Name: Purificación de una proteína de masa molecular alta en Streptococcus mutans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprende a purificar proteínas de alta masa molecular en Streptococcus mutans mediante PCR y cromatografía de afinidad. Este método eficiente facilita el estudio de proteínas membranales en microbiología.

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Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (números de concesión 16K15860 y 19K10471 a T. M., 17K12032 a M. I., y 18K9926 a N. H.) y la Fundación de Ciencia y Tecnología SECOM (SECOM) (número de concesión 2018.09.10 No. 1).

NOTA: La generación de S. mutans gt-fC, en la que toda la región de codificación del gen gtfC se sustituye por spcr, debe completarse antes de realizar estos protocolos. Consulte el artículo publicado para obtener más información sobre la generación5.
1. Diseño de imprimación
<ol><li>
Preparar imprimaciones para la construcción de S. mutans His-gtfC. NOTA: Las secuencias de imprimación utilizadas en este protocolo se muestran en el Cuadro 1. El método PCR de fusión de dos pasos para la generación de S. mutans His-gtfC se ilustra esquemáticamente en la Figura 2.<ol>
<li>Imprimaciones de diseño (gtfC-reverse y spcr-forward) para la fijación de la secuencia de codificación His-tag, interviniendo entre el gen gtfC y spcr (Figura 2A).<ol>
<li>Incluya el vinculador GS y la secuencia de codificación His-tag en las imprimaciones gtfC-reverse y spcr-forward, en las que 24 bases en las regiones de 5' son complementarias entre sí. NOTA: La secuencia de aminoácidos del vinculador GS y Su etiqueta (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His) se une al término C de GTF-SI a través de la traducción genética.</li>
			<li>Diseñar una imprimación gtfC-forward para apuntar al gen gtfC en el genoma de S. mutans WT >1 kb aguas abajo del gen y la imprimación spcr-reverse para apuntar a la región de flanqueo descendente de spcr en el S. mutans gt-fC . Ajuste la temperatura de fusión8 (Tm) de las imprimaciones gtfC-adelante y spcr-reverse para que coincidan con las temperaturas de fusión del gtfC-reverse y spcr- imprimaciones delanteras, respectivamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Diseñar imprimaciones anidadas (anidados hacia adelante y anidados) para el segundo PCR(figura 2B).</li>
		<li>Imprimaciones de diseño(gtfC-forward y colony-reverse) específicas para el ADN genómico del transformador(Figura 2C;los imprimadores se utilizan para la PCR de colonia). NOTA: Los amplicons se extienden por el borde entre gtfC y spcr. La imprimación gtfC-forward se puede aplicar como imprimación delantera.</li>
		<li>Imprimaciones de diseño (hacia arriba y hacia abajo) para la confirmación final de la generación de S. mutans His-gtfC (Figura 2C;el producto PCR amplificado por los imprimadores se utiliza para la secuenciación de ADN).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extracción de ADN genómico de S. mutans
NOTA: Cada cepa de S. mutans debe cultivarse en un medio de infusión del corazón cerebral (BHI) a 37 oC en condiciones anaeróbicas. Las cepas mutantes de S. mutans gtfC y S. mutans His-gtfC se cultivan en BHI complementado con 100 g/ml de espectromicina.
<ol><li>Streak S. mutans WT y S. mutans gtfC por separado en cada una de las placas de agar BHI. Incubarlos durante la noche a 37oC.</li>
	<li>Escoge colonias únicas de S. mutans WT o S. mutans ágtfC usando un palillo esterilizado e inocula en 1,5 ml de caldo BHI. Incubarlos durante la noche a 37oC. NOTA: Las colonias pueden utilizarse como fuente de ADN de plantilla para la primera PCR (paso 3.1).</li>
	<li>Transfiera 1 ml de cada cultivo bacteriano a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar la cultura durante 1 min a 15.000 x g.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y agregue 1 ml del tampón Tris-EDTA (pH 8.0) para resuspender el pellet celular.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión durante 1 min a 15.000 x g. Retire el sobrenadante. Resuspenda el gránulo celular en 50 ml de tampón Tris-EDTA (pH 8.0).</li>
	<li>Calentar la suspensión con una incubadora de bloques durante 5 min a 95 oC. Centrifugar la suspensión durante 5 min a 15.000 x g.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (el sobrenadante servirá como ADN de plantilla para la primera PCR).</li>
</ol>3. Amplificación de PCR
NOTA: El Cuadro 1, el Cuadro 2y el Cuadro 3 resumen los cuadros, reactivos y ciclos de amplificación de PCR, respectivamente.
