Name: Caracterizar a los mutantes relacionados con enfermedades de los kinases familiares de la RAF mediante el uso de un conjunto de métodos prácticos y factibles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprenda a caracterizar mutantes de kinasas RAF relacionados con enfermedades mediante ensayos de kinasa in vitro, coactivación y luciferasa. Estos métodos sensibles y reproducibles facilitan el estudio de mecanismos celulares.

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A los autores les gustaría reconocer la Beca de Leucemia de Células Peludas por el apoyo de Yuan Jimin. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Asia Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), Beca de Investigación (AM/TP011/2018).

1. Ensayo In Vitro Kinase para medir la actividad catalítica de los mutantes de la RAF
<ol><li>Construir vectores que codifican mutantes de la RAF (Figura1A) con la etiqueta FLAG(DYKDDDDK) en C-terminus mediante el uso de Gibson Assembly o métodos tradicionales de clonación molecular.
	<ol>
<li>Introducir la etiqueta FLAG y las mutaciones en las secuencias de codificación de la RAF por PCRs, y luego insertar secuencias enteras en el vector pCDNA3.1(+) utilizando el ensamblaje Gibson o la ligadura de ADN T4 y siguiendo los protocolos de la fabricación. Utilice las siguientes condiciones para las reacciones de PCR: (1) 95 oC, 2 min; (2) 95 oC, 30 s; (3) 59 oC, 30 s; (4) 68 oC, 3 min; (5) 20 ciclos de (2 a 4); (6) Retención de 4 oC. NOTA: Las imprimaciones PCR para clonación: 5- AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 y 5-CAGCGGGTTTAAACGCCCTCTA-3.</li>
		<li>Inserte la secuencia de codificación GST aguas arriba de las secuencias de codificación mutantes de la RAF para generar vectores que codifican mutantes de la RAF fusionados con GST utilizando los mismos métodos que se describen en el paso 1.1.1.</li>
		<li>Validar todos los vectores mediante secuenciaciones de ADN antes de la transfección.</li>
	</ol></li>
	<li>Placa 293T células en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 x 105 células / bien un día antes de la transfección. Cuando la densidad celular alcanza una confluencia del 80-90% en el segundo día, transfect con vectores que codifican las quinasas RAF etiquetadas por FLAG o sus mutantes desde el paso 1.1 en las celdas siguiendo el protocolo de reactivación de la transfección de la fabricación (Tabla de materiales).</li>
	<li>Reemplace el medio de cultivo 24 h después de la transfección.</li>
	<li>Aspirar el medio de cultivo 48 h después de la transfección y añadir 400 l/pozo de tampón de lisis (25 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1 mM ácido etilendiaminetetraacético (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) complementado con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa a las células de la lepíza en el hielo. NOTA: La concentración de NP-40 en el tampón de lisis es fundamental para detectar la actividad catalítica de los mutantes de la RAF con afinidad/estabilidad de dimer moderada in vitro. Una alta concentración de detergente o un detergente fuerte en el tampón de lisis puede romper los dimers de la RAF y así matar la actividad catalítica de las quinasas de la RAF o sus mutantes.</li>
	<li>Transfiera los lysates celulares a un tubo de 1,5 ml, y gire hacia abajo por 12.000 x g durante 10 minutos a 4 oC para agotar los desechos celulares.</li>
	<li>Transfiera 300 ml por muestra de lyalatos de células enteras limpias a tubos de 1,5 ml, agregue 20 ml por muestra de perlas de afinidad anti-FLAG y gire en una cámara fría (4 oC) durante 1 h. También tome a un lado 40 l por muestra de isladez de células enteras limpias para detectar la expresión y la actividad (fosfo-ERK1-2) de los mutantes de la RAF por inmunoblots como se describe a continuación.</li>
	<li>Lavar las perlas anti-FLAG una vez con tampón de lisis, luego una vez con tampón de reacción quinasa (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 mM Na3VO4, 0,5 mM dTT, pH 7.2), y añadir 20 s de mezcla de reacción quinasa (2 g de MEK1(K97A) y 100M de ATP en 20 buffer de acción) por muestra. NOTA: El lavado de cuentas debe completarse suavemente y rápidamente, el tampón residual debe aspirarse completamente antes de añadir la mezcla de reacción quinasa, y todas las operaciones en este paso deben llevarse a cabo a 4 oC en una cámara fría.</li>
