para mapear sitios de empalme sregulador y factores de acción trans en experimentos de co-transfección13,15,16,17,18. Además, la generación de minigenes de expresión de proteínas permitió el cribado de sustancias que cambian el empalme alternativo19,20.
El método se ha aplicado a los ARN circulares. Actualmente, al menos 12 espina dorsales de minigene se han descrito en la literatura y se resumen en la Tabla 1. Con la excepción del sistema de expresión basado en ARNm21,22, todos dependen de los promotores de la polimerasa II. Aquí, describimos un método para generar minigenes de reporteros humanos para determinar los factores cis y trans-acting involucrados en la generación de ARN circulares. En la Figura 1se muestra una descripción general del método utilizando secuencias de un gen de reportero publicado23.

<table><tbody><tr><td>(PEI) Clorhidrato</td><td>Polysciences</td><td>24765-1</td><td></td>Herramienta constructora</tr><tr><td></td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator.</td><td>Clare Chemical Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de montaje de ADN enzimático</td><td>NEB</td><td>E2621S</td> Kit de <td></td></tr><tr><td>limpieza de gel y PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Glyco Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 sitio de clonación</td><td>Sitio de</td><td></td> <td>policlonación<a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf" target="_blank">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf</a></td></tr><tr><td>Polimerasa 1</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Q5 ADN polimerasa</td></tr><tr><td>2</td><td>Biorad</td><td>1725310</td><td>polimerasa de largo alcance (NEB), iproof (BioRad)</td></tr><tr><td>Polimerasa 2</td><td>Qiagen</td><td>206402</td><td>Kit de polimerasa de largo alcance Qiagen</td></tr><tr><td>Transcriptasa inversa</td><td>Thermo Fisher</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>kit de aislamiento de ARN</td><td>Life Technologies</td><td>12183025</td><td>Ambion de Life Technologies</td></tr><tr><td>RNAse R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td>Epicenter/Lucigen</td></tr><tr><td>Células competentes estables</td><td>NEB</td><td>C3040H</td><td>Células estables NEB</td></tr><tr><td>Clonación estándar</td><td>NEB</td><td>C2988J</td><td>NEB5-alpha Herramienta</td></tr><tr><td>web competente para diseñar cebadores</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td></tr><tr><td>Cálculos de temperatura basados en la web</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://tmcalculator.neb.com/#!/main" target="_blank">https://tmcalculator.neb.com/#!/main</a></td></tr></tbody></table>

uso de minigenes que contienen elementos alu para analizar arn circulares

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Además de los ARNm lineales, muchos genes eucariotas generan ARN circulares. La mayoría de los ARN circulares se generan uniendo un sitio de empalme de 5' con un sitio de empalme ascendente de 3' dentro de un pre-mRNA, un proceso llamado back-splicing. Esta circularización es probablemente ayudada por estructuras secundarias en el pre-mRNA que acercan los sitios de empalme. En los genes humanos, se piensa que los elementos Alu promueven estas estructuras secundarias de ARN, ya que los elementos Alu son abundantes y exhiben complementariedades de base entre sí cuando están presentes en direcciones opuestas en el pre-ARNm. Aquí, describimos la generación y el análisis de grandes elementos Alu que contienen genes de reportero que forman ARN circulares. A través de la optimización de los protocolos de clonación, se pueden generar genes de reportero con una longitud de inserción de hasta 20 kb. Su análisis en experimentos de co-transfección permite la identificación de factores regulatorios. Por lo tanto, este método puede identificar secuencias de ARN y componentes celulares involucrados en la formación de ARN circular.

Los genes reporteros permiten determinar factores reguladores que influyen en la formación circular de ARN. Sin embargo, estos genes reporteros son grandes y contienen elementos repetitivos que a menudo hacen que las construcciones de ADN sean inestables. Debido a su gran tamaño, a menudo es necesario eliminar partes de los intrones, lo que se logra mediante la amplificación de piezas genómicas que contienen los exons y partes intrónicas de flanqueo más pequeñas. Estas piezas de ADN se ensamblan enzimáticamente, permitie...

Clonamos y analizamos genes de reportero generando ARN circulares. Estos genes reporteros son más grandes que las construcciones para analizar el empalme lineal y contener elementos Alu. Para investigar los ARN circulares, las construcciones se transinfectan en células y el ARN resultante se analiza utilizando RT-PCR después de la eliminación del ARN lineal.