<ol><li>Realice el primer PCR usando el genoma de S. mutans WT y S. mutans-gtfC como las plantillas de PCR. Amplificar las regiones que albergan la parte descendente del gen gtfC y las que albergan spcr utilizando las imprimaciones descritas en el paso 1.1.1.2(Figura 2A).</li>
	<li>Electroforrese cada producto de PCR en gel de agarosa al 1%. Exbobe los fragmentos de ADN deseados de aproximadamente 1.000 bp y 2.000 bp. Purifique los fragmentos de los geles utilizando el método de extracción de gel a base de membrana de sílice. NOTA: Los procedimientos básicos para PCR9,electroforesis de gel de ADN10y purificación de ADN11 se detallan en otros lugares.</li>
	<li>Realice un segundo PCR utilizando los productos de la primera PCR (aproximadamente equimolar) como plantillas de PCR con los imprimadores anidados hacia adelante y anidados inversos(Figura 2B).</li>
	<li>Electroforrese una décima parte de la mezcla de PCR en el gel de agarosa. Confirme la generación del amplicon apropiado de aproximadamente 3.000 bp.</li>
	<li>
Precipitar el producto PCR restante. NOTA: La purificación del producto PCR no es necesaria, ya que los amplicons no específicos generados por el segundo PCR no interfieren con la recombinación homóloga.<ol>
<li>Añadir agua libre de nucleasas a la mezcla de PCR y llevar el volumen total a 100 ml, seguido de 0,1 volumen (10 l) de acetato de sodio de 3 M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes (250 ml) de etanol absoluto. Mezclar y almacenar la mezcla durante 10 min a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Centrifugar la muestra durante 20 min a 15.000 x g a 4oC. Descarta el sobrenadante. Añadir 1 ml de 70% de etanol para lavar el pellet de ADN.</li>
		<li>Centrifugar la muestra durante 5 min a 15.000 x g a 4oC. Descarta el sobrenadante. Seca al aire y disuelve el pellet de ADN con 10 ml de agua libre de nucleasas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Transformación celular
<ol><li>Preparar s. mutans WT competente para introducir el segundo producto PCR siguiendo los pasos descritos en la publicación anterior5. Almacene las celdas a -80 oC. NOTA: Para este experimento, las células competentes de S. mutans WT ya se han conservado en -80 oC para generar S. mutans ágtfC.</li>
	<li>Mezclar 5 ml del segundo producto de PCR concentrado con la alícuota de 50 l de células competentes heladas con hielo y frío congeladas previamente. Añadir la mezcla en las cubetas de electroporación. Dar un solo pulso eléctrico (1,8 kV, 2,5 ms, 600 oC, 10 oF) a las células que utilicen el aparato de electroporación.</li>
	<li>Resuspenda las células en 500 ml de caldo BHI. Inmediatamente, esparza de 10 a 100 ml de la suspensión en placas de agar BHI que contengan espectromicina. Incubar las placas durante 2-6 días a 37 oC hasta que las colonias hayan crecido lo suficiente como para ser recogidas.</li>
</ol>5. Verificación de Genome Recombinación y almacenamiento
<ol><li>Realice la PCR de la colonia, usando los imprimadores gtfC-adelante y colony-reverse para detectar la recombinación. Electroforrese cada producto pcR de colonia en un gel de agarosa. Confirme el fragmento de ADN de aproximadamente 1.500 bp.</li>