	<li>Incubar las reacciones de la quinasa a temperatura ambiente (25 oC) durante 10 minutos, y voltear los tubos que contienen reacciones de quinasa con los dedos cada dos minutos durante la incubación.</li>
	<li>Añadir 5 l de búfer de muestra SDS de 5x (375 mM Tris HCl, 9% sulfato de dodecilo sódico (SDS), 50% glicerol, 0.03% Bromofenol Blue) por muestra para detener las reacciones de quinasa, y luego calentar las muestras a 90 oC durante 5 min.</li>
	<li>Ejecuta las muestras en electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) de 9-12% con 0,1% de SDS, transfiere las proteínas a la membrana de nitrocelulosa y detecta los niveles de fosfo-MEK y mutantes de la RAF en las muestras por inmunoblots. NOTA: El fosfo-MEK también se puedecuantificar mediante el uso de la incorporación de P-ATP 32. En resumen, se añaden 10 M a32P-ATP al búfer de reacción quinasa, y la cantidad de MEK fosforilado se cuantifica después de la separación de PAGE mediante el uso de autoradiografía estándar, fosforfación o técnicas de recuento de centelleo líquido como Apropiado.</li>
</ol>2. Ensayo de coactivación de la RAF para evaluar la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos por Kinase
<ol><li>Construir vectores que codifican el receptor RAF (dominio de quinasa CRAF con motivo NtA no fosforilable, AAFF) o los activadores de la RAF muertos de quinasa (dominio de quinasa de la RAF con motivo NtA imitado por fosforilación, SSDD, DDEE o DGEE) (Figura1A) como descrito en el paso 1.1.</li>
	<li>Células 293T transfect con dos vectores que codifican tanto el receptor RAF como el activador RAF muerto de quinasa o un solo vector que codifica una de las proteínas como se describe en los pasos 1.2 y 1.3.</li>
	<li>Reemplazar el medio de cultivo a las 24 h después de la fecundidad, y cosechar 293T transfectantes a 48 h para preparar los lysates de células enteras como se describe en los pasos 1.4 y 1.5.</li>
	<li>Mezcle el lisado limpio de células enteras con 5 tampón de muestra SDS rápidamente a temperatura ambiente (25 oC) y luego hierva a 90 oC durante 5 min.</li>
	<li>Ejecuta las muestras de lisato de células enteras hervidas en una página de 9 a 12% con 0,1% de SDS, transfiere las proteínas a la membrana de nitrocelulosa y detecta los niveles de fosfo-ERK1/2 y controla las proteínas por inmunofunción.</li>
</ol>3. Ensayo de Luciferasse dividido gratuito para medir la afinidad/estabilidad relativa del dimer de los mutantes de la RAF
<ol><li>Construir vectores que codifican mutantes RAF etiquetados con FLAG fusionados con el Término N de Nluc (N-terminus de luciferasa de luciérnaga, aa2-416) o el Término C de Cluc (C-terminus de luciérnaga, aa398-550) como se describe en el paso 1.1.</li>
	<li>Células 293T transfectos con un par de vectores que codifican diferentes mutantes Nluc-RAF y mutantes Cluc-RAF como se describe en el paso 1.2.</li>
	<li>A las 24 h después de la transfección, replacar 293T transfectan de células en placas de imagen negra Krystal a la densidad celular de 2x105 por pozo con medio libre de color (es decir, DMEM sin rojo fenol).</li>
	<li>24 h más tarde, añadir D-luciferina (0,2 mg/ml) a 293T transeftantes celulares, incubar durante 30 minutos y medir las señales de luciferasa utilizando un sistema de detección múltiple (Tablade materiales).</li>
	<li>Después de medir las señales de luciferasa, aspirar los transfectudores medio y de lise 293T con tampón de lisis para preparar los líticos de células enteras como se describe en los pasos 1.4 y 1.5.</li>
	<li>Ejecuta las muestras de lisados de células enteras en una página de 9 a 12% con 0,1% de SDS y detecta los niveles de expresión de mutantes Nluc-RAF y mutantes de Cluc-RAF mediante inmunoblot anti-FLAG como se describe en el paso 2.5. Los niveles de expresión relativos del mutante Nluc-RAF y del mutante Cluc-RAF en los transfectudores 293T se cuantifican mediante el uso de la imagen J de sus inmunoblots.</li>
	<li>Normalizar las señales de luciferasa de los transefectos celulares 293T de acuerdo con los niveles de expresión de los mutantes Nluc-RAF y Cluc-RAF mutantes. Brevemente, esto se logra dividiendo la señal de luciferasa cruda por los niveles de expresión relativa de los mutantes Nluc-RAF y los mutantes cluc-RAF del paso 3.6.</li>
</ol>

