Un modelo de dos colores BLT humanizados con un microbioma intestinal humano estable y un sistema inmune humano

Nuestro protocolo es significativo, porque se puede utilizar para crear ratones de forma reproducible con un microbioma intestinal humano y un sistema inmunitario humano. Llamamos a estos ratones, ratones humanizados dobles. El modelo de ratón doble humanizado se puede utilizar para la investigación biomédica básica y traslacional, incluyendo el estudio de las relaciones in vivo entre el microbioma intestinal humano y el sistema inmunológico humano.

Demostrando el procedimiento estarán Jianshui Zhang, un postdoctorado, y Yilun Chang, un estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Para implantar el hígado y los tejidos del timo en la cápsula renal izquierda, primero, coloque el ratón en una capucha. El día de la cirugía, tratar a los ratones con irradiación subletal de todo el cuerpo a una dosis de 12 centigrays por gramo de peso corporal.

Afeite cada ratón alrededor del lado izquierdo y el lado medial después de confirmar un nivel adecuado de sedación. Aplique pomada oftálmica a los ojos del animal y aplique una etiqueta para el oído según sea necesario. Desinfectar la piel con tres yodo secuenciales y 70%exfoliantes de isopropanol.

Cuando la piel haya sido preparada, usa fórceps para cargar un fragmento de tejido hepático fetal humano en cubos de uno a seis milímetros en un trocar, seguido de un fragmento de tejido fetal humano de uno a 1,6 milímetros. Usa los fórceps para levantar la piel, y usa un bisturí para hacer un pequeño corte longitudinal en la piel. Extienda el corte a 1,5 a dos centímetros en el lado izquierdo del ratón.

Y usa fórceps para levantar la capa muscular. Utilice tijeras para abrir la capa muscular longitudinalmente, extendiendo el corte según sea necesario para exponer el riñón, y agarre suavemente el tejido graso que rodea el riñón. Utilice un bisturí para hacer una incisión de uno a dos milímetros en el extremo posterior de la cápsula renal e insertar lentamente el trocar precargado en la incisión paralela al eje largo del riñón.

Liberar los tejidos entre la cápsula renal y el riñón, y devolver el riñón y el intestino a sus posiciones normales. Luego, usa suturas para cerrar la capa muscular y grapas quirúrgicas para cerrar la piel. Coloque el ratón en una jaula de microisolador autoclavada con monitoreo hasta la recumbancy completa.

Seis horas después de la cirugía, coloque los ratones bajo una lámpara de calor y desinfecte las colas con 70%isopropanol. Inyectar de 1,5 a cinco veces 10 a los cinco CD34 positivos del tejido hepático fetal humano aislado células madre hemopoyéticas en 200 microlitros de PBS en una vena de cola dilatada por animal. A continuación, detenga cualquier sangrado con una presión suave y devuelva a los ratones a su jaula de origen.

Nueve a 12 semanas después de la cirugía, utilice una restricción de peine plástico de tamaño adecuado para aislar una pierna de un ratón humanizado, y rocíe el lado medial de la pierna aislada con 70%isopropanol. Esparza antibióticos y pomadas para aliviar el dolor en el sitio de la colección. Usando una aguja de calibre 25 sostenida en un ángulo de 90 grados, perfore la vena safenosa para recoger de 50 a 100 microlitros de sangre en un tubo de recolección de sangre recubierto de EDTA.

Cuando se haya obtenido un volumen adecuado de sangre, aplique presión en el sitio con una pieza estéril de gasa para detener el sangrado antes de devolver el ratón a su jaula. A continuación, utilice la muestra de sangre periférica recogida para evaluar el nivel de reconstitución de células inmunitarias humanas mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos contra CD45 humanos, CD3, CD4, CD8, CD19 y ratón CD45. Para la recolección de muestras fecales frescas, coloque bolsas de papel autoclaves individuales en una campana de humo y coloque un ratón en cada bolsa hasta que cada animal defeque.

A continuación, devuelva los ratones a su jaula y use fórceps estériles para transferir cada muestra fecal a un tubo de 1,5 mililitros por ratón para un almacenamiento de menos 80 grados centígrados. Al final del tratamiento antibiótico de 14 días, cambie el agua potable a agua esterilizada autoclavada y transfiera a los ratones a una nueva jaula autoclavada. 24 y 48 horas después del cese de los antibióticos descongelar las fuentes de material de trasplante de microbiota fecal, y aliquot las muestras en una cámara anaeróbica en condiciones anaeróbicas.

Para realizar un trasplante fecal, entregue 200 microlitros de material de trasplante de microbiota fecal a través de gavage oral a cada animal experimental, y esparza cualquier material descongelado restante en el pelaje de ratones humanizados o en la ropa de cama de la jaula. Aquí, se muestra un ejemplo de análisis de citometría de flujo de sangre periférica de un ratón BLT humanizado 10 semanas después de la cirugía. Se pueden identificar las poblaciones de células T y B, así como los subconjuntos de células T positivas CD4 y CD8.

En este gráfico se puede observar la abundancia relativa de las muestras de donantes fecales humanos utilizadas para transferir un microbioma intestinal para crear ratones humanizados dobles. Los cambios fenotípicos en el bazo y el cecum inducidos por el tratamiento antibiótico son similares a los observados en animales libres de gérmenes. Esta gráfica de análisis de componentes principales de los datos representativos de secuenciación de ARN ribosomal 16S revela que los ratones humanizados dobles tienen microbiomas intestinales similares a los humanos que son exclusivos de la muestra de donante humano.

El aspecto más crítico de este protocolo es limitar la introducción de bacterias no deseadas para asegurar que los ratones permanezcan sanos y mantengan el microbioma intestinal humano. Este modelo tiene el potencial de promover la medicina personalizada y permitirnos ver cómo la enfermedad humana afecta el microbioma intestinal mientras se controla para otros factores atenuantes.