	<li>Escoge una de las colonias positivas usando un palillo esterilizado y subcultiva las células durante la noche en 2 ml de caldo BHI que contiene espectromicina.</li>
	<li>Mezclar 0,8 ml de cultivo bacteriano con 0,8 ml de glicerol estéril al 50% y stock a -80 oC o -20 oC.</li>
	<li>Transfiera el 1 ml restante de suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita los pasos 2.3–2.7 para extraer el ADN genómico de las células.</li>
	<li>Realice PCR utilizando los imprimadores hacia arriba y hacia abajo y el ADN genómico como plantilla. Repita el paso 3.2 para purificar el producto de ADN amplificado de los geles.</li>
	<li>Determinar la secuencia de ADN del amplicon purificado mediante la secuenciación del ADN. NOTA: Asegúrese de confirmar la generación de S. mutans His-gtfC por secuenciación de ADN.</li>
</ol>6. Purificación de GTF-SI con etiqueta de polihistidina
<ol><li>Streak S. mutans His-gtfC en una placa de agar BHI que contiene espemicina. Incubarlos durante la noche a 37oC.</li>
	<li>Recoger una sola colonia utilizando un palillo de dientes esterilizado y células de subcultivo en 3 ml de caldo BHI. Incubar durante la noche a 37oC.</li>
	<li>Preparar dos matraces cónicos con 1 L de caldo BHI sin espectromicina. Inocular 1 ml de la suspensión de cultivo nocturno en 1 L del caldo BHI. Incubar durante la noche a 37oC.</li>
	<li>Concentrar las proteínas del sobrenadante del cultivo por precipitación de sulfato de amonio. NOTA: Extraiga de los cuerpos celulares si una proteína diana es intracelular. Los procedimientos básicos para la precipitación de sulfato de amonio se detallan en otros lugares12.<ol>
<li>Centrifugar la suspensión del cultivo bacteriano durante 20 min a 10.000 x g a 4 oC. Recuperar el sobrenadante de cultivo en un vaso de vidrio de 3 L.</li>
		<li>Añadir 1.122 g de sulfato de amonio a 2 L del sobrenadante (80% de saturación) con agitación vigorosa utilizando un agitador magnético. Dejar que el precipitado se forme durante 4 h o más a 4oC con agitación. NOTA: La formación precipitada se puede continuar durante la noche.</li>
		<li>Centrifugar la solución precipitada con sulfato de amonio a 15.000 x g durante 20 min a 4oC. Decantar al sobrenadante.</li>
		<li>Recoger el precipitado con una espátula y transferir en un vaso de vidrio de 200 ml. Resuspender los pellets en 35 ml de tampón de unión (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM imidazol, pH 8.0).</li>
		<li>Dializar la suspensión contra 2.500 ml del tampón de unión utilizando un tubo de diálisis de celulosa regenerada, a 4 oC, con agitación. Reemplace la solución de diálisis después de 2 h y continúe la diálisis durante la noche.</li>
		<li>Vuelva a colocar la solución de diálisis. Continúe dialize durante 2 h adicionales.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugar la suspensión dializada a 20.000 x g durante 10 min a 4oC. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de membrana utilizando un equipo de filtración por succión. Transfiera el filtrado a un matraz de 75 cm2.</li>
	<li>Fracciona el GTF-SI etiquetado con polihistidina de la suspensión filtrada por cromatografía de afinidad de metal inmovilizada (IMAC).