<ol><li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li>
<li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAF+proteins+take+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li>
<li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+nature%3A+biological+functions+of+the+Raf-1+%22kinase%22%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li>
<li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li>
<li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+kinases%3A+oncogenesis+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li>
<li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li>
<li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+Raf%2FMEK%2FERK+pathway+in+cell+growth%2C+malignant+transformation+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Biophysics+Acta%22%5BJournal%5D)">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li>
<li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li>
<li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li>
<li>Garnett, M. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guilty+as+charged%3A+B-RAF+is+a+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene.</a> Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).</li>
<li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).</li>
<li>Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+and+tyrosine+phosphorylations+cooperate+in+Raf-1%2C+but+not+B-Raf+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation.</a> EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+functionally+asymmetric+RAF+kinase+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers.</a> Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).</li>
<li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alike+but+different%3A+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li>
<li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li>
<li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinases+and+pseudokinases%3A+lessons+from+RAF%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li>
<li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudokinases+from+a+structural+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li>
<li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li>
<li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795(2018).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li>
<li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF%28V600E%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras%2C+CRAF+and+BRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li>
<li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinases%3A+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochemistry+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li>
<li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li>
<li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li>
<li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li>
<li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meaningful+relationships%3A+the+regulation+of+the+Ras%2FRAF%2FMEK%2FERK+pathway+by+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).</li>
<li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22RAF%22+neighborhood%3A+protein-protein+interaction+in+the+Raf%2FMek%2FErk+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li>
<li>García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Interactions%3A+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li>
<li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+regulated+protein%E2%80%93protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li>
<li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li>
<li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF%2C+EGFR%2C+and+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En este artículo, presentamos tres métodos para caracterizar mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad, que incluyen el ensayo de quinasa in vitro, el ensayo de coactivación de la RAF y el ensayo de luciferasa dividida de cortesía. Dado que las quinasas de la RAF tienen actividad catalítica y actividad alostérica, varios mutantes de la RAF pueden activar la señalización aguas abajo a través de dos mecanismos distintos13,14,16<...

