Grabaciones electrofisiológicas de corrientes de iones de una sola célula bajo estrés de cizallamiento bien definido

El objetivo de este protocolo es describir una cámara de flujo de placa paralela modificada para su uso en la investigación de la activación en tiempo real de canales iónicos sensibles al mecano sensible por tensión de cizallamiento.

El uso de la cámara de flujo de placa paralela modificada puede ayudar a los investigadores a responder preguntas clave relacionadas con la respuesta funcional de los canales iónicos mecanosensibles al estrés de cizallamiento. La principal ventaja de esta técnica es que permite que la investigación en tiempo real fluya canales iónicos activados en una cámara de flujo de placa paralela fácilmente montada y reutilizable. Para comenzar el procedimiento, aplique una fina capa de solución de elastómero de silicona alrededor de los bordes del espacio rectangular de la pieza C, y coloque suavemente el vidrio de la cubierta rectangular, la pieza D, directamente sobre la solución de elastómero para cubrir completamente el espacio rectangular abierto de la pieza C.Limpie cuidadosamente el exceso de solución de elastómero de silicona.

A continuación, repita el procedimiento para adherir el vidrio de la cubierta rectangular, pieza F, en la parte inferior de la pieza E y permita que la solución de elastómero de silicona se cure durante la noche a temperatura ambiente. Ahora, monte la cámara de flujo MPP colocando secuencialmente cada pieza en la parte superior de la anterior, comenzando con la cámara inferior, la pieza E, luego la pieza C, la pieza B, seguida de la pieza A en la parte superior. A continuación, alinee los orificios de tornillo de cada pieza en las esquinas y atornille firmemente las piezas para evitar que se produzcan fugas mientras se administra el flujo a la cámara de flujo MPP.

En una placa de seis pozos, coloque círculos de vidrio de cubierta de cuatro a cinco, 12 milímetros en cada pozo. Guarde las células entre 10% y 30% de confluencia, de modo que se pueda acceder a células individuales para grabaciones electrofisiológicas. Posteriormente, incubar las células en condiciones de cultivo estándar durante no menos de dos horas para permitir que las células se adhieran, y no más de 24 horas, ya que las células endoteliales se volverán planas y difíciles de parchear cuando se siembran en la subconfluencia durante más de 24 horas.

A continuación, retire un vaso de cubierta que contenga las células adheridas de un pozo de la placa de seis pozos y enjuague rápidamente en PBS. A continuación, transfiera el vaso de la cubierta con las células a un plato petri de 35 milímetros que contenga dos mililitros de solución electrofisiológica de BAF. Transfiera inmediatamente el vidrio de la cubierta con las células a la cámara de flujo MPP.

Transfiera el círculo de vidrio de la cubierta al vidrio de la cubierta rectangular, pieza D, que se adhiere a la pieza C de la cámara de flujo MPP. Agregue la solución BAF para sumergir completamente el círculo de vidrio de la cubierta y las células. Posteriormente, coloque el círculo de vidrio de la cubierta en la pieza D de manera que las células estén en línea con las aberturas de hendidura de la pieza B.Asegúrese de que el círculo de vidrio de la cubierta se adhiere a la pieza D a través de la adhesión del vidrio de la solución para evitar la interrupción de la posición del círculo de vidrio de la cubierta por la aplicación de flujo.

A continuación, monte la cámara de flujo MPP atornillando las piezas en el orden adecuado. Transfiera la cámara a la etapa del microscopio e infuda inmediatamente la cámara con solución BAF. A continuación, identifique una célula sana con un borde oscuro y un núcleo obvio para el experimento.

Evite las células que parecen estar sonrojadas o las células que están en contacto con otras células. Para controlar la tensión de cizallamiento, configure un sistema de perfusión por gravedad conectando un cilindro de jeringa graduada de 30 mililitros a una cerradura Luer de tres vías equipada con tubos de microbore. A continuación, conecte el cilindro graduado a la jaula de Faraday que rodea la plataforma de electrofisiología con cinta adhesiva de doble cara.

Antes de insertar el tubo en la cámara MPP, rellene previamente la jeringa y el tubo con solución BAF. A continuación, inserte el tubo en el orificio de entrada de la cámara de flujo MPP de la pieza A.Precarte la cámara de flujo MPP con solución, de manera que se esté retirando en el depósito de vacío. Detenga el flujo a la cámara y rellene el cilindro graduado hasta la marca superior.

Calcule el caudal manualmente utilizando un cronómetro permitiendo que la solución fluya a través de la cámara a una altura de cilindro de jeringa dada. Levante o baje la jeringa para alterar el flujo y calcular la tensión de cizallamiento en una cámara paralela utilizando esta ecuación. Repita este proceso hasta que se encuentre el nivel deseado de tensión de cizallamiento.

Posteriormente, transfiera una cámara montada que contenga células adheridas a la etapa del microscopio de la plataforma de electrofisiología. E inserte el tubo, precargado con solución BAF, en el agujero de la pieza A.Then, llene la cámara y lave las celdas con 10 mililitros de solución BAF, simultáneamente. Una vez que la configuración de parche deseada se obtenga con éxito, permita que las corrientes de canal se estabilicen en un baño estático a temperatura ambiente.

Tan pronto como las corrientes se hayan estabilizado, aplique la cizalladura de una manera gradual, permitiendo que el aumento de la corriente se estabilice antes del siguiente paso del aumento del estrés de cizallamiento. Elimine la exposición al cizallamiento a las células deteniendo el flujo a la cámara, permitiendo que las corrientes de canal mecanosensibles vuelvan a las corrientes basales observadas en el baño estático. Aquí se muestra una grabación en bruto representativa de kir actual de una célula endotelial mesentérica del ratón primario con corriente de fuga externa lineal notable.

Se aplicó una rampa de 140 a 40 milivoltios positivos al parche durante 400 milisegundos. La corriente de fuga impide el análisis de la actividad real del canal Kir. Para restar corriente de fuga, primero calcule la conductividad de pendiente lineal de la corriente de fuga.

Múltiples pendientes G por voltajes correspondientes de toda la traza bruta para trazar la corriente de fuga en los datos sin procesar. La línea debe superponer la fuga lineal externa exactamente. A continuación, restar la corriente de fuga trazada de toda la traza para que la corriente externa lineal sea aproximadamente cero picoamperios por picofarad, y se pueda analizar la corriente Kir real.

Lo más importante a recordar al intentar este procedimiento es colocar correctamente el vidrio de la cubierta en la cámara para que las células sean accesibles para los experimentos. Además, asegúrese de que el resbalón de la cubierta esté adecuadamente adherido a la pieza D, de modo que el flujo de fluido no interrumpa el vidrio de la cubierta que contiene las células.