	<ol>
<li>Transfiera 2 ml de la suspensión de resina IMAC cargada con Ni (aproximadamente 1 ml de resina) a una columna cromatográfica cuya salida esté instalada en un tubo de silicona. Retire la solución de almacenamiento por el flujo de gravedad. PRECAUCION: No deje que la resina se seque a lo largo del IMAC.</li>
		<li>Añadir 3 ml de agua destilada en la columna para lavar la resina. Agregue 5 ml del búfer de unión para equilibrar la resina.</li>
		<li>Apaga el flujo con una polla de pizca Hoffmann. Agregue 5 ml de la suspensión filtrada del paso 6.5 para hacer la suspensión.</li>
		<li>Agregue toda la suspensión al resto de la suspensión filtrada. Gire suavemente la mezcla durante 30 minutos a 4 oC.</li>
		<li>Vuelva a cargar la mezcla en la columna. Retire la suspensión por el flujo de gravedad. Lave la resina IMAC con 20 ml de tampón de unión. NOTA: Ajuste el caudal a aproximadamente 2 ml/min con un pellizco Hoffmann a lo largo de la IMAC posterior.</li>
		<li>Elule el GTF-SI recombinante con 20 mL del tampón de elución (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8.0). NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. El eluido debe almacenarse a 4oC. La resina IMAC se puede reutilizar. Consulte las instrucciones para la resina IMAC.</li>
	</ol></li>
	<li>Sustituya el búfer de elución por el búfer de almacenamiento (buffer de fosfato de 50 mM, pH 6.5) y concentre la solución GTF-SI recombinante a aproximadamente 1 ml utilizando una unidad de ultrafiltración centrífuga. Almacene la solución recombinante de GTF-SI a 4 oC. NOTA: Confirme la purificación GTF-SI etiquetada con polihistidina utilizando SDS-PAGE13 y la hincha occidental14 empleando un anticuerpo monoclonal antipolihistidina conperoxidasa de rábano picante. Adición de CHAPS (concentración final, 0,1%) al eluyente puede ser necesario para evitar la adsorción inespecífica a la unidad, dependiendo de la proteína objetivo.</li>
</ol>7. Restauración funcional por GTF-SI recombinante
<ol><li>Raya cada cepa de S. mutansobre una placa de agar BHI individualmente. Incubar las placas durante la noche a 37oC.</li>
	<li>Usando un palillo de dientes esterilizado, recoger una sola colonia para inocular en 2 ml de caldo BHI. Incubar durante la noche a 37oC.</li>
	<li>Utilice 20 ml del cultivo nocturno de S. mutans ágtfC para inocular 2 ml de caldo BHI que contenga 1% de sacarosa sin antibióticos en un tubo de ensayo de vidrio. Agregue el GTF-SI o un volumen equivalente del vehículo al cultivo de S. mutans ágtfC, y el cultivo de las células con el tubo colocado en una posición inclinada durante la noche. NOTA: Esterilice la solución GTF-SI con un filtro de jeringa estéril y determine la concentración de proteínas utilizando un ensayo de proteína de ácido bicincino15 antes de su uso.</li>
	<li>Agitar las suspensiones de cultivo con un mezclador de vórtice para 10 s. Decantar las suspensiones. Lave los tubos de ensayo con una cantidad suficiente de agua destilada.</li>
	<li>Mancha las biopelículas en la pared del tubo con 1 ml de 0,25% Coomassie azul brillante (CBB).</li>
	<li>Decantar la solución de tinción después de 1 min. Lavar los tubos de ensayo con una cantidad suficiente de agua destilada. Seque al aire los tubos de ensayo.</li>
</ol>

<ol><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+3rd+Edition%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
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<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
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<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El diseño de imprimadores es el paso más crítico en el protocolo. Las secuencias de las imprimaciones gtfC-reverse y spcr-forward se determinaron automáticamente en función de las secuencias de la región final de 3o de gtfC y de la región final de 5o de spcr. Cada imprimación incluye 24 bases complementarias que codifican un vinculador GS y una secuencia de codificación His-tag en sus regiones de 5'. La interrupción de las secuencias reglamentarias nativas ubicada...

El análisis de la función de un gen generalmente implica la comparación de rasgos fenotípicos de cepas de tipo salvaje con cepas en las que el gen de interés se ha interrumpido. Una vez producida la cepa interrumpida por genes, la adición exógena del producto genético permite la restauración funcional.