Las quinasas de la familia RAF son un componente clave de la cascada de señalización RAS/RAF/MEK/ERK, que transmiten una señal de RAS para activar la proteína quinasa activada por mitogeno (MEK)1,2,3,4. Esta familia de quinasas juega un papel crucial en el crecimiento celular, supervivencia ydiferenciación, y sus alteraciones inducen muchas enfermedades, en particular el cáncer 5,6,7,8. Recientemente, las secuenciaciones genómicas han identificado muchos mutantes de la RAF relacionados con enfermedades que exhiben diferentes propiedades en la transmisión de señal de LA cascada RAS/RAF/MEK/ERK9,10,11. Una caracterización cuidadosa de los mutantes de la RAF nos ayudará a entender los mecanismos moleculares de cómo los mutantes de la RAF alteran la salida de señal de la cascada RAS/RAF/MEK/ERK, eventualmente seleccionar enfoques apropiados para tratar varias enfermedades impulsadas por mutantes de la RAF.
Las quinasas de la familia RAF incluyen tres miembros, CRAF, BRAF y ARAF, que tienen estructuras moleculares similares pero diferentes capacidades para activar la señalización aguas abajo1,2,3,4. Entre estos paralogs, BRAF tiene la actividad más alta en virtud de su constitutivamente fosforilado NtA (N-terminal a cidic) motivo12,13,14, mientras que ARAF tiene el más bajo actividad derivada de su motivo APE no canónico15. Esto puede explicar las diferentes frecuencias de mutación de los paralogos de la RAF en enfermedades: BRAF>CRAF>ARAF. Además, dentro del mismo paralog de la RAF, las mutaciones en diferentes sitios pueden desencadenar la señalización aguas abajo de maneras distintas, lo que añade otra capa de complejidad a la regulación de las quinasas familiares de la RAF. Estudios recientes han demostrado que todas las quinasas de la RAF tienen actividades catalíticas y alostéricas13,14,16,17,18. Los mutantes de la RAF constitutivamente activos activan la señalización aguas abajo directamente mediante el fósforo MEK, mientras que los mutantes de la RAF muertos de quinasa pueden transactivar sus contrapartes de tipo salvaje a través de la dimerización de lado a lado y activar la señalización MEK-ERK16 ,19,20. La afinidad/estabilidad dimer es un parámetro clave que no sólo determina la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa, sino que también afecta a la actividad catalítica de los mutantes constitutivamente activos de la RAF15,21, 22. Los mutantes de la RAF muertos de quinasa con alta afinidad/estabilidad dimer pueden transactivar los RAF endógenos directamente15,mientras que aquellos con afinidad/estabilidad dimer intermedia requiere una coordinación de Ras activo o un nivel elevado de moléculas de tipo salvaje de la RAF para funcionar13,15,20,21,23. Del mismo modo, los mutantes constitutivamente activos de la RAF fosforilan MEK de una manera dimer-dependiente, y aquellos con baja afinidad/estabilidad dimer pierden su actividad catalítica in vitro tras la inmunoprecipitación que rompe los débiles atenuadores de la RAF15, 21,22. La afinidad/estabilidad dimer también determina la sensibilidad de los mutantes de la RAF a sus inhibidores, y se correlaciona positivamente con la resistencia de los inhibidores de la RAF24. Por lo tanto, para caracterizar a los mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad, es necesario medir sus actividades catalíticas y alostéricas, y la afinidad/estabilidad del dimer.
En los últimos años, nuestro laboratorio y otros han desarrollado varios métodos para caracterizar a las quinasas familiares de la RAF y sus mutantes. Según nuestro laboratorio y la experiencia de otros, creemos que los siguientes tres ensayos tienen ventajas en la definición de mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad: (1) el ensayo de quinasa in vitro que se puede llevar a cabo con facilidad para detectar la actividad catalítica de la mutantes activos de la RAF15; (2) el ensayo de coactivación de la RAF que es un método fiable y conveniente para medir la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa13,15,21,22,23, 25; (3) el ensayo gratuito de luciferasa dividida que tiene una sensibilidad mucho mayor en la medición de la afinidad/estabilidad relativa de los mutantes de la RAF en contraste con el ensayo tradicional de coinmunoprecipitación, y es capaz de llevar a cabo sin equipo avanzado en en contraste con los métodos analíticoscuantitativos como el análisis SPR (S urface Plasmon Resonance)15,22. Combinando estos tres ensayos, podemos entender fácilmente cómo un mutante de la RAF relacionado con la enfermedad altera la señalización aguas abajo y así utilizar una estrategia terapéutica apropiada para tratar la enfermedad causada por esta mutación de la RAF.

