Detección de parásitos de tripanosoma extravascular por aspiración de aguja fina

La citología de aspiración con aguja fina es una técnica económica, simple, rápida y mínimamente invasiva que utilizamos para recoger tripanosomas de lesiones palpables en órganos en ratones vivos. Dado que la aspiración con aguja fina es un procedimiento no terminal, permite el muestreo repetido en el mismo animal con el tiempo. Si estos hallazgos se pueden traducir al ganado, este método será muy útil para que los veterinarios diagnostiquen la tripanosomiasis en el ganado en una granja.

Demostrando el procedimiento de tinción de frotis estará Ana Margarida Santos, una asistente de tecnóloga de mi laboratorio. Para comenzar, confirme la anestesia con el método de pellizcar el dedo del dedo del dedo del dedo del Cuando el reflejo de la retracción de la pierna está ausente, coloque el ratón en la reclinación dorsal.

Palpa cuidadosamente los testículos para determinar el tamaño y la distancia de la piel superada y luego restringirlo entre el índice y el dedo medio o entre el dedo índice y el pulgar. Para inmovilizar aún más el objetivo, estire la piel superada firmemente y limpie la superficie con toallitas de alcohol. A continuación, inserte la punta de la aguja de una aguja de calibre 23 conectada a una jeringa de cinco mililitros en el objetivo asegurándose de que el émbolo esté en el estado de resto.

Para aplicar la succión, retraiga el émbolo de la jeringa a la marca de tres a cuatro milímetros de dos a tres veces. Para aumentar la probabilidad de obtener una muestra representativa y de apuntar a estructuras más pequeñas como el epidídimo, redirija la aguja dentro del órgano ya sea en línea recta o a lo largo de varias tangentes diferentes. Suelte la succión y luego retire la aguja.

La aguja solo se puede extraer después de que se libere la presión negativa soltando el émbolo. De lo contrario, el aspirado se aspira en la jeringa y es irrecuperable. Aplique presión con una esponja de gasa estéril en el lugar de la punción para controlar cualquier sangrado.

Desconecte la jeringa de la aguja y llénala con aire. Vuelva a conectar la aguja, coloque la punta de la aguja muy cerca o incluso en el portaobjetos y expulse suavemente el contenido de la aguja sobre el portaobjetos. Para garantizar el muestreo de réplica, realice al menos una aspiración adicional por órgano y animal.

Después de revertir la anestesia con una inyección subcutánea de 200 microlitros de un miligramo por kilogramo de Atipamezol en solución salina, devolver a los animales a su jaula de origen para su recuperación. Usando la mano nonteminante, levante la diapositiva que tiene la gota de aspirar pellizcando el extremo esmerilado entre el pulgar y el dedo índice. Con la mano dominante, recoja un deslizador limpio y colóquelo borde limpio y liso a través de la segunda diapositiva justo en la parte superior de la caída en un ángulo de aproximadamente 30 grados.

Para obtener una película delgada, deslice el deslizamiento hacia adelante con un movimiento continuo y constante. Descanse el portaobjetos y permita el secado por aire completo y rápido del material. Etiqueta el borde esmerilado de la diapositiva con un lápiz.

Para el protocolo de tinción Giemsa, fije las manchas secas al aire sumergiendo las diapositivas en un frasco de Coplin que contenga 100% metanol durante cinco minutos. A continuación, transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin que contenga una solución de 20%Giemsa y agua destilada durante 30 minutos. Enjuague los portaobjetos en agua del grifo y toque con papel tisú para secar bien.

Mientras sostiene la diapositiva horizontalmente, aplique varias gotas de medio de montaje no acuoso sobre el frotis. Coloque el borde de un vaso de cubierta en el portaobjetos, tírelo y presione suavemente para eliminar cualquier burbuja de aire. Para la inmunocitoquímica, fijar frotis secos al aire en 100%metanol a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Lave la diapositiva durante cinco minutos en un frasco de Coplin con 1X PBS repitiendo este paso tres veces usando 1X PBS fresco cada vez. Después de retirar las diapositivas del frasco de Coplin, limpie el exceso de tampón sin tocar el frotis y dibuje una línea alrededor de la mancha con una pluma repelente al agua. Mientras sostiene el portaobjetos horizontalmente, aplique 150 microlitros de solución de anticuerpos primarios diluidos a cada frotis e incubar durante una hora a temperatura ambiente.

Después de la incubación, lave los portaobjetos durante cinco minutos en un frasco de Coplin con 1X PBS repitiendo este paso tres veces usando 1X PBS fresco cada vez. Mientras sostiene el portaobjetos horizontalmente, aplique 150 microlitros del sistema de visualización DAB de rábano de caballo disponible comercialmente a cada frotis y luego incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos de nuevo tres veces durante cinco minutos en PBS.

A continuación, contraataque sumergiendo las diapositivas en un frasco de Coplin que contenga hematoxilina Harris durante 10 segundos. Enjuagar en agua del grifo y enjuagar con papel para secar bien. Mientras sostiene la diapositiva horizontalmente, aplique varias gotas de medio de montaje no acuoso sobre el frotis.

Coloque el borde de un vaso de cubierta en el portaobjetos, tírelo y presione suavemente para eliminar cualquier burbuja de aire. Un frotis de buena calidad se caracterizó por una monocapa de células con buena densidad y características morfológicas preservadas que permiten la identificación de su tejido de origen y la proporción relativa entre sí. Además, los parásitos fueron inmunosutenidos, identificables y contables de manera eficiente.

Los resultados de aspiración de aguja fina deficientes o negativos pueden deberse a un material demasiado bajo y, por lo tanto, bajo la representación de la masa u órgano. También puede deberse a un exceso de material en una sola diapositiva que hace manchas demasiado gruesas y que deteriora la evaluación citológica. El llamado artefacto aplastado ocurre debido a que se aplica demasiada fuerza al hacer el frotis dejando a las células alteradas resultando en una gran cantidad de núcleos desnudos y rayas de ADN.

Cuando no se aplica suficiente fuerza durante la preparación del frotis, las células no se desagregan, lo que resulta en una capa estratificada que impide la evaluación de las características morfológicas de las células. Comparación de la citopatología de aspiración con aguja fina con la histopatología, la citopatología tenía la ventaja de una morfología celular mejor preservada y una mejor evaluación de las proporciones relativas y el recuento de células. La inmunocitoquímica es más simple, rápida y fácil de optimizar que la inmunohistoquímica.

Para la aspiración con aguja fina, asegurar siempre una buena inmovilización del animal, estabilización de los órganos o masa a aspirar, y una aplicación y liberación coordinada de vacío. Luego, para frotis de alta calidad, extiéndalos inmediatamente después de que el material se ha colocado en el vidrio y ser suave en la fuerza aplicada para hacer el frotis para evitar artefactos triturados de la célula. Además de la microscopía de rutina y la inmunocitoquímica, este material también se puede utilizar para microscopía electrónica, análisis bioquímico, citometría de flujo, biología molecular, o incluso para ensayos in vitro.

Esta técnica nos permitió demostrar que la aspiración con aguja fina se puede utilizar para diagnosticar y estudiar enfermedades en animales experimentales. Pudimos diagnosticar el tropismo de los parásitos del Tripanoosoma a los órganos reproductores masculinos externos y también caracterizar esta enfermedad a lo largo de la infección.