El método más común para obtener productos genéticos purificados necesarios para ensayos de restauración posteriores es mediante la realización de expresiones hetólogas en Escherichia coli1. Sin embargo, la expresión de proteínas de membrana o proteínas de alta masa molecular es a menudo difícil utilizando este sistema1. En estos casos, la proteína diana generalmente se aísla de las células que sintetiza la proteína de forma nativa a través de una serie compleja de pasos, que pueden conducir a la pérdida del producto genético. Para superar estos problemas, se ha desarrollado un procedimiento sencillo para la purificación de productos genéticos siguiendo un método de interrupción genética2,el método de empalme de ADN basado en PCR3 (designado PCR de fusión en dos pasos) y la electroporación para la genética transformación en Streptococcus mutans. La adición de una etiqueta de polihistidina (su etiqueta) a la terminal C del producto genético facilita su purificación mediante cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC).
Para aislar la cepa que expresa su etiqueta, todo el ADN genómico del gen de interés (en esta cepa interrumpida genéticamente his-tag-expressing) se reemplaza por un gen marcador resistente a los antibióticos. El procedimiento para generar la cepa His-tag-expressing es casi idéntico al de generar una cepa interrumpida genéticamente como se describió anteriormente4,5. Por lo tanto, los métodos para la interrupción genética y el aislamiento de productos genéticos deben realizarse como experimentos en serie para el análisis funcional.
En el presente trabajo, se adjunta una secuencia de codificación de polihistidina al extremo de 3o del gen gtfC (GenBank locus tag SMU_1005), codificando glucosiltransferasa-SI (GTF-SI) en S. mutans6. Luego, se realizaron estudios de expresión en una especie estreptocócica. Lograr la expresión heterotróloga de gtfC por E. coli es difícil, probablemente debido a la alta masa molecular de GTF-SI. Esta variedad se llama S. mutans His-gtfC. Una ilustración esquemática que representa la organización del casete genético de resistencia a gtfC y espectromicina (spcr)7 loci en sándalo S. mutans (S. mutans WT) y sus derivados se muestra en Figura 1. El GTF-SI es una proteína secretor que contribuye al desarrollo de biofilm dental cariogénico6. Bajo la presencia de sacarosa, se observa una biopelícula adherente en una superficie de vidrio liso en la cepa WT S. mutans pero no en la cepa interrumpida de S. mutans gtfC(S. mutans ágtfC)2,5 . La formación de biopelículas se restaura en S. mutans ágtfC tras la adición exógena del GTF-SI recombinante. La cepa, S. mutans His-gtfC, se utiliza para producir el GTF-SI recombinante.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Nippon Genetics</td><td>NE-AG02</td><td>Para electroforesis en gel de agarosa</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>Sistema de cultivo anaeróbico</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal Anti-His-Tag</td><td>MBL</td><td>D291-7 Kit de ensayo de</td> proteínas BCA <td>conjugadas con HRP</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td>Medición de la concentración</td></tr> <tr><td>de proteínasCaldo de infusión cerebro-corazón</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Medio de cultivo bacteriano</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>Para tinción de biopelícula</td></tr><tr><td>Unidad de ultrafiltración centrífuga</td><td>Sartorius</td><td>VS2032</td><td>Reemplazo de tampón y concentración de proteínas</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Kubota</td><td>7780II</td><td></td></tr><tr><td>Columna cromatográfica</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>Para IMAC</td></tr><tr><td>Pinza de membrana de diálisis</td><td>Marca Fisher</td><td>21-153-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálisis</td><td>As One</td><td>2-316-06</td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>ADN polimerasa de alta fidelidad</td></tr><tr><td>Secuenciación de ADN</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sustrato ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5060</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>Wako</td><td>311-90075</td><td>Preparación de tampón Tris-EDTA</td></tr><tr><td>Cubeta de electroporación</td><td>Bio-Rad</td><td>1652086</td><td>0,2 cm de espacio</td></tr><tr><td>Electroporador</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>EtBr