<table><tbody><tr><td>anti-fosfoERK1/2</td><td>Tecnologías de señalización celular</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>anti-fosfoMEK1/2</td><td>Tecnologías de señalización celular</td><td>9154</td><td></td></tr><tr><td>anti-ERK1/2</td><td>AB clonal</td><td>A0229</td><td></td></tr><tr><td>anti-MEK1/2</td><td>Tecnologías de señalización</td> celular <td>9124</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG(ratón)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anti-HA</td><td>Novus Biologicals</td><td>MAB6875</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG(Conejo)</td><td>Tecnologías de señalización celular</td><td>14793</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-actina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>perlas anti-FLAG(M2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4596</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugado anti-ratón IgG</td><td>Jackson Laboratories</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugado anti-conejo IgG</td><td>Jackson Laboratories</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>In vitrogen</td><td>V79020</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning&nbsp; Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Roche</td><td>11 814 443 001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sin rojo de fenol</td><td>Invitrogen</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina&nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>6xhis-tagged MEK1 (K97A)</td><td>&nbsp; preparados en nuestros estudios previos</td><td>N.A.</td><td>Referencia 15.</td></tr><tr><td>Sistema de detección GloMax-Multi.</td><td>Promega</td><td>E7041</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterizar a los mutantes relacionados con enfermedades de los kinases familiares de la raf mediante el uso de un conjunto de métodos prácticos y factibles

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Las quinasas familiares de fibrosarcoma (RAF) aceleradas rápidamente desempeñan un papel central en la biología celular y su disfunción conduce a cánceres y trastornos del desarrollo. Una caracterización de los mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad nos ayudará a seleccionar estrategias terapéuticas adecuadas para el tratamiento de estas enfermedades. Estudios recientes han demostrado que las quinasas familiares de la RAF tienen actividades catalíticas y alostéricas, que están estrictamente reguladas por la dmerización. Aquí, construimos un conjunto de métodos prácticos y factibles para determinar las actividades catalíticas y alostéricas y la relativa afinidad/estabilidad de la familia de la RAF y sus mutantes. En primer lugar, modificamos el ensayo clásico de quinasa in vitro reduciendo la concentración de detergente en tampones, utilizando un procedimiento de lavado rápido suave y empleando una fusión de glutatión S-transferasa (GST) para evitar que los dimers de la RAF se disocieran durante Purificación. Esto nos permite medir la actividad catalítica de los mutantes constitutivamente activos de la RAF apropiadamente. En segundo lugar, desarrollamos un nuevo ensayo de coactivación de la RAF para evaluar la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa mediante el uso de proteínas de la RAF truncadas en Terminal N, eliminando el requisito de Ras activo en los protocolos actuales y logrando así un mayor Sensibilidad. Por último, generamos un ensayo complementario único de luciferasa dividida para medir cuantitativamente la afinidad/estabilidad relativa de dimer de varios mutantes de la RAF, que es más confiable y sensible en comparación con el ensayo tradicional de coinmunoprecipitación. En resumen, estos métodos tienen las siguientes ventajas: (1) fácil de usar; 2) capaz de llevar a cabo eficazmente sin equipos avanzados; 3) rentable; (4) altamente sensible y reproducible.

Las quinasas de la familia RAF tienen actividades catalíticas y alostéricas, que permiten a sus mutantes relacionados con la enfermedad encender la señalización aguas abajo a través de diferentes mecanismos13,14,16,17 ,18. Los mutantes constitutivamente activos de la RAF fosforilan directamente sus sustratos, mientras que los mutantes de la RAF muertos de qui...

En este artículo, presentamos un conjunto de métodos prácticos y factibles para caracterizar mutantes relacionados con enfermedades de quinasas familiares de la RAF, que incluyen el ensayo de quinasa in vitro, el ensayo de coactivación de la RAF y el ensayo complementario de luciferasa dividida.