Uso de Minigenes que contienen elementos Alu para analizar ARN circulares

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Este protocolo es significativo porque permite al usuario generar un sistema de expresión genómica que puede someterse a empalmes alternativos y en este caso formar ARN circulares que se pueden probar para su función y asociación de enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que allanará el camino para que otros utilicen este protocolo en biología molecular y clonación al estudiar el empalme alternativo en la formación y función circulares de ARN. Mi consejo a alguien que prueba esta técnica por primera vez sería optimizar las condiciones de PCR.Ejecute degradados o realice PCR de touchdown con diferentes temperaturas de recocido y tiempos de extensión. Por lo general, los fragmentos más largos de seis KB extenderán un KB por ciclo y diferentes temperaturas de recocido tendrían que ser probados para la mejor amplificación. La demostración de este método es crítica porque dará a los usuarios una mejor representación visual de los aspectos más difíciles del procedimiento especialmente la generación de imprimaciones.Para comenzar este procedimiento, cargue el Navegador del genoma UCSC y utilícelo para identificar los elementos repetitivos necesarios para la formación circular

use-of-alu-element-containing-minigenes-to-analyze-circular-rnas

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Lineal-amplificación mediada (LAM)-PCR es un método desarrollado para identificar las posiciones exactas de los vectores de integración viral en el genoma. La técnica ha evolucionado a ser el método superior para estudiar la dinámica clonales en los pacientes de terapia génica, la bioseguridad de las tecnologías de nuevo vector, la diversidad de células T, los modelos de células madre de cáncer, etc...

Lineal Amplificación Mediada por PCR - Localización de elementos genéticos y caracterización de ADN que flanquean Desconocido

Este video muestra los pasos básicos para realizar el análisis del transcriptoma completo en muestras de médula espinal embrionarias de pollo disecadas después de la transfección con electroporación in ovo.

RNA-Seq Análisis de Expresión diferencial de genes en electroporación de embriones de pollo de la médula espinal

Este artículo presenta un método sensible llamado Circle-Seq para purificar el ADN circular extracromosómico (eccDNA). El método abarca la purificación en columna, la eliminación del ADN cromosómico lineal restante, la amplificación en círculo rodante y la secuenciación de alto rendimiento. Circle-Seq es aplicable al cribado a escala genómica del ECCDNA eucariota y al estudio de la inestabilidad del genoma y la variación del número de copias.

La purificación de todo el genoma de ADN circular Extracromosómica a partir de células eucariotas

La dos diferentes 3' amplificación rápida del cDNA extremos (3' RACE) protocolos descrito aquí hacen uso de dos diferentes polimerasas de la DNA para asignar las secuencias que incluyen un segmento del marco de lectura abierto (ORF), el codón de parada y el entero 3' UTR de una transcripción utilizando RNA obtenidos de líneas celulares de cáncer diferentes.

Adaptación de 3' amplificación rápida del CDNA termina para asignar las transcripciones en el cáncer

Secuenciación de próxima generación (NGS) es una poderosa herramienta para la caracterización genómica que está limitada por la tasa alta de error de la plataforma (~0.5–2.0%). Describimos nuestros métodos de corrección de error de la secuencia que nos permiten obviar la tasa de error NGS y detectar mutaciones en fracciones de alelo variante tan raros como 0.0001.

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

La identificación de interacciones físicas entre los genes y elementos reguladores es un reto, pero ha sido facilitada por los métodos de captura de conformación de cromosoma. Esta modificación al Protocolo de 4C-seq mitiga sesgo PCR minimizando la amplificación excesiva de plantillas de PCR y maximiza el mappability de Lee mediante la incorporación de un paso de síntesis de enzima de la restricción además.

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

Los ARN circulares (arnar) son ARN no codificantes que pueden tener funciones en la regulación transcripcional y en las interacciones mediantantes entre proteínas. Tras la evaluación de los diferentes parámetros para la construcción de bibliotecas de secuenciación de circRNA, se compiló un protocolo utilizando la preparación total de la biblioteca de ARN varada con el pretratamiento RNase R y se presenta aquí.

Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN

Este protocolo presenta una herramienta rápida y útil para evaluar el papel de una proteína con la función uncharacterized en la regulación que empalma alternativa después del tratamiento quimioterapéutico.

Uso de la herramienta E1A Minigene para estudiar los cambios en el empalme de ARNm

La secuenciación de ARN de cuantificación absoluta (AQRNA-seq) es una tecnología desarrollada para cuantificar el panorama de todos los ARN pequeños en mezclas biológicas. Aquí, se demuestran los pasos de preparación de la biblioteca y procesamiento de datos de AQRNA-seq, cuantificando los cambios en el grupo de ARN de transferencia (ARNt) en Mycobacterium bovis BCG durante la latencia inducida por inanición.

AQRNA-seq para cuantificar ARNs pequeños

Las nanomáquinas basadas en DNAzyme se pueden utilizar para la detección altamente selectiva y sensible de ácidos nucleicos. Este artículo describe un protocolo detallado para el diseño de nanomáquinas basadas en DNAzyme con un núcleo 10-23 utilizando software libre y su aplicación en la detección de un fragmento de virus de Epstein-Barr como ejemplo.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas basadas en el reconocimiento de ácidos nucleicos

Aprende a generar ARN circulares mediante minigenes con elementos Alu para estudiar su función y asociación con enfermedades. Este protocolo de biología molecular optimiza condiciones de PCR y ensamblaje de ADN.

Uso de Minigenes que contienen elementos Alu para analizar ARN circulares

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