solución</td><td>Nippon Gene</td><td>315-90051</td><td>Para electroforesis de gel de agarosa</td></tr><tr><td>Cortador de banda de gel</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Gel kit de extracción</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>Extracción de ADN a partir de gel de agarosa</td></tr><tr><td>Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>29083461</td><td>Para SDS-PAGE y Western blot</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Wako</td><td>095-00015</td><td>Tampón de unión y preparación de tampón de elución</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Nippon Medical & Instrumentos químicos</td><td>EZ-022</td><td>Ajuste de temperatura: 4 & grados; </td></tr><tr><td>C Incubadora</td><td>Nippon Medical & Instrumentos químicos</td><td>LH-100-RDS Ajuste de</td><td>temperatura: 37 & grados; C</td></tr><tr><td>Filtro de membrana</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td>0.2 &micro; m diámetro</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Kubota</td><td>3740</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>Preparación de tampón de unión y tampón de elución</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Wako</td><td>192-02815</td><td>Preparación de tampón de unión y tampón de elución</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td>Preparación de tampón de unión y tampón de elución</td></tr> <tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Wako</td><td>015-06737</td><td>Precipitación de sulfato de amonio Resina</td></tr><tr><td>cargada de Ni,</td><td>Bio-Rad</td><td>1560133</td><td>Para IMAC</td></tr><tr><td>Imprimaciones de PCR</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Estándar de proteínas pedido</td><td></td>a medida</tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>161-0381</td><td>Para SDS-PAGE y Western blot</td></tr><tr><td>Aparatos de filtración de disolventes</td><td>Como uno</td><td>FH-1G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antibióticos; uso a 100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa estéril</td><td>Merckmillipore</td><td>SLGV004SL</td><td>0.22 &micro; m de diámetro</td></tr><tr><td>Streptococus mutans &#916; gtfC</td><td>Cepa de stock en el laboratorio.</td><td></td><td>gtfC reemplazado por spcr</em</td></tr><tr><td>>Streptococus mutans UA159</td><td>Cepa de stock en el laboratorio.</td><td></td><td>S. mutans ATCC 700610, Cepa silvestre</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>Para el desarrollo de biopelículas</td></tr><tr><td>TAE (50 y veces; )</td><td>Nippon Gene</td><td>313-90035</td><td>Para electroforesis en gel de agarosa</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>Wako</td><td>314-90065</td><td>Preparación del tampón Tris-EDTA</td></tr></tbody></table>

purificación de una proteína de masa molecular alta en streptococcus mutans

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

El esclarecimiento de la función de un gen típicamente implica la comparación de rasgos fenotípicos de cepas y cepas de tipo salvaje en las que el gen de interés se ha interrumpido. La pérdida de la función después de la interrupción del gen se restaura posteriormente mediante la adición exógena del producto del gen alterado. Esto ayuda a determinar la función del gen. Un método descrito anteriormente implica la generación de una cepa de Streptococcus mutans interrumpida por el gen gtfC. Aquí, se describe un método poco exigente para purificar el producto del gen gtfC de la cepa s. mutans recién generada después de la interrupción del gen. Implica la adición de una secuencia de codificación de polihistidina en el extremo de 3o del gen de interés, que permite una simple purificación del producto genético mediante cromatografía de afinidad de metalinmovilizado. No se requieren reacciones enzimáticas que no sean PCR para la modificación genética en este método. La restauración del producto genético por adición exógena después de la interrupción del gen es un método eficaz para determinar la función génica, que también puede adaptarse a diferentes especies.

El cuadro 3 muestra el tamaño de cada amplicon del primer PCR(figura 3A)y del segundo PCR(figura 3B). El tamaño de cada amplificador correspondió al tamaño pronosticado, como se describe en el Cuadro 1. La Figura 4A muestra las colonias de S. mutans transformadas con el segundo producto PCR y chapadas en las placas de agar BHI que contienen espe...