Caracterizar a los mutantes relacionados con enfermedades de los kinases familiares de la RAF mediante el uso de un conjunto de métodos prácticos y factibles

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Este método facilita la caracterización efectiva de los métodos de quinasa de la RAF relacionados con la enfermedad. Esta técnica es altamente sensible y reproducible, rentable, fácil de usar y no requiere ningún equipo avanzado. Para medir la actividad catalítica de los mutantes de la RAF, introduzca mutaciones tecnológicas de bandera en la secuencia de codificación de la RAF por PCR, antes de insertar secuencias enteras en el vector apropiado de acuerdo con los protocolos estándar.Inserte el glutatión como secuencia de codificación transferasa aguas arriba de las secuencias de codificación mutantes de la RAF, para generar vectores que codifican glutatión como mutantes RAF fusionados con transferasa, de la misma manera. Transvect 80%to 90%confluent 293T cultivos celulares con los vectores que codifican la bandera etiquetada quinasas RAF o sus mutantes, de acuerdo con los protocolos de estándares. Después de 24 horas de cultivo, reemplace el medio en cada cultura.Después de 48 horas de cultivo, añadir 400 microlitros de tampón de lelisis complementados con inhibidores de la proteasa y fosfatasa, a cada pozo en el hielo. Después de cinco a 10 minutos, transfiera los litos celulares a un tubo de 1,5 mililitros para centrifugación para sedimentar los desechos celulares. Transfiera 300 microlitros de cada muestra a tubos micro centrífugas individuales de 1,5 mililitros.Reservar 40 microlitros por muestra para el análisis de la quinasa regulada por la señal celular extra de lisosato al por mayor aguas abajo una y dos análisis de la expresión y la actividad de la mancha. Añadir 20 microlitros de perlas de afinidad anti-FLAG a cada tubo, para una incubación de una hora con rotación en una sala fría de cuatro grados Celsius. Al final de la incubación lave rápidamente y suavemente las perlas anti bandera una vez con tampón de lelisis en la sala fría y una vez con tampón de reacción quinasa antes de añadir 20 microlitros de mezcla de reacción quinasa.Los mutantes gráficos con una baja afinidad de Dima pueden perder su actividad catalítica in vitro debido a la disociación de Dima. Por lo tanto, el lavado rápido y suave es crítico. Después de 10 minutos a temperatura ambiente con voltear cada dos minutos, detenga las reacciones de quinasa con cinco microlitros de cinco tampones de muestra XSDS, por muestra y hierva las muestras a 90 grados centígrados durante cinco minutos.Al final de la incubación, ejecute las muestras en un gel de electroforesis de poliacrilamida de nueve a 12% con 0,1%SDS, luego transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa para permitir la detección de los niveles de proteína quinasa activada por fosfogeno mitogenio y mutantes RAF en cada muestra, por inmunoinmunismo. Para evaluar la actividad alloestérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa, construye vectores que codifican el receptor de la RAF o los activadores de la RAF muertos de quinasa. Células T Transvect 293 con dos vectores que codifican tanto el receptor RAF como el activador RAF muerto de quinasa, o un solo vector que codifica una de las proteínas como se ha demostrado.Cosecha toda la célula se lysates después de 48 horas de cultivo como se ha demostrado, y mezcle rápidamente el lesate limpio de toda la célula con cinco tampón de muestra XSDS a temperatura ambiente, Antes de hervir los lysates durante cinco minutos a 90 grados Celsius. A