Aquí se describe un método simple para la purificación de un producto genético en Streptococcus mutans. Esta técnica puede ser ventajosa en la purificación de proteínas, especialmente proteínas de membrana y proteínas de alta masa molecular, y se puede utilizar con varias otras especies bacterianas.

Purificación de una proteína de masa molecular alta en Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, tales como, cómo un producto genético que es difícil de expresar en E. coli purifica. Las principales ventajas de esta técnica son que ninguna reacción enzimática, aparte de la PCR, es el portador, y se pueden utilizar aplicaciones comunes para la purificación de proteínas. Aunque este método puede proporcionar información sobre la purificación de proteínas en estreptococos mutanos, también puede ser un informado de otras especies de microbiota.Demostrando el procedimiento estará el Dr.Mamiko Yamashita, un estudiante de posgrado de nuestro laboratorio. Después del diseño de imprimación y la extracción de ADN genómico de estreptococos mutans, realice la primera PCR utilizando el estreptococo mutans de tipo salvaje y GFC interrumpió el estreptococo mutan genoma como las plantillas de PCR. Amplificar las regiones que albergan la parte aguas abajo del gen gtfC y las que albergan el gen de resistencia a la espectinomicina utilizando la imprimación gtfC hacia adelante y hacia atrás preparada y la imprimación r-forward y reverse de 200.A continuación, electrofores y cada producto PCR en gel de 1% de agarosa. Utilice un cortador de bandas de gel para extirpar los fragmentos de ADN deseados de aproximadamente 1.000 pares de bases y 2.000 pares de bases del gel en tubos de microcentrífuga. Añadir 500 microlitros de tampón solubilizante en cada tubo e incubarlos durante 10 minutos a 56 grados Celsius para disolver las rodajas de gel.Purificar los fragmentos utilizando el método de extracción de gel a base de membrana de sílice. Realice un segundo PCR utilizando los productos del primer PCR como plantillas de PCR con las imprimaciones anidadas hacia adelante y anóteles.reverse. Cuando el segundo producto PCR no puede ser confirmado por electroforesis, se debe diseñar otro par de imprimación anidada.electroforos cinco microlitros de la mezcla de PCR en el gel de agarosa. Confirme la generación del amplicon adecuado de aproximadamente 3.000 pares base mediante la imagen de tinción de gel de bromuro de etidio y proceda según el manuscrito. Ahora, mezcle cinco microlitros del segundo producto PCR concentrado en la aloculinación de 50 microlitros de células de estreptococo mutan de tipo silvestre competentes, congeladas previamente.Agregue la mezcla en una cubeta de electroporación y coloque la cubeta en la cámara de la cubeta del aparato de electroporación. Dar un solo pulso eléctrico de 1,8 kilovoltas, 600 ohmios y 10 microfaradios durante 2,5 milisegundos a las células. Agregue 500 microlitros de caldo de infusión cerebro-corazón en la cubeta.Extienda inmediatamente de 10 a 100 microlitros de la suspensión sobre placas de sinfín de infusión cerebral-corazón que contienen espectinomicina. Incubar las placas durante dos a seis días a 37 grados centígrados hasta que las colonias hayan crecido lo suficiente como para ser recogidas. Después de la generación de secuencia de codificación de polihistidina estreptococo muta incorporada cepa y inoculación durante la noche sin espectinomicina según el manuscrito, centrifugar la suspensión de cultivo bacteriano durante 20 minutos a 10.000 veces g a cuatro grados centígrados.Transfiera el sobrenadante de cultivo en un vaso de vidrio de tres litros. Para concentrar las proteínas del sobrenadante de cultivo, coloque el sobrenadante de dos litros en un agitador magnético y comience a agitar vigorosamente. Añadir 1, 122 gramos de sulfato de amonio y dejar que el precipitado se forme con agitación vigorosa a cuatro grados centígrados durante un período de cuatro horas o durante la noche. próximo.centrifugar la solución precipitada de sulfato de amonio a 15.000 veces g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante. Con una espátula, recoger el precipitado y transferirlo a un vaso de vidrio de 200 mililitros.Resuspender los pellets en 35 mililitros de tampón de unión. A continuación, transfiera cada uno aproximadamente 25 mililitros de la suspensión a un tubo de diálisis de celulosa regenerado. Coloque el tubo de diálisis en 2,5 litros del tampón de unión de agitación en un agitador a cuatro grados centígrados para marcar la suspensión.Reemplace la solución de diálisis después de dos horas y continúe la diálisis durante la noche. A continuación, transfiera la suspensión dializada del tubo a los tubos centrífugos y coloque los tubos en la centrífuga a 20.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Con el equipo de filtración de sección, vierta el sobrenadante sobre un filtro de membrana de 0,2 micrómetros para filtrar.Transfiera el filtrado a un matraz de 75 mililitros. Para fraccionar el gtfSI con etiqueta de polihistidina de la suspensión filtrada, primero prepare una cromatografía de afinidad metálica inmovilizada. Después de equilibrar la resina según el manuscrito, cierre la polla de pellizcar Hoffman.Agregue cinco mililitros de la suspensión filtrada en la columna para hacer una suspensión. A continuación, transfiera toda la suspensión a la suspensión filtrada restante y gire suavemente la mezcla durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a cargar la mezcla en la columna.Abra la polla de pellizcar Hoffman para quitar la suspensión por el flujo de gravedad. Lave la resina IMAC con 20 mililitros de tampón de unión y luego, elulice 20 mililitros de tampón de elución para obtener el gtfSI recombinante. Después de eso, cargue el eluido en un tubo de ultrafiltración centrífuga y centrifugar la solución a 2.000 veces g durante uno a cinco minutos para concentrar la solución.Vacíe el envase del filtrado y agregue 15 mililitros de tampón de almacenamiento en el tubo. Centrifugar la muestra de nuevo y repita el proceso dos veces adicionales. La solución gtfSI recombinante finalmente se concentra en aproximadamente un mililitro.Transfiera el concentrado a un tubo de microcentrífuga y guárdelo a cuatro grados centígrados. Continúe con el protocolo de restauración funcional del resto. En este protocolo, la electroforesis de gel de agarosa muestra que el tamaño de cada amplicon del primer PCR y el segundo PCR correspondía con el tamaño previsto.Las colonias de Streptococcus mutans se transformaron con el segundo producto PCR y se encasinaron en las placas de sinfín de infusión cerebro-corazón que contienen espectinomicina. Los productos de PCR de colonia se ejecutan en el gel de agarosa muestra que cada amplicon era del tamaño pronosticado. La proteína purificada con cromatografía de afinidad de metal inmovilizado se observó como una sola banda por SDS-PAGE.Western blot, realizada con el anticuerpo anti-polihistidina, confirmó que la banda observada era la proteína etiquetada con polihistidina esperada de 160 kilodaltons. La capacidad de formación de biopelículas derivada de la sacarosa sólo se vio con estreptococos mutans de tipo salvaje y estreptococo muta Su-gtfC, que formó una biopelícula adherente en la pared del tubo en presencia de 1%sacarosa. Esto no se observó en estreptococo mutans delta gtfC.Sin embargo, la adición de 25 microgramos del gtfSI recombinante restauró la capacidad de formación de biopelículas adherentes en estreptococo mutans delta gtfC. Dado que el éxito de este método depende de la segunda amplificación de PCR, el segundo producto PCR debe ser confirmado por electroforesis. Ya, la proteína de tipo histidina obtenida por este método también se está reuniendo a los ácidos funcionales, como las interacciones proteína-proteína.Después de su desarrollo, esta técnica, en combinación con la alteración de genes, allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploraran la función génica.

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Membrana-COLUMNA: una herramienta bioquímica para identificar las interacciones proteína-proteína de Proteínas de la Membrana En Vivo

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De un solo paso de purificación de proteínas etiquetadas-Twin-Strep y sus complejos de Strep-Tactin resina reticulado con Bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3)

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