continuación, ejecute las muestras de anate de células enteras hervidas en un gel de electroforesis de poliacrilamida de nueve a 12%que es 0.1%SDS y transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa para detectar los niveles de fosfo señal celular extra regulada quinasa uno y dos y controlar las proteínas por hinchazón inmune como se ha demostrado. Para medir la afinidad relativa de los dimer y la estabilidad de los mutantes de la RAF construir vectores que codifican los mutantes de borrador de bandera fusionados con el terminal de Firefly luciferase o el C Terminus una luciferasa de luciélubán.Células T Transvect 293 con un par de vectores que codifican diferentes y Terminus de mutantes de la RAF de luciosa de fuego y C Terminus un mutante de la RAF luciferasa luciosa de fuego como se demuestra. 24 horas después de la transvección replateación dos veces 10 a la quinta 293 transacciones de células T por pozo en placas de imagen de color negro cristalino. 48 horas después de la travesía añadir la luciferina a 293 transvectentes de células T e incubar durante 30 minutos.Antes de medir las señales de luciferasa en un sistema de detección múltiple. Al final de la medición aspirar los sobrenadantes, y blice las transacciones de 293 células T con búfer de lysas como se demostró. Ejecuta las muestras de izado celular completo en un gel de electroforesis de poliacrilamida de nueve a 12% con 0,1%SDS.Detectar los niveles de expresión de la terminal final de Firefly luciferase RAF mutantes, o la terminal C de Firefly luciferase RAF mutantes por anti bandera amino blot como se demostró. Luego normalizar las señales de luciferasa de los 293 transvectantes de células T de acuerdo con los niveles de expresión de la terminal final de Firefly luciferase y C terminus de firefly luciferase RAF mutantes. La quinasa asa in vitro se puede utilizar para sondear eficazmente la actividad catalítica de algunos mutantes de la espina dorsal R constitutivamente activos, pero no la de los mutantes muertos de quinasa con una espina C fusionada.La actividad catalítica de mutantes de la RAF constitutivamente activos con una débil afinidad de dimer o estabilidad sin embargo, podría no ser sondeada usando este ASA ya que sus dimers se rompen durante el proceso de purificación. Para evitar la pérdida de actividad catalítica de los mutantes de la RAF con una débil afinidad o estabilidad dimer, estos mutantes se pueden fusionar con glutothionas transferase para rescatar la actividad catalítica de los mutantes. La activación conjunta de la RAF ASA se puede utilizar para evaluar la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa.Como los mutantes muertos de quinasa ilustrados con un motivo terminal extremo ácido y fusión de la columna vertebral C, funcionan como activadores alostéricos para desencadenar la actividad catalítica de los mutantes con un motivo terminal extremo ácido no fósforo relacionable, cuando se expresa co en células 293T. Además, se puede utilizar una luciferasa dividida gratuita SA para medir la afinidad relativa de dimer o la estabilidad de las quinasas familiares de la RAF y sus mutantes. El uso de un tampón de lysas con una baja concentración de detergente, y un procedimiento de lavado suave y rápido durante la purificación de la muestra es esencial para una SA quinasa in vitro exitosa. Esta técnica ayudará a los investigadores a determinar con precisión cómo la enfermedad transmite a los mutantes de la RAF, activar la vía descendente, facilitando la selección de estrategias terapéuticas adecuadas para el tratamiento de la enfermedad.

characterize-disease-related-mutants-raf-family-kinases-using-set

Research

Investigación

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Cancer Research

Investigación del cáncer

Quinasa con repeticiones ricas en leucina 2 es una quinasa multidominio grandes, las mutaciones en el que son la causa genética más común de enfermedad de Parkinson. Análisis de la actividad quinasa de la proteína ha demostrado ser una herramienta crucial en la comprensión de la biología y la disfunción de esta proteína. En este...

Ensayo de la actividad quinasa de LRRK2 In vitro</em

Aparición de resistencia genética contra la terapia con inhibidores de quinasa plantea reto significativo para la terapia del cáncer eficaz. Identificación y caracterización de mutaciones resistentes contra un fármaco recientemente desarrollado ayuda a una mejor gestión clínica y el diseño de fármacos de próxima generación. A continuación, describimos nuestro protocolo para la detección in vitro y la validación de las mutaciones resistentes.

Un método para la detección y validación de mutaciones de resistencia contra la quinasa Inhibidores

Las proteínas quinasas son enzimas de señalización altamente evolucionadas y andamios que son críticos para la transducción de señales inter e intracelulares. Se presenta un protocolo para medir la actividad quinasa mediante el uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), un método fiable para ayudar a la elucidación de la regulación de señalización celular.

Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

El presente estudio describe un método sencillo de detectar niveles endógenos de la fosforilación Rab10 quinasa repetición rica en leucina 2.

Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

Aquí, presentamos un protocolo para matrices de anticuerpo para identificar alteraciones en las vías de señalización en distintos modelos celulares. Estos cambios, causados por drogas/hipoxia/ultra-violet luz radiación, o sobreexpresión/downregulation/nocauts, son importantes para varios modelos de la enfermedad y pueden indicar si una terapia eficaz o puede identificar mecanismos de drogas resistencia.

Evaluación de la resistencia a inhibidores de la cinasa de tirosina por un interrogatorio de vías de transducción de señal por Arrays de anticuerpos

Caracterizamos una nueva proteína quinasa utilizando enfoques bioquímicos robustos: análisis de Western Blot con un anticuerpo específico específico específico específico en diferentes líneas y tejidos celulares, interacciones por experimentos de coinmunoprecipitación, actividad quinasa detectada por Western Blot usando un anticuerpo fosfo-específico y por el etiquetado ATP de32P.

Caracterización a nivel molecular utilizando enfoques bioquímicos robustos de una nueva proteína kinasa

Se presenta un protocolo detallado para la generación de microarrays de proteínas humanas autoensamblados para el cribado de inhibidores de la quinasa.

Detección de inhibidores de la quinasa en microarrays de proteínas humanas autoensamblados

Este protocolo describe un ensayo basado en BRET para medir las interacciones de la quinasa CRAF con las proteínas 14-3-3 en células vivas. El protocolo describe los pasos para la preparación de las celdas, la lectura de las emisiones BRET y el análisis de datos. También se presenta un ejemplo de resultado con la identificación de los controles adecuados y la resolución de problemas para la optimización del ensayo.

Ensayo basado en transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) para medir las interacciones de CRAF con proteínas 14-3-3 en células vivas

La genética química implica la sustitución de un residuo guardián por un aminoácido que contiene una cadena lateral diferente en el locus objetivo. Aquí, hemos generado un parásito mutante que contiene un alelo hipomórfico de cdpk1 e identificado las vías compensatorias adoptadas por el parásito en el fondo mutante.

Comprender el desarrollo de vías compensatorias en un parásito mutante de la malaria que alberga un alelo hipomórfico de quinasas similares a las plantas

Este protocolo describe el diseño, la creación y la aplicación de las fosfatasas reguladas por rapamicina. Este método proporciona una alta especificidad y un estricto control temporal de la activación de la fosfatasa en las células vivas.

Desarrollo y aplicación de tirosina fosfatasas reguladas por rapamicina

Las rasopatías son síndromes genéticos multisistémicos causados por la hiperactivación de la vía RAS-MAPK. Las variantes potencialmente patógenas que están a la espera de validación surgen continuamente, mientras que la escasa evidencia preclínica limita el tratamiento. Aquí, describimos nuestro protocolo in vivo para probar y validar los niveles de activación de ERK asociados a RASopatía y su modulación farmacológica durante la embriogénesis mediante imágenes FRET en vivo en pez cebra...

Un protocolo eficiente para evaluar la modulación de la actividad de ERK en modelos tempranos de síndrome de Noonan de pez cebra mediante microscopía FRET en vivo e inmunofluorescencia

Aprenda a caracterizar mutantes de kinasas RAF relacionados con enfermedades mediante ensayos de kinasa in vitro, coactivación y luciferasa. Estos métodos sensibles y reproducibles facilitan el estudio de mecanismos celulares.

Caracterizar a los mutantes relacionados con enfermedades de los kinases familiares de la RAF mediante el uso de un conjunto de métodos prácticos y factibles (Video) | JoVE Journal

Caracterizar a los mutantes relacionados con enfermedades de los kinases familiares de la RAF mediante el uso de un conjunto de métodos prácticos y factibles

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